针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)的抗原结合蛋白的制作方法

针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(pcsk9)的抗原结合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明阐述了与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(PCSK9)相互作用的抗原结合蛋白。阐述了通过给予药物有效量的针对PCSK9的抗原结合蛋白治疗高胆固醇血症及其它疾病的方法。阐述了用针对PCSK9的抗原结合蛋白检测样品中PCSK9的量的方法。
【专利说明】针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN9型（PCSK9)的抗 原结合蛋白
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年8月22日，申请号为 200880113475. 4(PCT/US2008/074097)，发明名称为"针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶 kexin9型（PCSK9)的抗原结合蛋白"。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求享有于2007年8月23日提交的美国临时申请顺序号60/957, 668、于 2007年12月21日提交的美国临时申请顺序号61/008, 965及于2008年1月9日提交的美 国临时申请顺序号61/010, 630的优先权，它们以其整体在此引作参考。 发明领域
[0004] 本发明涉及结合前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型（Proprotein convertase subtilisin kexin type9, PCSK9)的抗原结合蛋白及使用和制备所述抗原 结合蛋白的方法。本申请连同电子格式的序列表一起提交。所提供的序列表文件名为 APM0L-003A.txt，于2008年8月12日创建，且大小为296,639字节，其被更新为文件名为 APM0L-003A_Substitute. TXT的文件，该文件于2010年10月11日星期二创建且大小为 297, 239字节。该电子格式的序列表中的信息以其全部内容通过引用结合到本文中。
[0005] 各种实施方案背景
[0006] 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型（PCSK9)是丝氨酸蛋白酶，其参与调节 低密度脂蛋白受体（LDLR)蛋白的水平（Horton等，2007 ;Seidah和Prat，2007)。体外实 验显示将PCSK9加到H印G2细胞能降低细胞表面LDLR水平（Benjannet等，2004 ;Lagace 等，2006 ;Maxwell等，2005 ;Park等，2004)。对小鼠的实验显示，提高PCSK9蛋白水平能降 低肝脏 LDLR 蛋白水平（Benjannet 等，2004 ;Lagace 等，2006 ;Maxwell 等，2005 ;Park 等， 2004)，同时PCSK9敲除小鼠提高肝脏中LDLR水平（Rashid等，2005)。另外，业已鉴定了提 高或降低血浆LDL水平的各种人PCSK9突变（Kotowski等，2006 ;Zhao等，2006)。业已显 示PCSK9直接与LDLR蛋白作用，与LDLR -起被吞噬，在整个内体途径中与LDLR共发生免 疫荧光（Lagace等，2006)。尚未观察到PCSK9降解LDLR，且未确定其降低胞外LDLR蛋白水 平的机制。
[0007] PCSK9是丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶（S8)家族中的激素原-前蛋白转化 酶（Seidah等，2003)。人类有9种激素原-前蛋白转化酶，可将其分为S8A和S8B亚家族 (Rawlings 等，2006)。弗林蛋白酶、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6 和 PC7/PC8/LPC/ SPC7被分在亚家族S8B中。来自鼠弗林蛋白酶和PCl的不同结构域的晶体结构及NMR结构 显示了枯草杆菌蛋白酶样前域（pro-domain)及催化结构域，并且P结构域（P domain)直 接位于催化结构域的C-末端（Henrich等，2003 Jangrea等，2002)。基于该亚家族内的氨 基酸序列的相似性，预测所有7个成员都具有相似的结构（Henrich等，2005)。SKI-1/S1P 和PCSK9被分在亚家族S8A中。这些蛋白之间的序列比较也提示存在枯草杆菌蛋白酶样前 域及催化结构域（Sakai等，1998 ;Seidah等，2003 ;Seidah等，1999)。在这些蛋白中，位于 催化结构域的C-末端的氨基酸序列更易变，且未提示存在P结构域。
[0008] 激素原-前蛋白转化酶作为酶原表达，它们经过多个步骤加工成熟。在该加工中 前域的功能是双重的。前域首先起分子伴侣作用，为催化结构域的适当折叠所需（Ikemura 等，1987)。当催化结构域折叠后，在前域和催化结构域之间发生自身催化。在该初次裂解 反应后，前域仍然与催化结构域结合，然后其起着催化活性抑制物的作用（Fu等，2000)。当 条件恰当时，在前域内的位点处因第二次自身催化事件继续成熟（Anderson等，1997)。在 该第二次裂解事件发生后，前域和催化结构域分离，成为活性蛋白酶。
[0009] PCSK9 酶原的自身催化发生在 Glnl52 和 Serl53 (VFAQI SIP)之间（Naureckiene 等，2003)，业已显示为其从细胞分泌所需（Seidah等，2003)。尚未观察到在PCSK9前域内 位点处的第二自身催化事件。纯化的PCSK9由两部分构成，它们可通过非还原性SDS-PAGE 分开；为17Kd的前域和为65Kd的催化结构域加上C-末端结构域。尚未分离到没有其抑制 性前域的PCSK9, PCSK9的催化活性的测量值一直是不定的（Naureckiene等，2003 ;Seidah 等，2003)。
[0010] 各种实施方案概述
[0011] 在某些实施方案中，本发明包括针对PCSK9的抗原结合蛋白。
[0012] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，其包含：A)选自以 下的一个或多个重链互补决定区（CDRH) :(i)来自选自以下的序列中的CDRHl的CDRHl : SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、 79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; (ii)来自选自以下的序列中的 CDRH2 的 CDRH2 :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、 76、77、78、83、69、81和60 ;(iii)来自选自以下的序列中的CDRH3的CDRH3:SEQIDN0:74、 85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、 78、83、69、81和60;和（^)含有一处或多处不超过4个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插 入的⑴、（ii)和（iii)的CDRH ;B)选自以下的一个或多个轻链互补决定区（CDRL):⑴ 来自选自以下的序列中的 CDRLl 的 CDRLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ;(ii)来自选自以 下的序列中的 CDRL2 的 CDRL2 :SEQIDN0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;(1^)来自选自以下的序列中的 CDRL3 的CDRL3 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、 31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;和（^)含有一处或多处不超过4个氨基酸的 氨基酸取代、缺失或插入的（i)、（ii)和（iii)的CDRL;或C) 一个或多个A)的重链CDRH 和一个或多个B)的轻链⑶RL。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含至少一个A) 的CDRH和至少一个B)的CDRL。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含至少两个A) 的CDRH和至少两个B)的CDRL。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含所述CDRH1、 CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。在某些实施方案中，A)的CDRH选自以下至少一种： ⑴选自选自SEQ ID NO:67、79、89和49的序列中的CDRHl的CDRHl氨基酸序列；（ii)选 自选自SEQ ID N0:67、79、89和49的序列中的CDRH2的CDRH2氨基酸序列；（iii)选自选自 SEQ ID N0:67、79、89和49的序列中的CDRH3的CDRH3氨基酸序列；和（iv)含有一处或多 处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的和（iii)的CDRH。另外，B)的 CDRL选自以下至少一种：⑴选自选自SEQIDN0:12、35、32和23的序列中的CDRL1的CDRL1 氨基酸序列；（ii)选自选自SEQIDN0:12、35、32和23的序列中的CDRL2的CDRL2氨基酸序 列 ；（iii)选自选自SEQIDN0:12、35、32和23的序列中的CDRL3的CDRL3氨基酸序列 ；和 (iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的和（iii)的 ⑶RL;或C) 一个或多个A)的重链⑶RH和一个或多个B)的轻链⑶RL。在某些实施方案中， A)的⑶RH选自以下至少一种：（i) SEQ ID NO: 67中的⑶RHl氨基酸序列的⑶RHl氨基酸序 列；（ii)SEQIDN0:67中的CDRH2氨基酸序列的CDRH2氨基酸序列 ；（iii)SEQIDN0:67中 的CDRH3氨基酸序列的CDRH3氨基酸序列；和（iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨 基酸取代、缺失或插入的（i)、（ii)和（iii)的CDRH ;所述B)的CDRL选自以下至少一种： (i) SEQIDN0:12中的CDRLl氨基酸序列的CDRLl氨基酸序列；（ii) SEQ ID NO: 12中的CDRL2 氨基酸序列的⑶RL2氨基酸序列；（iii)SEQ ID N0:12中的⑶RL3氨基酸序列的⑶RL3氨基 酸序列；和（iv)含有一处或多处不超过2个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的 和（iii)的⑶RL;或C) 一个或多个A)的重链⑶RH和一个或多个B)的轻链⑶RL。在某 些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含：A) SEQ ID NO: 67中的CDRHl序列的CDRHl、SEQ ID NO: 67 中的 CDRH2 序列的 CDRH2 和 SEQ ID NO: 67 中的 CDRH3 序列的 CDRH3 ;和 B) SEQ ID NO: 12 中的 CDRLl 序列的 CDRLl、SEQ ID NO: 12 中的 CDRL2 序列的 CDRL2 和 SEQ ID NO: 12 中的CDRL3序列的CDRL3。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含：具有与选自以下的氨基 酸序列至少80%序列同一性的重链可变区（VH) :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、 51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;和 / 或 具有与选自以下的氨基酸序列至少80%序列同一性的轻链可变区（VL) :SEQ ID N0:5、7、 9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、 42、44和46。在某些实施方案中，VH与选自以下的氨基酸序列具有至少90%序列同一性： SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、47、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、 79、80、76、77、78、83、69、81和60 ;和/或VL与选自以下的氨基酸序列具有至少90%序列 同一性：SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、 33、35、36、37、38、39、40、42、44和46。在某些实施方案中，VH选自SEQIDN0:74、85、71、72、 67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;和 / 或 VL 选自 SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、 28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46。
