一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物，该疫苗组合物含有猪流行性腹泻病毒亚单位抗原和载体；本发明还提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物，该疫苗组合物包括猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。本发明还公开了含该疫苗组合物的制备方法以及其在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。该疫苗组合物中的S1蛋白可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；当该疫苗组合物含S1蛋白及猪流行性腹泻全病毒灭活抗原时，比单独使用全病毒灭活抗原免疫时，免疫效果更优，能够有效预防猪流行性腹泻病毒变异株和普通株导致的疾病。CCTCC NO： V2013412013.09.16
【专利说明】一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品【技术领域】，具体涉及一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhoea, PED)是由猪流行性腹泻病毒 (porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起猪腹泻的一种重要急性、接触性、病毒性肠 道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世纪70年代发生在英 国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV可在猪群中持续存 在，各种年龄段的猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达1〇〇%，尤以哺乳仔猪 严重，病死率达100%。目前，还没有特效药物可抵抗PEDV，由于该病发病急，流行快，猪群 一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。
[0003] 中国于1980年首次分离到PEDV，以后许多地区相继报道有本病发生，并主要在 冬春季节散发，造成的危害巨大。从2010年至今，在我国华南、华北部分省份暴发了严 重的猪流行性腹泻，已超过100万只的猪死亡（Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China. Emerging infectious diseases, 2012, 18(1) :161-162)。猪流行性腹泻表现为呕吐、腹泻、脱水，可发生于任何年 龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率越高，特别地，7日龄内新生仔猪发生腹泻后3-4天，呈 现严重脱水而死亡，死亡率高达50%，最高的死亡率达100%。此外，最新的研究表明还可 能通过乳汁进行垂直传播。
[0004] 目前，对于该病的防控主要采取传统的灭活苗、弱毒苗免疫接种。弱毒苗免疫 存在潜在的生物风险，全病毒灭活疫苗病毒滴度低，导致抗原含量不足，有PEDV难以分 离培养，即使营养液中加入胰酶促使其在Vero细胞中繁殖传代，但病毒滴度只能维持在 1 X lO^TCID^/mL左右。如采用细胞浓缩的方法使杂蛋白含量增加从而造成副反应。因此， 如何解决疫苗免疫效果的问题是猪流行性腹泻本领域急需解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其应 用。该猪流行性腹泻疫苗组合物可有效预防和治疗猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹 泻病毒普通株导致的疾病。
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫 苗组合物包括猪流行性腹泻病毒亚单位抗原和载体，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原包 括猪流打性腹?与病毒S蛋白、S1蛋白、Μ蛋白、N蛋白。
[0007] 术语"猪流行性腹泻病毒亚单位抗原"是指具有免疫原性的猪流行腹泻病毒蛋白 片段，包括但不限于猪流行性腹泻病毒S蛋白、猪流行性腹泻病毒S1蛋白、猪流行性腹泻病 毒Μ蛋白、猪流行性腹泻病毒Ν蛋白的一种或两种混合物；所述"猪流行性腹泻病毒亚单位 抗原"优选为猪流行性腹泻病毒S1蛋白。优选地，所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻 病毒变异株。
[0008] 术语"猪流行性腹泻病毒S蛋白"是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为 纤突蛋白（spike蛋白），位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结 合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生 物学作用。该蛋白是由1384个氨基酸组成的多肽，含有27-29个潜在的糖基化位点，划分 为2个功能区即S1 (第1-789位氨基酸）和S2 (第790-1383位氨基酸）。
[0009] 术语"猪流行性腹泻病毒S1蛋白"位于猪流行性腹泻病毒S蛋白的功能区之一，由 789个氨基酸组成（任晓峰，贾文龙.猪流行性腹泻病毒S1蛋白截短表达及多抗制备.东 北农业大学学报，2013, 44(9) :46-50)。
[0010] 术语"猪流行性腹泻病毒Μ蛋白"是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为 膜蛋白（Membrane蛋白），是PEDV中含量最多的包膜蛋白，由226个氨基酸编码而成，有三 方面的生物学作用：参与病毒粒子的组装和出芽、刺激机体产生α-干扰素（α-IFN)、其产 生的抗体在不提存在时具有中和病毒的能力。
[0011] 术语"猪流行性腹泻病毒N蛋白"是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一，为 核衣壳蛋白（Nucleocapsid蛋白），由1326个核苷酸组成，编码441个氨基酸，是PEDV在感 染细胞中产生最多的病毒蛋白，结构十分保守。
[0012] 术语"猪流行性腹泻病毒变异株"是又称高致病性猪流行性腹泻病毒，包括但不限 于其S1蛋白具有与SEQ ID No. 1基本相同的核苷酸序列的PEDV。优选地，猪流行性腹泻病 毒变异株其S1蛋白具有与SEQ ID No. 1基本相同的核苷酸序列的PEDV。与SEQ ID No. 1基 本相同是指，PEDV的核苷酸序列优选包含与SEQ ID No. 1有85% -100%相同的序列，优选 在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述PEDV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的 CH/YNKM/2012相比，S1的核苷酸同源性低于91 %，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %。猪流行性腹泻病毒变异株核苷酸序列优选有超过80^^81^^82 %、 83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，与SEQIDNo.l相同，同样优选在猪流行性腹 泻病毒变异株并非本文所述PEDV的条件下，例如与作为参考病毒分离物的CH/YNKM/2012 相比，S1的核苷酸同源性低于91%，优选低于92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%。
