利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，该方法包括以下步骤：1）分离SKPs；2)将分离得到的SKPs移入扩增培养基中进行扩增；3)SKPs的DiI荧光染料标记；4）制备组织工程皮肤，将胶原海绵打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵Co60照射灭菌，SKPs细胞1×105个/20—30uL培养基加于海绵糙面上，进行培养。本发明的组织工程皮肤中的SKPs可分化为平滑肌细胞、血管内皮细胞、神经组织，分化出的平滑肌细胞、血管内皮细胞可参与构成血管结构，促进创口新生血管形成，从而提高皮肤愈合速度及愈合质量。
【专利说明】利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程皮肤制备【技术领域】，尤其是涉及一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病难治性皮肤损伤(如:糖尿病足)是糖尿病常见的慢性并发症之一，是糖尿病患者致残、致死的主要原因。其高发病率、高致残率、难治疗性、高医疗费用等，使得糖尿病患者的生活质量严重下降，给患者及社会带来沉重的经济负担。糖尿病难治性皮肤损伤的临床常规治疗手段包括控制血糖，改善患者的营养状况，改善局部供血，抗感染，促进外周神经的功能恢复，加强护理，清创术，皮肤移植术等，但治疗效果通常欠佳，目前的治疗重点仍是避免截肢。因此必须寻找更为有效的治疗方法。
[0003]目前，组织工程化皮肤已经成为一种较完善的组织工程化组织，并初步应用于临床，为皮肤缺损的修复提供了新的方法，但仍存在诸多问题，如:不存在血管、黑色素细胞等组织成分，不能重建皮肤附属器结构，机械性能与正常在体皮肤有较大差距等。
[0004]干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞，具有分化为多种组织类型的潜能。近年来，干细胞作为种子细胞治疗糖尿病难治性皮损已成为新的研究热点。研究证明，ESC和MSC均能产生皮肤组织的构成元件，从而参与皮肤创伤的修复过程，这一特点可以弥补组织工程皮肤替代物的缺陷，提高皮肤的修复能力和愈合质量。但由于使用上述细胞所引发的相关伦理道德问题、移植后存在的致癌可能、细胞来源不足等问题的存在，使得临床应用大为受限，我们需要寻找新的种子细胞来避免上述问题。
[0005]2001年，Toma et al.从取自啮齿类动物新生个体及成年个体的皮肤真皮层中，分离获得了皮肤来源的祖细胞(skin-derived precursors, SKPs)。近年来的多项研究表明，SKPs是一种新型的、神经脊衍生的多能祖细胞，存在于哺乳动物真皮层中，在体外实验中，最终可产生神经系子代及中胚层子代。目前，具有SKPs性质的细胞也已经从不同年龄和起源的人类皮肤中分离获得，还能够从人类包皮中常规获得。因SKPs具有多潜能性，不论在正常生理更新或是损伤修复时，均可能分化参与构成皮肤真皮层的中胚层成分，包括真皮成纤维细胞、血管平滑肌细胞等。有研究表明，SKPs能够分化为血管平滑肌细胞，可能也具有形成内皮细胞的能力。
[0006]运用现有的SKPs应用于皮肤创面后，可分化为血管平滑肌及内皮细胞，从而促进创口新生血管形成，促进创面愈合。然而其愈合速度仍较慢，效果仍不够理想。如何寻找一种能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合的方法已成为目前亟待解决的问题，创面快速愈合对糖尿病皮肤损伤进行治疗的临床应用有着重要的意义，还可为DM慢性难愈创面的临床治疗带来极大帮助。
【发明内容】
[0007]本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合的利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的:一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，包括以下步骤:
[0009]I)、分离 SKPs
[0010]将皮肤样品放入无菌PB中，显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4°C消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分,保留真皮层组织；加入胶原酶37°C消化Ih ;吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次；
[0011]2)、SKPs 快速扩增
[0012]当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在扩增培养基中扩增培养；
[0013]3)、SKPs的DiI荧光染料标记
[0014]细胞悬液37°C培养箱中孵育5min后，与中浓度为3ug/ml DiI荧光染料孵育8min ；后用PBS洗3次，清 除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4°C保存；
[0015]4)、制备组织工程皮肤
[0016]胶原海绵预处理打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵，放入0.01M PBS中，排气；Co60照射灭菌，照射量20K ;超净台内铺板，紫外照射0.5h ;每孔300ul培养基，37°C培养箱中过夜；将海绵转移至另一孔板中；细胞I X 105个/20—30uL培养基加于海绵糙面；37°C培养箱中孵育4h，细胞贴壁；4h后，培养基200— 300uL/孔加入，37°C培养箱中孵育；1天后，换液一次，从海绵边缘吸液，接种细胞3天后移植。
[0017]优选的是，所述皮肤样品为表皮及真皮组织。
[0018]优选的是，所述皮肤样品为新生C57乳鼠背部皮肤。
[0019]优选的是，其中所述步骤I)的培养条件为37°C培养箱中培养。
[0020]优选的是，其中所述步骤2)中，所述扩增培养基为完全培养基；培养条件为37°C培养箱。
[0021]优选的是，其中所述步骤4)中，所述铺板方式为48孔板，糙面向上，糙面上铺细胞。
[0022]与现有技术相比，本发明具有如下优点:本发明的组织工程皮肤促进血管生长的数量为control组的2.95倍,是collagen组的1.68倍,其能够快速促进创口新生血管大量形成，促进创面快速愈合。其是糖尿病皮肤损伤进行治疗的有效手段，是DM慢性难愈创面的临床治疗的最佳选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为本发明制备出的组织工程皮肤；