[0013] 在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白，其特异性结合被本文公开的任何 ABP结合的表位。
[0014] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合 蛋白包含：A) -个或多个选自以下至少一种的重链CDR(CDRH) :(i)具有与选自以下的序 列之一中的 CDRHl 至少 80%序列同一性的 CDRHl :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、 51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;(ii) 具有与选自以下的序列之一中的⑶RH2至少80%序列同一性的⑶RH2:SEQ ID N0:74、 85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、 78、83、69、81和60;和（丨^)具有与选自以下的序列之一中的^冊3至少80%序列同一 性的 CDRH3:SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、 64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81和60 ;B) -个或多个选自以下至少一种的轻链 ⑶R(⑶RL) :(i)具有与选自以下的序列之一中的⑶RLl至少80%序列同一性的⑶RLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、 37、38、39、40、42、44和46 ; (ii)具有与选自以下的序列之一中的CDRL2至少80 %序列同一 性的CDRL2 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、 32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46 ;和（iii)具有与选自以下的序列之一中的CDRL3 至少 80%序列同一性的 CDRL3 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ;或 C) 一个或多个 A)的重链 ⑶RH和一个或多个B)的轻链⑶RL。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含：A) -个或多个 选自以下至少一种的⑶RH : (i)具有与选自以下的序列之一中的⑶RHl至少90%序列同一 性的CDRHl :SEQ ID N0:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、 62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; (ii)具有与选自以下的序列之一中的 CDRH2 至少 90%序列同一性的 CDRH2 :SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、 56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ;和（iii)具有与选自以 下的序列之一中的CDRH3至少90%序列同一性的CDRH3 :SEQ ID NO:74、85、71、72、67、87、 58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81 和 60 ; B) -个或多个选自以下至少一种的CDRL : (i)具有与选自以下的序列之一中的CDRLl至少 90%序列同一性的CDRLl :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44和46;(^)具有与选自以下的序列之一中 的 CDRL2 至少90%序列同一性的 CDRL2 :SEQ ID N0:5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ;和（iii)具有与选自 以下的序列之一中的CDRL3至少90%序列同一性的CDRL3:SEQIDN0 :5、7、9、10、12、13、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44 和 46 ; 或C) 一个或多个A)的重链⑶RH和一个或多个B)的轻链⑶RL。
[0015] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区（CDRH) :(i)选自以下序列内的CDRH3的 CDRH3:SEQ ID N0:67、79和49;(ii)在氨基酸序列上与⑴的CDRH3差别在于不超过2 个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3 ;和（iiDXAXAXAXAXgXJuXJdJSE Q ID N0:404)，其中X1选自D、A、R和非氨基酸；X2选自Y、I、G和非氨基酸；X 3选自D、A、G 和非氨基酸；X4选自F、A、L和非氨基酸；X5选自W、L、A和非氨基酸；X6选自S、Y、A和非氨 基酸；X 7选自A、Y、R和非氨基酸；X8选自Y、P和非氨基酸；X9选自Y、G和非氨基酸；X ltl选 自D、G和非氨基酸；X11选自A、M和非氨基酸；X12选自F、D和非氨基酸；X 13选自D、V和非 氨基酸；X14选自V和非氨基酸；B)选自以下至少一种的轻链互补决定区（CDRL) : (i)选自 选自以下序列内的CDRL3的CDRL3:SEQ ID勵：12、35和23;出）在氨基酸序列上与（1) 的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3 ;和（iii)选自 X1X2X3X4X5X 6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO:405)的 CDRL3 氨基酸序列，其中 X1 选自 Q 和 G ;X2 选自 S、T、A和非氨基酸；X3选自Y、非氨基酸和W ;X4选自D和非氨基酸；X5选自S和非氨基酸； X6选自S和非氨基酸；X7选自L、T和非氨基酸；X8选自非氨基酸、A和S ;X9选自非氨基酸、 G、A和V ;X1(I选自非氨基酸、S、Y和V ;Xn选自非氨基酸和V。
[0016] 在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白，所述分离的抗原结合蛋白包含具 有选自以下的氨基酸序列的轻链：5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、 28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44、46 及其某些组合。
[0017] 在某些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合被本文公开的抗原结合蛋白中的至 少一种结合的表位。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白进一步包含具有选自以下的 氨基酸序列的重链：74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、 89、65、79、80、76、77、78、83、69、81、60及其某些组合。在某些实施方案中，八8?的氨基酸序 列选自SEQ ID N0:12、35、23及其某些组合。在某些实施方案中，ABP的重链包含SEQ ID NO:67 的 CDRH3、SEQ ID NO:67 的 CDRH2 和 SEQ ID NO:67 的 CDRHl，所述轻链包含 SEQ ID N0:12的CDRL3、SEQIDN0:12的CDRL2和SEQIDN0:12的CDRL1。在某些实施方案中，分 离的抗原结合蛋白为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、 多特异性抗体或其抗体片段。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为Fab片段、Fab'片 段、F(ab'） 2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋 白为人抗体。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为单克隆抗体。在某些实施方案中， 分离的抗原结合蛋白为IgGl型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在某些实施方案中，分离的 抗原结合蛋白为IgG4型或IgG2型。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白与标记基团 偶联。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白与本文所述抗原结合蛋白竞争结合PCSK9。 在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人 源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋 白为Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。在某些实施方 案中，分离的抗原结合蛋白与标记基团偶联。在某些实施方案中，分离的抗原结合蛋白降低 PCSK9与LDLR的结合。在某些实施方案中，当将分离的抗原结合蛋白给予受治疗者时，其降 低受治疗者中存在的LDL的量。在某些实施方案中，当将分离的抗原结合蛋白给予受治疗 者时，其降低受治疗者中存在的血清胆固醇的量。在某些实施方案中，当将分离的抗原结合 蛋白给予受治疗者时，其降低受治疗者中存在的LDLR的量。
[0018] 在某些方面，本发明包括载体，所述载体包含本文所述核酸分子。在某些实施方案 中,本发明包括宿主细胞,所述宿主细胞包含本文所述核酸分子。
[0019] 在某些方面，本发明包括与本文公开的抗原结合蛋白竞争结合PCSK9的分离的抗 原结合蛋白。
[0020] 在某些方面，本发明包括编码本文公开的抗原结合蛋白的核酸分子。
[0021] 在某些方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本文所述的 抗原结合蛋白。
[0022] 在某些方面，本发明包括用于治疗或预防患者中的与高血清胆固醇水平有关的病 症的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合 蛋白。
[0023] 在某些方面，本发明包括在受治疗者中抑制PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法 包括给予有效量的至少一种本文公开的抗原结合蛋白。
[0024] 在某些方面，本发明包括选择性结合PCSK9的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合 蛋白以小于IOOpM的K d结合PCSK9。
[0025] 在某些方面，本发明包括用于治疗或预防受治疗者中的与高血清胆固醇水平有关 的病症的方法，所述方法包括同时或序贯地将有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结 合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予有需要的受治疗者。
[0026] 在某些方面，本发明包括降低受治疗者中的血清胆固醇水平的方法，所述方法包 括给予受治疗者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白。
[0027] 在某些方面，本发明包括降低受治疗者中的血清胆固醇水平的方法，所述方法包 括同时或序贯地将有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的 利用率的药剂给予受治疗者。
[0028] 在某些方面，本发明包括提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法包括 给予受治疗者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白。
[0029] 在某些方面，本发明包括提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法包括 同时或序贯地将有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利 用率的药剂给予受治疗者。
[0030] 在某些方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的ABP和 提高LDLR蛋白水平的利用率的药剂。在某些实施方案中，提高LDLR蛋白的利用率的 药剂包括他汀（statin)。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀（atorvastatin)、 西立伐他汀（cerivastatin)、氟伐他汀（fluvastatin)、洛伐他汀（Iovastatin)、美伐 他汀（mevastatin)、匹伐他汀（pitavastatin)、罗苏伐他汀（rosuvastatin)、辛伐他汀 (simvastatin)和其某些组合。
