一种小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物工程【技术领域】的一种建立小鼠急性移植物抗宿主病模型的方法。本发明的方法通过采用高龄C57BL/6雄性小鼠(18周)作为供鼠，分离其脾脏和骨髓细胞，经尾静脉注入给γ射线照射过的8-10周龄的BALB/c雄性小鼠，达到高效建立小鼠急性移植物抗宿主病模型的目的。本发明方法通过选择高周龄的供鼠，提高了小鼠aGVHD的建模成功率，使病理改变更加典型，并缩短了成模时间。本发明的方法操作简单、方便实用，成模效率高(可100％成模)、所得到的小鼠急性移植物抗宿主模型病理表现典型、成模时间短(7天)。
【专利说明】一种小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立方法。
【背景技术】
[0002]异基因造血干细胞移植为恶性血液病提供了根治手段，但其主要并发症急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease, aGVHD)的发生仍然是影响移植后患者生存率及生活质量的主要因素。但是，基于人体的研究受到医学伦理学的限制，目前，aGVHD具体机制的阐明和治疗方法的探索很大程度上依赖于动物模型。
[0003]小鼠作为一种常用的研究动物，具有繁育速度快，饲养成本低，便于基因操作等优点，所以，小鼠是建立aGVHD动物模型的上佳选择。但是，现有的小鼠aGVHD动物模型存在成模率低，病理损害不明显，成模时间长等不足，这些因素制约了造血干细胞移植领域的研究。影响aGVHD建模的因素较多，如受鼠和供鼠的主要组织相容性抗原的匹配关系，输注的骨髓细胞数量，输入的淋巴细胞数量等。因此，如何克服不利因素，利用有利因素，高效地建立小鼠aGVHD模型，并且使模型表现贴近临床病理改变，使成模时间缩短是相关领域的重要技术问题之一。
[0004]根据临床移植病人资料统计的结果以及发明人在相关领域的研究基础，发明人发现:在性别、年龄、血 加 贴近临床。由此，本发明选用近交系2周龄、10周龄、18周龄3种不同周龄的C57BL/6BL/6小鼠作为供鼠，发现均可成功建立aGVHD模型。然而，有意义的是，发明人研究发现随着供鼠周龄的增加，受鼠aGVHD的发生率显著增加，并且受鼠的成模时间缩短，靶器官病理损害更加典型。进一步进行机制研究发现:高龄供鼠的脾脏中含有更多具有促进免疫作用的⑶4+⑶69+T淋巴细胞和⑶Ilc+⑶Ia+的成熟树突状细胞，骨髓中含有更少的⑶34+⑶117+的造血干细胞。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立方法。
[0006]一种小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立方法，包括以下步骤:
[0007](I)选择18周的C57BL/6雄性小鼠作为供鼠；
[0008](2)选择8-10周的BALB/c雄性小鼠作为受鼠；
[0009](3)将获自供鼠的骨髓细胞和脾细胞，注射至经过Y射线照射过的受鼠。
[0010]所述受鼠移植前4~5h，接受6ciCo Y全身照射7.5Gy，剂量率为1.65Gy/min。
[0011]注射给受鼠的骨髓细胞为I X 107，脾细胞为1X107。
[0012]所述骨髓细胞和脾细胞分别为去除了红细胞的骨髓和脾脏有核细胞。
[0013]本发明方法通过选择更高周龄(18周)的供鼠，从而给受鼠输入了更多的促进免疫功能的⑶4+⑶69+T淋巴细胞和⑶I Ic+⑶Ia+的成熟树突状细胞，更少的⑶34+⑶117+的造血干细胞。从而提高了小鼠aGVHD的建模成功率，使病理改变更加典型，并缩短了成模时间。本发明的方法操作简单、方便实用，成模效率高(可100%成模)、所得到的小鼠急性移植物抗宿主模型病理表现典型、成模时间短(7天)。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为正常对照鼠(Al，A2)，分别接受了 2周(BI，B2)，8周(Cl，C2)和18周(Dl, D2)供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的外观表现。
[0015]图2为正常对照鼠(A)，只接受了照射组(B)，接受了 2周(C)，8周⑶和18周(E)供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的体重情况。
[0016]图3为正常对照鼠(A)，只接受了照射组(B)，接受了 2周(C)，8周⑶和18周(E)供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的生存率情况情况。
[0017]图4为正常对照鼠(A)，分别接受了 2周⑶，8周(C)和18周⑶供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的肝脏病理损害情况。
[0018]图5为正常对照鼠(A)，分别接受了 2周⑶，8周(C)和18周⑶供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的肺脏病理损害情况。
[0019]图6为正常对照鼠(A)，分别接受了 2周⑶，8周(C)和18周⑶供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的脾脏病理损害情况。
[0020]图7为正常对照鼠(A)，分别接受了 2周⑶，8周(C)和18周⑶供鼠来源的骨髓和脾脏细胞后，受鼠的结肠病理损害情况。
[0021]图8为2周(A)，8周⑶和18周(C)供鼠脾脏细胞中含有的⑶4+⑶69+T淋巴细胞比例。
[0022]图9为2周㈧，8周⑶和18周(C)供鼠脾脏细胞中含有的⑶Ilc+⑶Ia+的成熟树突状细胞比例。
[0023]图10为2周(A)，8周(B)和18周(C)供鼠骨髓细胞中含有的CD34+CD117+的造血干细胞比例。
【具体实施方式】
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0025]实施例1
[0026]一、供鼠和受鼠的准备
[0027]8-10周龄清洁级雄性BALB/c小鼠，体重21~23g ；2周龄清洁级C57BL/6雄性小鼠，体重4~5g ;10周龄清洁级C57BL/6雄性小鼠，体重20~23g ；18周龄清洁级C57BL/6雄性小鼠,体重26~28g，均购于北京维通利华动物中心。将8-10周龄清洁级雄性BALB/c小鼠作为受鼠，置于军事医学科学院实验动物中心二级动物房饲养，饲料及饮水经灭菌处理，移植前4~5h，受鼠BALB/c小鼠接受60Co Y全身照射7.5Gy，剂量率为1.65Gy/min。C57BL/6雄性小鼠作为供鼠。
[0028]二、供鼠骨髓细胞及脾细胞的制备及输入方法
[0029]无菌取C57BL/6小鼠胫骨及股骨，用a -MEM培养基冲洗骨髓腔，离心，裂解红细胞并洗涤制备成移植用的有核细胞悬液，调整细胞密度为4 X IOVml。取C57BL/6小鼠的脾脏，经研磨过滤后，用淋巴细胞分离液(天津灏洋公司生产)分离单个核细胞，PBS洗涤后调整细胞密度为4X 107/ml。受者组小鼠从尾静脉注射给予C57BL/6小鼠的骨髓细胞(IX IO7)和脾细胞(1X107)，对照组小鼠不予处理。实验分组见表1。
[0030]表1动物分组
[0031]
【权利要求】
1.一种小鼠急性移植物抗宿主病模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选择18周的C57BL/6雄性小鼠作为供鼠； (2)选择8-10周的BALB/c雄性小鼠作为受鼠； (3)将获自供鼠的骨髓细胞和脾细胞，注射至经过Y射线照射过的受鼠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受鼠移植前4~5h，接受6tlCoY全身照射7.5Gy，剂量率为1.65Gy/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，注射给受鼠的骨髓细胞为1X107，脾细胞为 1X107.
【文档编号】A61K35/28GK103989708SQ201410226936
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】张毅, 朱恒, 唐博, 李喜梅, 褚亚男, 刘元林 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所