[0013] 术语"同源性"是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。氨基酸序列或 核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算得到，例如，可以将目标 氨基酸（或核苷酸）序列与参比氨基酸（或核苷酸）序列进行序列比对，必要时可以引入 空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核苷酸）数目达到最优化，并在此基础上计 算两条氨基酸（或核苷酸）序列之间相同氨基酸（或核苷酸）的百分比。氨基酸（或核苷 酸）序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现，例如，但不限于，BLAST 软件（在美国国立生物技术信息中心％131的网址上可获得：111^口:/7131381:.11(313；[.111111.11；[11· gov/Blast. cgi，或者见，例如，Altschul S.F. et al，J. Mol. Biol.，215 :403-410(1990); St印hen F. et al，Nucleic Acids Res.，25 :3389-3402(1997)), ClustalW2 软件（在欧 洲生物信息研究所网址上可获得：http://www. eji. ac. uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例 如，Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266 :383-402(1996) ;Larkin M. A. et al, Bioinformatics (Oxford，England) ,23(21) :2947-8(2007));和 TCoffee 软件等（在瑞典 生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee. vital-it. ch/cgi-bin/Tcoffee/ tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，Nucleic Acids Res. ,31(13): 3503-6(2003) ;Notredame C.et al，J. Mol. Boil.，302(1) :205-17 (2000))。使用软件进行 序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数 进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
[0014] 优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列编码SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8或SEQ ID No. 10氨基酸序列；进一步优选地，所述猪流行性 腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列编码SEQ ID No. 2氨基酸序列。
[0015] 作为本发明的一种实施方式，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白为SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8或SEQ ID No. 10编码的至少一种蛋白；优选地，所述猪流 行性腹泻病毒S1蛋白为SEQ ID No. 2编码的蛋白。
[0016] 作为本发明的一种实施方式，优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的核苷酸序 列为 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7 或 SEQ ID No. 9，优选为 SEQ ID No. 1。
[0017] 优选地，所述猪流行性腹泻病毒SI蛋白的含量为0. 5-20 μ g/mL。
[0018] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物由猪流行性腹泻病毒S1蛋白 和兽医学上可接受的佐剂组成。
[0019] 本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫 苗组合物包括所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。
[0020] 优选地，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原为猪流行性腹泻病毒S1蛋白，其核苷 酸序列编码 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸序 列；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒HN1301株。
[0021] 猪流行性腹泻病毒 HN1301 株（Porcine epidemic diarrhea virus, strain HN1301)的保藏号为CCTCC NO. V201341，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为 中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。
[0022] 优选地，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的含量为0. 5-20 μ g/mL ;所述猪流行性腹 泻全病毒灭活抗原的含量为灭活前1X 1〇4_°-1 X 107_°TCID5(l/mL。
[0023] 优选地，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳 齐U、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl)衍 生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block c〇-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺 佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、MS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几 种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。
[0024] 优选地，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病 毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌 抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪 狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗 原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。
[0025] 术语"猪流行性腹泻全病毒灭活抗原"是指在动物细胞上培养猪流行性腹泻病毒， 然后经过灭活剂灭活所制备的抗原。优选地，所述动物细胞是Vero细胞。
[0026] 优选地，所述"猪流行性腹泻全病毒灭活抗原"为猪流行性腹泻病毒变异株的灭活 抗原。
[0027] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物由猪流行性腹泻病毒S1蛋白、 猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和兽医学上可接受的佐剂组成。
[0028] 术语"佐剂"可包括错胶佐剂；阜苷（saponin)，如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge ΜΑ)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals Incorporation, Birmingham AL);油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲 基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。
[0029] 术语"乳剂"可尤其基于轻液体石錯油（European Pharmacopea类型）；因烯经寡 聚产生的类异戊二烯油（isoprenoidoil)，如角藍烧（squalane)或角藍烯油（squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇 二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或 醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面 活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇（mannide)的酯（如无水甘露醇油酸酯）、脂肪族 二元醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂 酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯 嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》（Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等编写的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell Μ 和 Newman Μ 编写的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉（Plenum Press, 1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。