[0031] 在某些方面，本发明包括制备本文所述抗原结合蛋白的方法，所述方法包括从分 泌所述抗原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
[0032] 在某些方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本文所述抗 原结合蛋白和药用赋形剂。在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外的活性剂。 在某些实施方案中，所述另外的活性剂选自放射性同位素、放射性核素、毒素或治疗药物及 化疗药物。
[0033] 在某些方面，本发明包括用于治疗或预防患者中的与高血清胆固醇水平有关的病 症的方法。所述方法包括给予有需要的患者有效量的至少一种本文公开的分离的抗原结合 蛋白。在某些实施方案中，所述病症为高胆固醇血症。
[0034] 在某些方面，本发明包括在患者中抑制PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法给予 有效量的至少一种本文所述抗原结合蛋白。
[0035] 在某些方面，本发明包括以小于IOOpM的Kd结合PCSK9的抗原结合蛋白。在某些 实施方案中，所述抗原结合蛋白以小于K d结合。在某些实施方案中，所述抗原结合 蛋白以小于5pM的Kd结合。
[0036] 在某些方面，本发明包括用于治疗或预防受治疗者中的与高血清胆固醇水平有关 的病症的方法，所述方法包括同时或序贯地将有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结 合蛋白与提高LDLR蛋白的利用率的药剂给予有需要的受治疗者。在某些实施方案中，所述 提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他汀。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀、西立 伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀及其某些组合。 [0037] 在某些方面，本发明包括降低受治疗者中的血清胆固醇水平的方法。所述方法包 括给予受治疗者有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白。
[0038] 在某些方面，本发明包括在受治疗者中降低血清胆固醇水平的方法，所述方法包 括同时或序贯将有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白与提高LDLR蛋白的利 用率的药剂给予受治疗者。在某些实施方案中，所述提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他 汀。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、 匹伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀及其某些组合。
[0039] 在某些方面，本发明包括通过给予受治疗者有效量的至少一种本文所提供的分离 的抗原结合蛋白来提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法。
[0040] 在某些方面，本发明包括提高受治疗者中的LDLR蛋白水平的方法，所述方法通 过同时或序贯地给予受治疗者有效量的至少一种本文所述的分离的抗原结合蛋白与提高 LDLR蛋白的利用率的药剂来实现。在某些实施方案中，所述提高LDLR蛋白水平的利用率 的药剂包括他汀。在某些实施方案中，他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他 汀、美伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀和其某些组合。
[0041] 在某些方面，本发明包括中和抗体，所述中和抗体结合PCSK9并减少低密度脂蛋 白受体（LDLR)，由此降低PCSK9对LDLR的作用。在某些实施方案中，所述抗体特异性结合 PCSK9。在某些实施方案中，所述抗体结合PCSK9的催化结构域。在某些实施方案中，所述 抗体结合SEQ ID NO: 3的31-447位残基内的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合具有 与SEQ ID NO: 3至少90%同一性的氨基酸序列的PCSK9。
[0042] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋 白在SEQ ID NO: 3的31-447位残基内的位点结合PCSK9。在某些实施方案中，当所述抗原 结合蛋白与PCSK9结合时，所述抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更 近处：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、 S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、 S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、 H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、 V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、 R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、 V346、G352、T353、G365、1368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、 I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、 S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、 G244、M247、I369、S372、C375或C378。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中 的至少一个相距 8 埃或更近处：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、 T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、 D367、1368、G370、A371、S373、S376或Q382。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以 下残基中的至少一个相距5埃或更近处：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、 D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以 下残基中的至少两个相距5埃或更近处：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、 D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以 下残基中的至少4个相距5埃或更近处：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、 D374、C375、T377、C378、F379、V380或S381。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下 残基中的至少一个相距 8 埃或更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、 S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、 E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、 E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、 G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386 或 Q387。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距5埃或更近处： W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、 G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、 S383或G384。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少两个相距5埃或 更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、 Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、 Q382、S383或G384。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少4个相距5 埃或更近处：W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、 C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、 S381、Q382、S383或G384。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一 个相距 8 埃或更近处：S153、S188、1189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、 D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、1154、T187、H193、E195、1196、M201、 V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375 或 C378。在某些实施方案 中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距5埃或更近处：S153、S188、I189、Q190、 S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377 或F379。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至少两个相距5埃或更近 处：S153、S188、1189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、 K243、S373、D374、S376、T377或F379。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基 中的至少四个相距 5 埃或更近处：S153、S188、1189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、 R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377 或 F379。
[0043] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的中和抗体，其中所述抗体结合PCSK9并降低 PCSK9结合LDLR的可能性。
[0044] 在某些实施方案中，涵盖结合PCSK9的抗体或抗原结合分子。所述抗体在SEQ ID NO: 3的31-447位残基内的位点结合PCSK9。在某些实施方案中，当抗体或抗原结合分子 结合PCSK9时，其位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：S153、1154、 P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、 L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、 W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、 G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、 S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、 D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、 G365、1368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、1189、Q190、S191、 D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、 I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、1369、 5372、 C375 或 C378。