[0025]图2为本发明试验I各实验组伤口愈合的比对图；[0026]图3为采用IPP6.0图像分析软件计算得出的各试验组伤口的收缩率图:
[0027]图4为镜下观察各试验组7天时的伤口愈合图；
[0028]图5为镜下观察各试验组14天时的伤口愈合图；
[0029]图6为skps+collagen组Nestin免疫突光SKPs存活染色图；
[0030]图7为skps+collagen组vWF新生血管染色图；
[0031]图8为skps+collagen组SMA平滑肌细胞染色图；
[0032]图9为skps+collagen组tubulin神经细胞染色图；
[0033]图10为skps+collagen组SMA+nestin新生血管与平滑肌细胞染色图；
[0034]图11 为 skps+collagen 组 vWF+nestin 新生血管染色图；
[0035]图12为各处理组14天时SMA新生血管染色图。
【具体实施方式】
[0036]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]实施例1:
[0038]l、SKPs的分离鉴定、标记
[0039]新生C57乳鼠断颈处死，背部去毛，剪下背部皮肤，放入无菌PBS中。
[0040]体式显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4°C消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分，保留真皮层组织；加入胶原酶37°C消化Ih ;吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次，该步骤的培养条件为37°C培养箱中培养。
[0041]2、SKPs快速扩增
[0042]当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在完全培养基中进行；培养条件为37 °C培养箱。
[0043]3、SKPs 的标记
[0044]细胞悬液37°C培养箱中孵育5min后，与终浓度为3ug/ml DiI荧光染料孵育8min。后用PBS洗3次，清除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4°C保存。
[0045]4、制备组织工程皮肤
[0046](I)胶原海绵预处理
[0047]a、大小:打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵,放入ο.0IM PBS中，排气；
[0048]b、Co60照射灭菌，照射量20K，(天津市物理研究所)。
[0049](2)胶原海绵铺板
[0050]a、超净台内铺板(48孔板，糙面向上，糙面上铺细胞)紫外照射0.5h ；
[0051]b、每孔3 00ul培养基，37°C培养箱中过夜。
[0052](3)胶原海绵铺细胞
[0053]a、将海绵转移至另一 48孔板中；
[0054]b、细胞I X 105个/20— 30uL培养基加于海绵糙面；[0055]c、37°C培养箱中孵育4h，细胞贴壁；
[0056]d、4h后，培养基200— 300uL/孔加入，37°C培养箱中孵育；
[0057]e、I天后，换液一次，从海绵边缘吸液，尽量不干扰细胞贴壁；
[0058]f、接种细胞3天后移植，组织工程皮肤见图1。
[0059]组成工程皮肤样品的制作处理
[0060]1、轻漂洗:37°C预热的PBS中轻柔漂洗联合培养物2—3minX3次。
[0061]2、固定
[0062](1)2.5%戊二醛 37°C培养箱中 2h。
[0063](2)换一次2.5%戊二醛后，2.5%戊二醛中4°C过夜。
[0064]3、梯度酒精脱水
[0065]
【权利要求】
1.一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程皮肤的方法，包括以下步骤: 1)、分离SKPs 将皮肤样品放入无菌PB中，显微镜下分离并弃去皮下组织，将表皮及真皮组织剪成小块放入dispase酶中，4°C消化过夜；第二天取出，分离并弃去表皮部分，保留真皮层组织；加入胶原酶37°C消化Ih ;吹打组织直至单细胞，用40um孔径细胞筛网过滤细胞；用完全培养基培养单细胞，每隔七天换液一次； 2)、SKPs快速扩增 当细胞形成克隆球并中间发暗时进行细胞传代，按1:2的比例进行传代，在扩增培养基中扩增培养； 3)、SKPs的DiI荧光染料标记 细胞悬液37°C培养箱中孵育5min后，与中浓度为3ug/ml DiI荧光染料孵育8min ;后用PBS洗3次，清除多余染料，重悬于生理盐水中，细胞计数备用，移植前细胞4°C保存； 4)、制备组织工程皮肤 胶原海绵预处理打孔器做出直径8mm圆形胶原海绵，放入0.01M PBS中，排气；Co60照射灭菌，照射量20K ;超 净台内铺板，紫外照射0.5h ；每孔300ul培养基，37°C培养箱中过夜；将海绵转移至另一孔板中；细胞I X 105个/20— 30uL培养基加于海绵糙面；37°C培养箱中孵育4h，细胞贴壁；4h后，培养基200— 300uL/孔加入，37°C培养箱中孵育；I天后，换液一次，从海绵边缘吸液，接种细胞3天后移植。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤I)中，所述皮肤样品为表皮及真皮组织。
3.如权利要求2所述的方法，所述皮肤样品为新生C57乳鼠背部皮肤。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤I)的培养条件为37°C培养箱中培养。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)中，所述扩增培养基为完全培养基；培养条件为37 °C培养箱。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤4)中，所述铺板方式为48孔板，糙面向上,糙面上铺细胞。
【文档编号】A61L27/60GK104001216SQ201410244591
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】柯亭羽, 孔德领 申请人:柯亭羽, 孔德领