[0045] 在某些实施方案中，提供封阻抗体与PCSK9在PCSK9残基的8埃内结合的分离的 抗体或抗原结合分子。在某些实施方案中，所述PCSK9残基选自以下PCSK9残基中的至少 -f:S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、 S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、 5373、 S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、 H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、 V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、 R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、 V346、G352、T353、G365、1368、1369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、 I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、 S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、 G244、M247、1369、S372、C375 或 C378。
[0046] 在某些实施方案中，提供在以下位点结合PCSK9的分离的抗体或抗原结合分子： 所述位点与LDLR结合PCSK9的位点重叠。在某些实施方案中，LDLR结合PCSK9的位点包 括至少一个选自以下的氨基酸残基：S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、 C375、T377、C378、F379、V380 和 S381。
[0047] 在某些实施方案中，提供结合PCSK9的分离的抗体或抗原结合分子。在某些实施 方案中，所述抗体或抗原结合分子降低EGFa在PCSK9的以下残基中的至少一个的8埃内 结合 PCSK9 的可能性：S153、1154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、 C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、 I368、G370、A371、S373、S376 或 Q382。
[0048] 在某些实施方案中，提供与PCSK9的表面结合的抗体、抗原结合蛋白或抗原结合 分子，所述表面与EGFa结合、Ab21B12结合和/或31H4结合的表面重叠。在某些实施方案 中，提供以与在附图中所述的相似的方式结合PCSK9的抗体、抗原结合蛋白或抗原结合分 子。
[0049] 在某些实施方案中，以上实施方案为中和抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案 中，所述抗原结合蛋白不是LDLR或其片段（例如EGFa)。
[0050] 在某些方面，本发明包括分离的中和抗体，其中当所述抗体与PCSK9结合时，抗体 位于与PCSK9的以下残基中的至少一个相距8埃或更近处：SEQ ID N0:3的T468、R469、 M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、 H565、W566、E567、V568、E569、R592、E593、S465、G466、P467、A473、1474、R476、G497、E498、 M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、 L571、H591、A594、S595和H597。在某些实施方案中，抗体位于与PCSK9的以下残基中的至 少一个相距 5 埃或更近处：SEQ ID N0:3 的 T468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、 A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592 和 E593。
[0051] 在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白包含：A)SEQ ID NO :89 中的 CDRHl 序列的 CDRHl、SEQ ID NO :89 中的 CDRH2 序列的 CDRH2 和 SEQ ID NO :89 中的 CDRH3 序列的 CDRH3 ;和 B) SEQ ID NO: 32 中的 CDRLl 序列的 CDRLl、SEQ ID NO: 32 中 的 CDRL2 序列的 CDRL2 和 SEQ ID NO: 32 中的 CDRL3 序列的 CDRL3。
[0052] 在某些方面，本发明包括结合SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白， 其中所述分离的抗原结合蛋白与变体PCSK9蛋白之间的结合为分离的抗原结合蛋白与SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:303的PCSK9蛋白之间的结合的50%。在某些实施方案中，所 述变体PCSK9蛋白在选自以下位点处包含至少一个残基突变：如SEQ ID NO: 1所示的207、 208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、 337、519、521和554。在某些实施方案中，所述至少一个突变选自R207E、D208R、E181R、 R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。在某些实施方案 中，所述至少一个突变选自 D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、 H521R 和 Q554R。
[0053] 在某些方面，本发明包括抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白以第一种方式结合SEQ ID勵:303的？051(-9蛋白并以第二种方式结合？051(9变体。所述？051(9变体在选自以下 的位点处具有至少一个点突变：SEQ ID NO:303和/或SEQ ID NO: 1的207、208、185、181、 439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521和 554。在某些实施方案中，所述第一种方式包括第一 EC50、第一 Bmax或第一 EC50及第一 Bmax。在某些实施方案中，所述第二种方式包括第二EC50、第二Bmax或第二EC50及第二 Bmax。第一种方式的值不同于第二种方式的值。在某些实施方案中，所述第一种方式包括第 一 EC50,其中所述第二种方式涉及第二EC50,其中所述点突变选自：R207E、D208R、E181R、 R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。在某些实施方 案中，所述第一 EC50与第二EC50相差至少20%。在某些实施方案中，所述第一 EC50与第 二EC50相差至少50%。在某些实施方案中，所述第二EC50比第一 EC50的数值更大。在某 些实施方案中，第一EC50由多珠粒结合测定法（multiplex bead binding assay)来测定。 在某些实施方案中，第二EC50大于lum。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白为中和抗 原结合蛋白。在某些实施方案中，所述中和抗原结合蛋白为竞争性中和抗原结合蛋白。在 某些实施方案中，所述中和抗原结合蛋白为非竞争性中和抗原结合蛋白。在某些实施方案 中，所述第一种方式包括第一 Bmax,所述第二种方式包括不同于第一 Bmax的第二Bmax。所 述PCSK9变体具有选自以下的至少一个点突变：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、 D313R、D337R、R519E、H521R和Q554R。在某些实施方案中，所述第二Bmax为所述第一Bmax 的约10%。在某些实施方案中，所述第一 Bmax与所述第二Bmax至少相差20%。在某些实 施方案中，所述第一 Bmax与所述第二Bmax相差至少50%。
[0054] 在某些方面，本发明包括结合SEQ ID NO: 3的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白， 其中所述抗原结合蛋白的表位包括以下氨基酸中的至少一个：SEQ ID N0:1中的207、208、 181、185、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、 519、521 和 554。
[0055] 在某些方面，本发明包括结合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的PCSK9蛋白的分 离的中和抗原结合蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低LDLR，由此降低PCSK9对LDLR的 作用。在某些实施方案中，抗原结合蛋白为LDLR非竞争性中和抗原结合蛋白。在某些实施 方案中，抗原结合蛋白为LDLR竞争性中和抗原结合蛋白。
[0056] 在某些方面，本发明包括分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含：A) SEQ ID NO:49 中的 CDRHl 序列的 CDRHl、SEQ ID NO:49 中的 CDRH2 序列的 CDRH2 和 SEQ ID N0:49 中的CDRH3序列的CDRH3;和B)SEQ ID N0:23 中的CDRLl序列的CDRL1、SEQ ID N0:23 中的CDRL2序列的CDRL2和SEQ ID N0:23中的CDRL3序列的CDRL3。
[0057] 在某些方面，本发明包括组合物，所述组合物包含结晶的PCSK9蛋白和结合PCSK9 的抗原结合蛋白。所述组合物包含结晶的PCSK9蛋白，以至于PCSK9蛋白的三维结构可测 定为约2. 2埃或更好的分辨率。在某些实施方案中，所述抗原结合蛋白为抗体或其片段。
[0058] 在某些方面，本发明包括结晶的PCSK9蛋白及至少LDLR蛋白的EGFa部分，其中所 述LDLR蛋白的EGFa部分被PCSK9蛋白结合，其中所述结晶的PCSK9蛋白如下：PCSK9蛋白 的三维结构可测定为约2. 2埃或更好的分辨率。在某些实施方案中，分子模型在计算机可 读介质上。
[0059] 在某些方面，本发明包括本文所述抗原结合蛋白在制备用于降低血清胆固醇药物 中的用途。
[0060] 在某些方面，本发明包括本文所述的抗原结合蛋白在制备用于治疗或预防受治疗 者中的与高血清胆固醇水平有关的病症的药物中的用途。
[0061] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区（⑶RH) :(i)选自选自SEQ ID N0:67、79、89 和49的序列内的⑶RHl的⑶RHl ; (ii)在氨基酸序列上与（i)的⑶RHl差别在于不超过2 个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRHl ;和（iii)选自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9Xici(SEQIDNC): 406)的CDRHl氨基酸序列，其中X 1选自G ;X2选自Y、F和G ;X3选自T和S ;X4选自L和F ; X5选自T、S和N5X6选自S和A5X 7选自Y和F5X8选自G、S和Y;X9选自I、M和W;X 1Q选自 S、N和H;B)选自以下至少一种的轻链互补决定区（⑶RL) :(i)选自选自SEQ ID N0:12、32、 35和23的序列内的CDRLl的CDRLl ; (ii)在氨基酸序列上与（i)的CDRL3差别在于不超 过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的⑶RLl ;和（iii)选自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11X 12 X13X14(SEQ ID NO:407)的CDRLl氨基酸序列，其中X1选自T和非氨基酸；X2选自G和S ;X3 选自S、T和G ;X4选自S ;X5选自S ;X6选自N、D和S ;X7选自I、V和N;X8选自G和I ;父9选 自A和G;X10选自G、Y、S和N5X11选自Y和N 5X12选自D、S、T和F5X13选自V;X14选自S、N 和Η。本领域技术人员将了解，单个ABP或抗体可满足以上一个或多个选择，并落在该实施 方案的所述发明范围内。
[0062] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：Α)选自以下至少一种的重链互补决定区（⑶RH) :(i)选自选自SEQ ID Ν0:67、79、89 和49的序列内的⑶RH2的⑶RH2 ; (ii)在氨基酸序列上与⑴的⑶RH2差别在于不超过2 个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2 ;和（iii)选自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11X 12X13X14X 15X16X17(SEQ ID N0:408)的CDRH2氨基酸序列，其中X1选自W、S、L和非氨基酸；X2选自V、I 和E ;X3选自S、W和I ;X4选自F、S和N ;X5选自Y、S、D和H ;X6选自N、S和G ;X7选自S和 G ;X8选自N、Y、D和R ;X9选自T、I和E ;X1Q选自N、S、Y和D ;Xn选自Y ;X12选自A和N ;X13 选自Q、D和P ;X14选自K和S ;X15选自L和V ;X16选自Q和K ;X17选自G和S ;B)选自以下 至少一种的轻链互补决定区（⑶RL) :(i)选自选自SEQ ID NO: 12、32、35和23的序列内的 ⑶RL3的⑶RL2 ; (ii)在的氨基酸序列上与（i)的⑶RL3相差不超过2个氨基酸的氨基酸添 力口、缺失或取代的CDRL2 ;和（iii)选自X1X2X3X4X5X 6X7(SEQIDNOMOg)的CDRL2氨基酸序列， 其中X1选自G、E、S和D ;X2选自N、V和Y ;X3选自S和N5X4选自N、Q和K ;X5选自尺;父6选 自P ;X7选自S。
[0063] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区（⑶RH) :(i)选自选自SEQ ID N0:67、79、89 和49的序列内的⑶RH3的⑶RH3 ; (ii)在氨基酸序列上与⑴的⑶RH3差别在于不超过2 个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的⑶RH3 ;和（iii)选自X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11X 12X13X1 4(SEQ ID N0:410)的⑶RH3氨基酸序列，其中X1选自D和非氨基酸；X2选自Y、A和非氨基 酸；X 3选自D、I和非氨基酸；X4选自F、A和非氨基酸；X5选自W、A和非氨基酸；X 6选自S、L 和非氨基酸；X7选自A、Y、G和非氨基酸；X8选自Y、Q和非氨基酸；X9选自G、Y和L ;X1(I选自 Y、D和V ;Xn选自G、A和P ;X12选自M和F ;X13选自D ;X14选自V和Y ;和B)选自以下至少 一种的轻链互补决定区（⑶RU :(i)选自选自SEQ ID勵：12、32、35和23的序列内的^此3 的CDRL3 ;(ii)在氨基酸序列上与（i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、 缺失或取代的 CDRL3;和（iii)选自 X1X2X3X4X5X 6X7X8X9XltlX11 (SEQ ID N0:411)的 CDRL3 氨基 酸序列，其中X1选自Q、A、G和非氨基酸；X2选自S、V、T和非氨基酸；X 3选自Y、N和1;\选 自S和D ;X5选自S、Y和D ;X6选自S和T ;X7选自L和S ;X8选自S、T和N ;X9选自G、S和 A5Xltl选自S、M、W和Y ;和X11选自V。在某些实施方案中，任何上述氨基酸可被保守氨基酸 取代所置换。
[0064] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区（CDRH):⑴选自选自SEQ ID NO:47、48、 49、 50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRHl的CDRHl ; (ii)在氨基酸序列上与 (i)的CDRHl差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添力卩、缺失或取代的CDRHl ;和（iii)选 自XAXAXAXAXAJSEQ ID N0:412)的CDRHl氨基酸序列，其中X1选自G、P和A ;X2选 自 Y、W、F、T 和 S ;X3 选自 T、P、S 和 A、C、V、L 和 I ;X4 选自 L、F、I、V、M、A 和 Y ;X5 选自 T、P、 S和 A ;Χ6选自 S、T、A 和 C ;Χ7选自 Y、W、F、T和 S ;Χ8选自 G、P 和 A ;Χ9选自 I、L、V、M、A 和 F;X1Q选自S、T、A和C;B)选自以下至少一种的轻链互补决定区（CDRL):⑴选自选自SEQ 10勵：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的〇)虬1的〇)虬1;(^)在氨基酸 序列上与（i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRLl ;和 (iii)选自 ID N0:413)的 CDRLl 氨基酸序列，其中 X1It 自T和S ;X2选自G、P和A ;X3选自T和S ;X4选自S、N、T、A、C和Q ;X5选自S、T、A和C ;X6 选自D和E;X7选自V、I、M、L、F和A;X8选自G、P和A ;X9选自G、A、R、P、V、L、I、K、Q和N; X1。选自 Y、W、F、T 和 S ;Xn 选自 N和 Q5X12 选自 Y、S、W、F、T、A和 C;X13 选自 V、I、M、L、F和 A ;X14 选自 S、T、A 和 C。
[0065] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区（CDRH):⑴选自选自SEQ ID N0:47、48、49、 50、 51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH2的CDRH2 ; (ii)在氨基酸序列上与（i) 的CDRH2差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2 ;和（iii)选自X1 X2X3X4X5X6X 7X8X9XiciX11X 12X13X14X15X16X 1^ (SEQ ID N0:414)的 CDRH2 氨基酸序列，其中 X1 选自 ff、 Y和 F;X2 选自 V、I、M、L、F 和 A;X3 选自 S、T、A和 C;X4 选自 A、F、V、L、I、Y 和 M;X5 选自 Y、 W、F、T和S ;Χ6选自N和Q ;Χ7选自G、P和A ;Χ8选自N和Q ;Χ9选自T和S ;X1Q选自N和Q ; X11 选自 Y、W、F、T 和 S ;X12 选自 A、V、L 和 I ;X13 选自 Q、E、N 和 D ;X14 选自 K、R、Q 和 N ;父15选 自L、F、V、I、M、A和Y5X16选自Q和N 5X17选自G、P和A;B)选自以下至少一种的轻链互补 决定区（CDRL) :(i)选自选自 SEQ ID 吣：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中 的⑶RL3的⑶RL2 ; (ii)在氨基酸序列上与（i)的⑶RL3差别在于不超过2个氨基酸的氨 基酸添加、缺失或取代的CDRL2;和（iii)选自XAXAXA^SEQ ID N0:415)的CDRL2氨 基酸序列，其中X1选自E和D;X2选自V、I、M、L、F和A ;X3选自S、T、A和C;X4选自N和Q; X5选自R、K、Q和N ;X6选自P和A ;X7选自S、T、A和C。
[0066] 在某些方面，本发明包括结合PCSK9的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白 包含：A)选自以下至少一种的重链互补决定区（CDRH):⑴选自选自SEQ ID NO:47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的序列中的CDRH3的CDRH3 ; (ii)在氨基酸序列上与 (i)的CDRH3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3 ;和（iii)选 自X1X2X3X4X 5XJSEQ ID N0:416)的CDRH3氨基酸序列，其中X1选自G、P、A和非氨基酸；X2 选自Y、W、F、T和S;X3选自G、V、P、A、I、M、L和F;X 4选自M、L、F和I;X5选自D和E;X6选 自V、I、M、L、F和A ;B)选自以下至少一种的轻链互补决定区（⑶RL) :(i)选自选自SEQ ID 勵：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24的序列中的〇)虬3的〇)虬3;(^)在氨基酸序列 上与（i)的CDRL3差别在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3 ;和（iii) 选自XAXAXAXAXJSEQ ID N0:417)的CDRL3氨基酸序列，其中X1选自S、N、T、A、C和 Q;X2选自S、T、A和C;X3选自Y、W、F、T和S;X4选自T和S;X 5选自S、T、A和C;X6选自S、 T、A 和C;X7 选自 N、S、Q、T、A和 C;X8 选自 M、V、L、F、I 和 A;X9 选自 V、I、M、L、F和 A。
[0067] 附图简述
[0068] 图IA描述具有前域（下划线）的PCSK9成熟形式的氨基酸序列。
[0069] 图IB1-IB4描述具有前域（下划线）及信号序列（粗体）的PCSK9的氨基酸和核 酸序列。
[0070] 图2A-2D为各种抗原结合蛋白的各种轻链的序列比较表。图2C延续了在图2A中 开始的序列。图2D延续了在图2B中开始的序列。
[0071] 图3A-3D为各种抗原结合蛋白的各种重链的序列比较表。图3C延续了在图3A中 开始的序列。图3D延续了在图3B中开始的序列。
[0072] 图3E-3JJ描述抗原结合蛋白某些实施方案的可变结构域的氨基酸和核酸序列。
[0073] 图3KK描述各种恒定结构域的氨基酸序列。
[0074] 图3LL-3BBB描述抗原结合蛋白某些实施方案的可变结构域的氨基酸和核酸序 列。
[0075] 图3CCC-3JJJ为抗原结合蛋白某些实施方案的各种重链和轻链序列比较表。
[0076] 图4A为抗原结合蛋白与人PCSK9的结合曲线。
[0077] 图4B为抗原结合蛋白与人PCSK9的结合曲线。
[0078] 图4C为抗原结合蛋白与猕猴PCSK9的结合曲线。
[0079] 图4D为抗原结合蛋白与猕猴PCSK9的结合曲线。
[0080] 图4E为抗原结合蛋白与小鼠 PCSK9的结合曲线。
[0081] 图4F为抗原结合蛋白与小鼠 PCSK9的结合曲线。
[0082] 图5A描述涉及PCSK9及各种抗原结合蛋白的SDSPAGE实验的结果，其证明蛋白的 相对纯度和浓度。
[0083] 图5B和5C描述来自对21B12的biacore溶液平衡测定的图表。
[0084] 图描述来自biacore捕获测定的动力学图表。
[0085] 图5E描述了描绘三种ABP的分库（binning)结果的条形图。
[0086] 图6A为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白31H4IgG2 的抑制曲线。
[0087] 图6B为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白31H4IgG4 的抑制曲线。
[0088] 图6C为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白21B12IgG2 的抑制曲线。
[0089] 图6D为在体外PCSK9:LDLR结合测定中的针对PCSK9的抗原结合蛋白21B12IgG4 的抑制曲线。
[0090] 图7A为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白31H4IgG2的抑制曲线，所述细胞 LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了 PCSK9的作用。
[0091] 图7B为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白31H4IgG4的抑制曲线，所述细胞 LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了 PCSK9的作用。
[0092] 图7C为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白21B12IgG2的抑制曲线，所述细胞 LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了 PCSK9的作用。
[0093] 图7D为在细胞LDL吸收测定中的抗原结合蛋白21B12IgG4抑制曲线，所述细胞 LDL吸收测定显示ABP降低LDL吸收的作用，该作用封阻了 PCSK9的作用。
[0094] 图8A为描述在ABP31H4小鼠中降低血清胆固醇的能力的图表，相对于IgG对照处 理的小鼠该能力有变化（*Ρ〈〇· 01)。
[0095] 图8Β为描述在ΑΒΡ31Η4小鼠中降低血清胆固醇的能力的图表，相对于时间=零小 时该能力有变化（#Ρ，〇· 05)。
[0096] 图8C为描述在C57B1/6小鼠中ΑΒΡ31Η4对HDL胆固醇水平的影响的图表 (*ρ〈0· 01)。
[0097] 图8D为描述在C57B1/6小鼠中ΑΒΡ31Η4对HDL胆固醇水平的影响的图表 (#ρ〈0· 05)。
[0098] 图9描述ΑΒΡ31Η4在各个时间点后提高所存在的肝脏LDLR蛋白量的能力的蛋白 印迹分析
[0099] 图IOA为描述抗原结合蛋白31Η4在野生型小鼠中相对降低总血清胆固醇的能力 的图表。
[0100] 图IOB为描述抗原结合蛋白31Η4在野生型小鼠中降低HDL的能力的图表。
[0101] 图IOC为描述不同的抗原结合蛋白31Η4和16F12降低血清胆固醇能力的图表。
[0102] 图IlA描述用于测试抗原结合蛋白降低血清胆固醇的持续时间及能力的注射方 案。
[0103] 图IlB为描述图IlA中的方案的结果的图表。
[0104] 图12A描述H印G2细胞中响应他汀与ABP21B12的组合的LDLR水平。
[0105] 图12B描述!fepG2细胞中响应他汀与ABP31H4的组合的LDLR水平。
[0106] 图12C描述H印G2细胞中响应他汀与ABP25A7. 1 (非中和抗体，与"25A7"中和抗 体形成对照）的组合的LDLR水平。
[0107] 图12D描述在过量表达PCSK9的H印G2细胞中响应他汀与ABP21B12的组合的LDLR 水平。
[0108] 图12E描述在过量表达PCSK9的H印G2细胞中响应他汀与ABP31H4的组合的LDLR 水平。
[0109] 图12F描述在过量表达PCSK9的!fepG2细胞中响应他汀与ABP25A7. 1 (非中和抗 体，与"25A7"中和抗体形成对照）的组合的LDLR水平。
[0110] 图13A描述各种针对PCSK9的ABP的不同轻链氨基酸序列。点（.）表示为没有氨 基酸。
[0111] 图13B描述各种针对PCSK9的ABP的轻链进化树。
[0112] 图13C描述各种针对PCSK9的ABP的不同重链氨基酸序列。点（.）表示为没有氨 基酸。
[0113] 图13D描述各种针对PCSK9的ABP的重链系统树图。
[0114] 图13E描述轻链和重链⑶R的比较，并指定了从其中得到共有序列的组。
[0115] 图13F描述第1组和第2组的共有序列。
[0116] 图13G描述第3组和第4组的共有序列。
[0117] 图13H描述第1组和第2组的共有序列。点（.）表示同一残基。
[0118] 图131描述第2组的共有序列。点（.）表示同一残基。
[0119] 图13J描述第3组和第4组的共有序列。点（.）表示同一残基。
[0120] 图14A为描述各种ABP(以10mg/kg)在体内降低LDL的能力的图表。
[0121] 图14B为描述各种ABP(以30mg/kg)在体内降低LDL的能力的图表。
[0122] 图15A和图15B为抗原结合蛋白的各种实施方案的各种轻链的序列比较表。图 15B延续了在图15A中开始的序列。
[0123] 图15C和图15D为抗原结合蛋白的各种实施方案的各种轻链的序列比较表。图 IOT延续了在图15C中开始的序列。
[0124] 图16A为用于测试Ab21B12结合PCSK9的ProCat或VD部分的能力的凝胶的描述。
[0125] 图16B为用于测试Ab31H4结合PCSK9的ProCat或VD部分的能力的凝胶的描述。
[0126] 图17描述PCSK9及LDLR的EGFa部分的结构。
[0127] 图18A描述PCSK9及31H4Ab的结构。
[0128] 图18B描述PCSK9及31H4Ab的结构。
[0129] 图 19A 描述 PCSK9、31H4Ab 及 21B12Ab 的结构。
[0130] 图 19B 描述 PCSK9 及 21B12Ab 的结构。
[0131] 图20A描述PCSK9及来自LDLR的EGFa的结构，所述结构与已结合PCSK9的抗体 31H4和21B12的结构重叠。
[0132] 图20B描述PCSK9和LDLR的结构模型。
[0133] 图20C描述另一角度的PCSK9和LDLR的结构模型。
[0134] 图20D描述包括31H4和21B12的结构表现形式的PCSK9和LDLR的结构模型。
[0135] 图20E描述图20D中的结构模型围绕所标注的轴旋转90度。
[0136] 图20F描述图20D中的结构模型围绕所标注的轴旋转180度。
[0137] 图21A描述PCSK9和31A4的结构。
[0138] 图21B描述PCSK9和31A4的结构。
[0139] 图21C描述PCSK9和31A4的结构。
[0140] 图21D描述全长PCSK9和31A4的结构模型。
[0141] 图22为一套确定人ABP序列与在大肠杆菌（E. coli)中产生并用于晶体结构的 ABP序列之间的各种差异的ABP序列。
[0142] 图23为各种分库结果的表。
[0143] 图23A为描述各种分库结果的表的第一部分。
[0144] 图23B为描述各种分库结果的表的第二部分。
[0145] 图23C为描述各种分库结果的表的第三部分。
[0146] 图23D为描述各种分库结果的表的第四部分。
[0147] 图24A描述在非还原条件下的蛋白印迹。
[0148] 图24B描述在还原条件下的蛋白印迹。
[0149] 图25A描述PCSK9的表面覆盖。
[0150] 图25B描述PCSK9的表面覆盖。
[0151] 图25C描述PCSK9的表面覆盖。
[0152] 图2?描述PCSK9的表面覆盖。
[0153] 图25E描述PCSK9的表面覆盖。
[0154] 图25F描述PCSK9的表面覆盖。
[0155] 图26为PCSK9的氨基酸序列与PCSK9变体中突变的所有残基的序列比较，以调查 不同抗体表位。
[0156] 图27A描述21B12表位击中（印itope hit)，其根据用21B12作图到PCSK9的晶体 结构上。
[0157] 图27B描述31H4表位击中，其根据用31H4和21B1作图到PCSK9的晶体结构上。
[0158] 图27C描述31A4表位击中，其根据用31A4和21B1作图到PCSK9的晶体结构上。
[0159] 图27D描述12H11表位击中，其根据用31H4和21B12作图到PCSK9的晶体结构上。
[0160] 图27E描述3C4表位击中，其根据用31H4和21B12作图到PCSK9的晶体结构上。
[0161] 图28A为证明各种ABP与PCSK9的不同部分的结合能力的图表。
[0162] 图28B为证明各种ABP与PCSK9的不同部分的结合能力的图表。
[0163] 图28C为比较两种ABP的LDLR结合能力的图表。
[0164] 图28D为比较两种ABP的细胞LDL吸收活性的图表。
[0165] 某些例示性实施方案详述
[0166] 本文公开了结合PCSK9的抗原结合蛋白（例如抗体及其功能结合片段）。在某些 实施方案中，所述抗原结合蛋白结合PCSK9并以各种方式防止PCSK9起作用。在某些实施 方案中，所述抗原结合蛋白封阻或降低PCSK9与其它物质相互作用的能力。例如，在某些实 施方案中，所述抗原结合蛋白以防止或降低PCSK9结合LDLR的可能性的方式结合PCSK9。 在其它实施方案中，抗原结合蛋白结合PCSK9但不封阻PCSK9与LDLR相互作用的能力。在 某些实施方案中，抗原结合蛋白为人单克隆抗体。
[0167] 如本领域技术人员所了解，根据本发明的公开内容，改变PCSK9和LDLR之间的相 互作用可在受治疗者中增加可用于结合LDL的LDLR量，进而降低血清LDL的量，导致受治 疗者的血清胆固醇水平降低。因此，针对PCSK9的抗原结合蛋白可用于各种方法和组合物 中，所述方法和组合物用于治疗高血清胆固醇水平的受治疗者、处于高血清胆固醇水平风 险中的受治疗者或能从降低其血清胆固醇水平获益的受治疗者。因此，本文还阐述用于降 低血清胆固醇、保持血清胆固醇或预防血清胆固醇增加的各种方法和技术。在某些实施方 案中，抗原结合蛋白允许PCSK9和LDLR之间结合，但该抗原结合蛋白防止或降低PCSK9对 LDLR的有害活性。在某些实施方案中，抗原结合蛋白防止或降低PCSK9与LDLR结合。
[0168] 为方便起见，以下章节大体上概述本文所用术语的各种含义。在讨论了这些之后， 论述了关于抗原结合蛋白的大体方面，接着是证明抗原结合蛋白的各种实施方案的性质及 如何使用它们的具体实施例。
[0169] 定义和实施方案
[0170] 应该理解，前述一般说明及以下详述仅为例示性和解释性，并非限制所要求保护 的本发明。在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非 另外说明，否则"或"的使用意指"和/或"。此外，术语"包括"以及其它形式例如"包含"的 使用并非限制性的。此外，除非另外明确说明，否则术语例如"元件"或"组分"既包括包含 一个单元的元件及组分又包括包含超过一个亚单元的元件及组分。此外,术语"部分"的使 用可包括部分的一部分或整个部分。
[0171] 本文所用章节标题仅用于组织目的，不能理解为限制所述的主题。为任何目的， 本申请中所引用的所有文献或文献的部分（包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论 文）都在此以其整体引作参考。除非另外指出，否则如本发明所使用，以下术语应理解为具 有以下含义：
[0172] 术语"前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型"或"PCSK9"是指SEQ ID N0:1和 /或3或其片段所述的多肽以及相关多肽，它们包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍 生变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体（包括添加 N-末端甲硫氨酸）、融合多肽和种 间同源物。在某些实施方案中，PCSK9多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向 残基、氣基末端甲硫氣酸残基、赖氣酸残基、标签（tag)残基和/或融合蛋白残基。"PCSK9" 也被称为FH3、NARC1、HCH0LA3、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型和神经细胞凋亡 调节转化酶I (neural apoptosis regulated convertaselhPCSKg基因编码前蛋白转化酶 蛋白，所述前蛋白转化酶蛋白属于分泌性枯草杆菌酶家族（secretory subtilase family) 的蛋白酶K亚家族。术语"PCSK9"表示前蛋白和前蛋白自身催化后产生的产物两者。当仅 提及自身催化的产物（例如对于选择性结合裂解的PCSK9的抗原结合蛋白）时，该蛋白可 称为"成熟"、"裂解的"、"经加工的"或"有活性的"PCSK9。当只提及其无活性的形式时，该 蛋白可称为"无活性的"、"前形式的"或"未加工的"形式的PCSK9。本文所用术语PCSK9还 包括天然存在的等位基因，例如突变体D374Y、S127R和F216L。术语PCSK9还包括结合了 PCSK9氨基酸序列翻译后修饰的PCSK9分子，例如业已被糖基化、PEG化的PCSK9序列、其信 号序列业已被裂解的PCSK9序列、其前域业已从催化结构域中裂解但尚未与所述催化结构 域分离的PCSK9序列（例如图IA和1B)。
[0173] 术语"PCSK9活性"包括PCSK9的任何生物学作用。在某些实施方案中，PCSK9 活性包括PCSK9与底物或受体相互作用或结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性 由PCSK9结合LDL受体（LDLR)的能力来表示。在某些实施方案中，PCSK9结合LDLR并 催化涉及LDLR的反应。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9改变（例如降低） LDLR利用率的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9增加受治疗者中的LDL 量的能力。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低可用于结合LDL的LDLR的量 的能力。在某些实施方案中，"PCSK9活性"包括因 PCSK9信号转导而产生的任何生物学 活性。例示性活性包括但不限于：PCSK9结合LDLR ;裂解LDLR或其它蛋白的PCSK9酶活 性；PCSK9结合除LDLR外的促进PCSK9作用的蛋白；PCSK9改变APOB分泌（SunX-M等， "Evidence for effect of mutant PCSK9on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia(突变的 PCSK9 对载脂蛋白 B 分泌的影响是非比寻常的严重的显性高胆固醇血症的原因的证明），Human Mo I e cu I ar GeneticsH: 1161-1169, 2005 和 Ouguerram K 等，"Apolipoprotein BlOOmetabolism inautosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations inPCSK9 (在与 PCSK9突变有关的常染色体显性高胆固醇血症中载脂蛋白BlOO的代谢），Arterioscler thromb Vase Biol. 24:1448-1453, 2004) ;PCSK9在肝脏再生和神经细胞分化中的作用 (Seidah NG 等，''The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertasel(NARC-I): Liver regeneration and neuronal differentiation (调 节分泌性前蛋白转化酶神经细胞凋亡的转化酶l(NARC-l):肝脏再生和神经元分 化"PNAS100:928-933, 2003);和PCSK9在肝葡萄糖代谢中的作用（Costet等，"H印atic PCSK9expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding proteinic (经由膜岛素和固醇调节性兀件结合蛋白Ic通过 营养状态调节肝 PCSK9 表汰）" L Biol. Chem. 281 (10) :6211-18, 2006)。
[0174] 本文所用术语"高胆固醇血症"是指胆固醇水平提高到所需水平以上的病症。在 某些实施方案中，其是指血清胆固醇水平提高。在某些实施方案中，所需水平考虑了本领域 技术人员已知的各种"风险因子"（并由本文阐述或提及）。
[0175] 术语"多核苷酸"或"核酸"包括单链和双链核苷酸聚合体二者。包含多核苷酸的 核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或经修饰形式的任一种类型核苷酸。所述修饰包 括：碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2'，3' -二脱氧核糖；和核苷酸间 连接修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯（phosphoroselenoate)、二硒代磷 酸酉旨（phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate 和氨基憐酸 酉旨（phosphoroamidate)〇
[0176] 术语"寡核苷酸"意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中， 寡核苷酸长10-60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19 或20-40个核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链，例如用于构建突变基因的单链或双链。寡 核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、 荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
[0177] "分离的核酸分子"意指基因组DNA或RNA、mRNA、cDNA或其合成来源（synthetic origin)或某些组合，它们不与所述分离的多核苷酸天然存在于其中的多核苷酸的全部或 部分缔合，或它们被连接到在自然状态下不与其连接的多核苷酸。应该理解，为本发明目 的，"包含"特定核苷酸序列的"核酸分子"并不包括整个染色体。"包含"特定核酸序列的分 离的核酸分子除了包含所述特定序列外，还包含编码至多10个或甚至至多20个其它蛋白 或其部分的序列，或可包含可操作地连接的调控所述核酸序列的编码区表达的调控序列， 和/或可包含载体序列。
[0178] 除非另外明确说明，否则本文所述的任何单链多核苷酸序列的左手端为5'端；双 链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。将5'到3'添加新生RNA转录物的方向称为转 录方向；将具有与RNA转录物相同的序列且其5'为RNA转录物的5'端的DNA链上的序列 区称为"上游序列";将具有与RNA转录物相同的序列且其3'为RNA转录物的3'端的DNA 链上的序列区称为"下游序列"。
[0179] 术语"调控序列"是指可影响与其连接的编码序列的表达及加工的多核苷酸序列。 所述调控序列的性质可视宿主生物体而定。在特定实施方案中，用于原核生物的调控序列 可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，用于真核生物的调控序列可包括包 含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。"调控序列" 可包括前导序列和/或融合伴侣序列。
[0180] 术语"载体"意指用于将蛋白编码信息转移到宿主细胞的任何分子或实体（例如 核酸、质粒、噬菌体或病毒）。
[0181] 术语"表达载体"或"表达构建体"是指适于转化宿主细胞并含有指导和/或调控 (结合宿主细胞）一个或多个可操作地与其连接的异源编码区的表达的核酸序列的载体。 表达构建体可包括但不限于：影响或调控转录、翻译的序列；和若存在内含子，则影响可操 作地与其连接的编码区的RNA剪接的序列。
[0182] 本文所用"可操作地连接"意指使用该术语的组分处于允许所述组分在合适的条 件下实行其固有的功能的关系中。例如，让"可操作地连接"到蛋白编码序列的载体中的调 控序列与蛋白编码序列连接，以便在与调控序列的转录活性兼容的条件下完成所述蛋白编 码序列的表达。
[0183] 术语"宿主细胞"意指业已被或能够被核酸序列转化并藉此表达目的基因的细胞。 不管后代在形态上或在遗传构成上与原始母细胞是否相同，只要后代存在目的基因，该术 语就包括所述母细胞的后代。
[0184] 术语"转染"意指细胞吸收外来或外源DNA，当将所述外源DNA引入到细胞膜内 时所述细胞就被"转染"了。多种转染技术在本领域众所周知并公开于本文中。参见例如 Graham 等，1973, Virology52:456 :Sambrook 等，2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册），见上述；Davis 等，1986, Basic Methods in Molecular Biology (分子生物学基本方法），Elsevier ;Chu等，1981, Genej^: 197。所述技术可用于将 一种或多种外源DNA部分引入到合适的宿主细胞中。
[0185] 术语"转化"是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新DNA或RNA时， 所述细胞就被转化了。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天 然状态进行遗传修饰时，细胞被转化了。转染或转导后，转化的DNA可通过在物理上整合到 细胞染色体而与细胞DNA重组，或可作为染色体外元件不被复制而短暂保留，或可作为质 粒独立复制。当转化的DNA随着细胞分裂复制时，认为细胞已经被"稳定地转化"了。
[0186] 术语"多肽"或"蛋白"意指如下大分子：具有天然蛋白的氨基酸序列的大分子，所 述天然蛋白即由天然存在且为非重组的细胞产生的蛋白；或所述大分子由遗传工程改造的 或重组的细胞产生，所述术语包括具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或具有所述天然序 列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。该术语还包括氨基酸聚合体，其中 一个或多个氨基酸为相应的天然存在的氨基酸的化学类似物及聚合体。术语"多肽"和"蛋 白"特别涵盖PCSK9抗原结合蛋白、抗体或序列，其具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸 的缺失、添加和/或取代。术语"多肽片段"是指与全长天然蛋白相比具有氨基末端缺失、羧 基末端缺失和/或中间缺失的多肽。所述片段还可含有与天然蛋白相比经修饰的氨基酸。 在某些实施方案中，片段长度为约5-500个氨基酸。例如，片段长度可为至少5、6、8、10、14、 20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体 的免疫学功能片段，包括结合结构域。在PCSK9结合抗体情况下，有用的片段包括但不限于 CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的部分或仅其含两个CDR的可变区等。
[0187] 提及的术语"分离的蛋白"意指如下主题蛋白：（1)脱离通常与其一起存在的至 少某些其它蛋白的蛋白；（2)基本上脱离同一来源（例如来自同样的物种）的其它蛋白的 蛋白；（3)由来自不同物种的细胞表达的蛋白；（4)已经与和其天然结合的多核苷酸、脂类、 糖类或其它物质的至少约50%分开的蛋白；（5)与和其并不天然结合的多肽可操作地结合 (通过共价或非共价作用）的蛋白；或（6)非天然存在的蛋白。通常"分离的蛋白"构成既 定样品的至少约5%、至少约10%、至少约25%或至少约50%。基因组DNA、cDNA、mRNA或 合成来源或其任何组合的其它RNA可编码所述分离的蛋白。优选地，分离的蛋白基本上脱 离在其天然环境中存在的干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的蛋白或多肽或其它污 染物。
[0188] 术语"氨基酸"包括其在本领域中的一般含义。
[0189] 多肽（例如抗原结合蛋白或抗体）的"变体"包含相对于另一多肽序列在氨基酸 序列中插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。变体包括融合蛋白。
[0190] 术语"同一性"是指通过比对和比较序列而确定的两个或多个多肽分子或两个或 多个核酸分子序列之间的关系。"同一性百分率"意指被比较的分子内的氨基酸或核苷酸 之间相同残基的百分比，其基于被比较的大小最小的分子计算。对于这些计算，优选通过 特定的数学模型或计算机程序（即"算法"）来解决比对中的空位（如果存在的话）。可 用于计算比对的核酸或多肽同一'丨生的方法包括如下文献中所述的方法：Computational Molecular Biology (计算机化的分子生物学），（Lesk, A. Μ·编辑），1988, New York:Oxford University Press ；Biocomputing Informatics and Genome Pro jects (生物计算信息学 和基因组计划），（Smith, D.W.编辑），1993, New York:Academic Press ;Computer Analysis of Sequence Data, Parti (序列数据的计算机分析，第 I 部分），（Griffin,A.M·和 Griffin, H. G.编辑），1994, New Jersey:Humana Press ；von Heinje, G. , 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学序列分析），New York:Academic Press ;Sequence Analysis Primer(序列分析引物），（Gribskov,M.和 Devereux, J.编辑），1991,New York:M. Stockton Press ;和 Carillo 等，1988, SIAM J.AppliedMath. 48:1073。
[0191] 在计算同一性百分率时，通常以得到序列之间的最大匹配的方式来比对待比 较的序列。可用于测定同一性百分率的计算机程序的一个实例为GCG程序包，其包括 GAP(Devereux等，1984,Nucl. AcidRes. 12:387 :Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。将计算机算法GAP用于比对待测定序列同一1丨生百分比的两个多 肽或多核苷酸。根据其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配对序列进行比对（由算法来确定 "匹配跨度（matched span)"）。结合所述方法使用空位开放罚分（计算为3x平均对角线 (average diagonal),其中所述"平均对角线"为所用比较矩阵的对角线的平均值；所述"对 角线"为通过特定比较矩阵分配给每一完美的氨基酸匹配的分值或数值）和空位延伸罚分 (其通常为空位开放罚分的1/10倍）以及比较矩阵例如PAM250或BL0SUM62。在某些实施方 案中，所述算法也使用标准比较矩阵（对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978, Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列和结构图集），5:345_352 ;对于 BL0SUM62 比较矩阵，参见 Henikoff 等，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:10915-10919)。
[0192] 在用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分率中可采用的参数实例以下：
[0193] ?算法：Needleman 等，1970, J. Mol. Biol. 48:443-453
[0194] ?比较矩阵：来自Henikoff等，1992,上述的BL0SUM62
[0195] ?空位罚分：12 (但对末端空位不罚分）
[0196] ?空位长度罚分：4
[0197] ?相似性阀值：0
[0198] 用于比对两个氨基酸序列的某些比对设计（alignment scheme)可导致仅两个序 列的短区域匹配，即使在两个全长序列间没有显著的关系，这种小比对区也可具有极高的 序列同一性。因此，如果需要产生跨越靶标多肽的至少50个或其它数目的邻接氨基酸的比 对，则可调整所选择的比对方法（GAP程序）。
[0199] 本文所用的20种常规（例如天然存在的）氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见 Immunology-ASynthesis (免疫学一合成）（第 2 版，E. S. Golub 和 D. R. Gren,编辑，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，为任何目的其在此引作参考。20种常规氨基酸 的立体异构体（例如D-氨基酸）、非天然氨基酸例如a -，α -二取代的氨基酸、N-烷基氨 基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可为本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸实例包括： 4_羟基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、ε -Ν，N，N-三甲基赖氨酸、ε -N-乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝 氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、〇 -N-甲基精 氨酸和其它相似的氨基酸和亚氨基酸（例如4-羟基脯氨酸）。在本文所用的多肽记号中， 左手方向为氨基末端方向，右手方向为羧基末端方向，与标准用法和习惯一致。
[0200] 同样地，除非另外说明，否则单链多核苷酸序列的左手端为5'端；双链多核苷酸 序列的左手方向被称为5'方向。将5'到3'方向添加新生RNA转录物称为转录方向；将具 有与RNA转录物相同序列且其5'为RNA转录物的5'端的DNA链上的序列区称为"上游序 列";将具有与RNA转录物相同序列且其3'为RNA转录物的3'端的DNA链上的序列区称为 "下游序列"。
[0201] 保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是 通过生物系统合成而引入。它们包括肽模拟物和其它逆向或反向形式的氨基酸部分。
[0202] 可基于常规侧链性质将天然存在的残基分类：
[0203] 1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ;
[0204] 2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ;
[0205] 3)酸性：Asp、Glu ;
[0206] 4)碱性：His、Lys、Arg ;
[0207] 5)影响链方向的残基：Gly、Pro ;和
[0208] 6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
[0209] 例如，非保守取代可涉及将这些类别之一的成员交换为另一类别的成员。所述被 取代的残基可例如引入到与非人抗体同源的人抗体的区域内，或引入到所述分子的非同源 区域内。
[0210] 根据某些实施方案，在改变抗原结合蛋白或PCSK9蛋白时，可考虑氨基酸的亲水 性指数（hydropathic index)。基于每种氨基酸的疏水性及电荷性质指定其亲水性指数。 它们是：异亮氨酸（+4.5);缬氨酸（+4.2);亮氨酸（+3.8);苯丙氨酸（+2.8);半胱氨酸/ 胱氨酸（+2.5);甲硫氨酸（+1.9);丙氨酸（+1.8);甘氨酸（-0.4);苏氨酸（-0.7);丝氨酸 (-〇. 8);色氨酸（-〇. 9);酪氨酸（-1. 3);脯氨酸（-1. 6);组氨酸（-3. 2);谷氨酸（-3. 5);谷 氨酰胺（-3. 5);天冬氨酸（-3. 5);天冬酰胺（-3. 5);赖氨酸（-3. 9);和精氨酸（-4. 5)。
[0211] 氨基酸亲水性指数在赋予蛋白相互作用生物学功能中的重要性为本领域所了解。 Kyte等，J. Mol. Biol.，157:105-131 (1982)。已知某些氨基酸可取代具有相似亲水性指数 或分值的其它氨基酸而仍保留相似的生物学活性。在某些实施方案中，在基于亲水性指数 进行改变时，包括亲水性指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括在±1内 的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括±0. 5内的氨基酸的取代。
[0212] 本领域还了解，可基于亲水性进行相似氨基酸的有效取代，尤其是当藉此形成的 生物学功能蛋白或肽意欲用于如本例子一样的免疫学实施方案时。在某些实施方案中， 由其邻接的氨基酸的亲水性所决定的蛋白的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性 (即蛋白的生物学特性）相关。
[0213] 以下为给这些氨基酸残基分配的亲水性值：精氨酸（+3. 0);赖氨酸（+3. 0);天冬 氨酸（+3.0±1);谷氨酸（+3.0±1);丝氨酸（+0.3);天冬酰胺（+0.2);谷氨酰胺（+0.2); 甘氨酸（〇);苏氨酸（-0.4);脯氨酸（_0.5±1);丙氨酸（-0.5);组氨酸（-0.5);半胱氨 酸（-1.0);甲硫氨酸（-1.3);缬氨酸（-1.5);亮氨酸（-1.8);异亮氨酸（-1.8);酪氨酸 (-2.3);苯丙氨酸（-2.5)和色氨酸（-3.4)。在某些实施方案中，在基于相似的亲水值进行 改变时，包括亲水值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括在±1内的氨基酸 的取代，而在某些实施方案中，包括在±0. 5内的氨基酸的取代。人们还可基于亲水性由一 级氨基酸序列确定表位。这些区域也被称为〃表位核心区"。
[0214] 例示性氨基酸取代示于表1中
[0215] 表 1
[0216] 氨基酸取代
[0217]
【权利要求】
1. 分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1的氨基酸 序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。
2. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原 结合蛋白为LDLR非竞争性中和抗原结合蛋白。
3. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的中和抗原结合蛋白，其中所述抗原 结合蛋白为LDLR竞争性中和抗原结合蛋白。
4. 选择性结合PCSK9的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于100 pM的Kd结 合PCSK9。
5. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以 小于10 pM的Kd结合。
6. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以 小于5 pM的Kd结合。
7. 结合SEQ ID NO: 1的PCSK9蛋白的分离的抗原结合蛋白，其中在所述分离的抗原 结合蛋白与PCSK9蛋白变体之间的结合小于所述分离的抗原结合蛋白与SEQ ID NO: 1的 PCSK9蛋白之间的结合的50%。
8. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述变体 PCSK9蛋白包含选自SEQ ID NO: 1所示的以下位置的残基的至少一个突变：207、208、185、 181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、 521 和 554。
9. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述至少一 个突变选自 R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、 A413R 和 E582R。
10. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的分离的人抗原结合蛋白，其中所述至少 一个突变选自 D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R 和 Q554R。
11. 以第一种方式结合SEQ ID NO: 303的PCSK 9蛋白的抗原结合蛋白，其中所述抗原 结合蛋白以第二种方式结合PCSK9变体，其中所述PCSK9变体具有在选自SEQ ID NO: 303 的以下位置处的至少一个点突变：207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、 582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521 和 554,其中所述第一种方式包含第一 EC50、第一 Bmax或第一 EC50和第一 Bmax，其中所述第二种方式包含第二EC50、第二Bmax 或第二EC50和第二Bmax，其中所述第一种方式的值不同于所述第二种方式的值。
12. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一种方式 包含第一 EC50,其中所述第二种方式包含第二EC50,其中所述点突变选自：R207E、D208R、 E181R, R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R 和 E582R。
13. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 EC50与所 述第二EC50至少有20%不同。
14. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 EC50与所 述第二EC50至少有50%不同。
15. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二EC50在数 值上大于所述第一 EC50。
16. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 EC50由多 元珠粒结合测定来测定。
17. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二EC50大于 I uM。
18. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白 为中和抗原结合蛋白。
19. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述中和抗原结合 蛋白为竞争性中和抗原结合蛋白。
20. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述中和抗原结合 蛋白为非竞争性中和抗原结合蛋白。
21. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一种方式包 含第一 Bmax，其中所述第二种方式包含不同于所述第一 Bmax的第二Bmax，并且其中所述 PCSK9变体具有选自以下的至少一个点突变：D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、 D313R、D337R、R519E、H521R 和 Q554R。
22. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第二Bmax为所 述第一 Bmax的约10%。
23. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 Bmax与所 述第二Bmax相差至少20%。
24. 本文要求保护的抗原结合蛋白中任一种的抗原结合蛋白，其中所述第一 Bmax与所 述第二Bmax相差至少50%。
25. 分离的抗体，所述分离的抗体在与LDLR结合PCSK9的位点重叠的位点处结合 PCSK9。
26. 中和抗体，所述中和抗体结合PCSK9并降低PCSK9对低密度脂蛋白受体（LDLR)的 降低LDLR的作用。
27. 中和抗体，所述中和抗体结合PCSK9,其中所述抗体在SEQ ID NO: 3的31-447位 残基内的位点处结合PCSK9。
28. 权利要求27的抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO: 3的31-447位残基内的表位。
29. 药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-28中任何一项的至少一种抗原结合 蛋白和可药用赋形剂。
30. 编码权利要求1-28中任一项的抗原结合蛋白的核酸分子。
31. 制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列 的PCSK9蛋白，其中所述抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用，所述方法包 括： 提供包含编码所述抗原结合蛋白的核酸序列的宿主细胞；和 使所述宿主细胞保持在其中表达所述抗原结合蛋白的条件下。
32. 降低受治疗者血清胆固醇水平的方法，所述方法包括给予所述受治疗者有效量的 分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的 PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的作用。
33. 用于治疗或预防与患者中的高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法包括 给予需要治疗或预防的患者有效量的分离的中和抗原结合蛋白，所述中和抗原结合蛋白结 合包含SEQ ID NO: 1氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对 LDLR的降低LDLR的作用。
34. 用于治疗或预防与受治疗者中的高血清胆固醇水平有关的病症的方法，所述方法 包括给予需要治疗或预防的受治疗者有效量的分离的中和抗原结合蛋白，并同时或序贯地 给予提高LDLR蛋白的利用率的药剂，其中所述分离的抗原结合蛋白结合包含SEQ ID NO: 1 氨基酸序列的PCSK9蛋白，其中所述中和抗原结合蛋白降低PCSK9对LDLR的降低LDLR的 作用。
35. 权利要求31-34中任一项的方法，其中所述提高LDLR蛋白的利用率的药剂包括他 汀。
36. 权利要求31-35中任一项的方法，其中所述他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟 伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀及它们的某些组 合。
37. 权利要求1-22的抗原结合蛋白在制备用于降低血清胆固醇的药物中的用途。
38. 权利要求1-22的抗原结合蛋白在制备用于治疗或预防与受治疗者中的高血清胆 固醇水平有关的病症的药物中的用途。
【文档编号】A61P3/06GK104311665SQ201410218672
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2008年8月22日 优先权日:2007年8月23日
【发明者】S.M.杰克逊, N.P.C.沃克, D.E.皮佩尔, 单倍, 沈文彦, J.C.Y.陈, C.T.金, R.R.克彻姆, C.梅林, T.A.卡拉贝奥, 曹琼 申请人:安姆根有限公司