[0030] 术语"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物， 尤其是与糖（sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆（Carbomer， 商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8 (2))。本领域技术人员还可参见美国专利 US2909462,其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至 少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和 脂经基（aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯 基、烯丙基和其它烯属不饱和基团（ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团 自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，（BF Goodrich, Ohio, USA) 特别合适。它们与烯丙基鹿糖或与烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交联。这其 中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。
[0031] 术语"顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物"也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯 的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理 pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。
[0032] 术语"佐剂"还包括，但不限于，RIBI佐剂系统（Ribi Incorporation)、 Block co-polymer (CytRx，Atlanta GA)、SAF_M(Chiron，Emeryville CA)、单憐醜脂质 A(monophosphoryl lipidA)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素（重组或其 它）、霍乱毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。
[0033] 优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI 佐剂系统、Block c〇-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐 热肠毒素、霍乱毒素、MS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂 为铝胶佐剂。
[0034] 优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5 % -30 %，优选为20 %。
[0035] 本发明所用术语"猪流行性腹泻"与"PED"、"猪流行性腹泻病毒"与"PEDV"在本 发明中可互换使用。
[0036] 本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对。
[0037] 本发明的再一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述 方法包括：（1)克隆表达所述亚单位抗原；以及（2)按比例混合所述表达的所述亚单位抗原 和佐剂。
[0038] 优选地，克隆表达所述亚单位抗原为所述S1蛋白，其包括其核苷酸序列为编码 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸序列的序列。
[0039] 本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述 方法包括：（1)克隆表达所述亚单位抗原；(2)增殖培养所述猪流行性腹泻病毒，灭活；以及 (3)按比例混合所述表达的所述亚单位抗原和灭活的猪流行性腹泻全病毒抗原，加入佐剂。
[0040] 优选地，克隆表达所述亚单位抗原为所述S1蛋白，其包括其核苷酸序列为编码 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸序列的序列；所 述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒HN1301株。
[0041] 优选地，所述的克隆表达方法为采用杆状病毒表达系统表达。
[0042] 本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性 腹泻的药物中的应用。
[0043] 术语"预防和/或治疗"在涉及猪流行性腹泻病毒感染时是指抑制猪流行性腹泻 病毒的复制、抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒在其宿主体内定居， 以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/ 或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
[0044] 优选地，所述猪流行性腹泻包括由猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹泻病毒 普通株导致的猪流行性腹泻。
[0045] 本发明所用术语"猪"是指任何属于猪科（Suidae)成员的动物，如猪。
[0046] 本发明具有以下突出的优点：
[0047] (1)所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表 达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；
[0048] (2)所述疫苗组合物含有免疫原性蛋白及猪流行性腹泻全病毒灭活抗原时，比单 独使用全病毒灭活抗原免疫时，效果更好。
[0049] (3)疫苗保护范围广，可以预防和治疗由猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹 泻病毒普通株导致的猪流行性腹泻。
[0050] 序列表中：
[0051] 序列1为猪流行性腹泻病毒Sla蛋白的核苷酸人工序列；
[0052] 序列2为猪流行性腹泻病毒Sla蛋白的氨基酸人工序列；
[0053] 序列3为猪流行性腹泻病毒CH/YNKM/2012株S1蛋白的核苷酸序列；
[0054] 序列4为猪流行性腹泻病毒CH/YNKM/2012株S1蛋白的氨基酸序列；
[0055] 序列5为猪流行性腹泻病毒SD-M株S1蛋白的核苷酸序列；
[0056] 序列6为猪流行性腹泻病毒SD-M株S1蛋白的氨基酸序列；
[0057] 序列7为猪流行性腹泻病毒⑶S03株S1蛋白的核苷酸序列；
[0058] 序列8为猪流行性腹泻病毒⑶S03株S1蛋白的氨基酸序列；
[0059] 序列9为猪流行性腹泻病毒CH4株S1蛋白的核苷酸序列；
[0060] 序列10为猪流行性腹泻病毒CH4株S1蛋白的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0061] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0062] 本发明实施例中所采用猪流行性腹泻全病毒毒株为HN1301株（Porcine印idemic diarrhea virus, strain HN1301)，该毒株的保藏号为CCTCC NO. V201341，保藏单位为中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2013年9月16日。
[0063] 本发明实施例中所采用猪流行性腹泻攻毒毒株为HN1301株或沪毒株，其中，沪毒 株已在中国专利CN101117627A中公开，农业部公告270号文件中将该毒株作为猪流行性腹 泻普通株CV777株的效检用强毒株。
[0064] 本发明实施例中所用的pH7. 2PBS液配方为：1000mL蒸馏水中加入NaC19g、 Na2HP04 · 12H206g、NaH2P04 · 2H200. 4g，本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集 团。
[0065] 本发明实施例以体积比为20%的铝胶佐剂制备猪流行性腹泻疫苗组合物为例进 行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0066] 本发明实施例中所用的猪流行性腹泻全病毒灭活抗原含量以灭活前 1 X 105_°TCID5(l/mL为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限 定。
[0067] 本实施例中猪流行性腹泻发病的判定标准为：厌食、通常黄色或浅黄色水样腹泻， 部分仔猪伴有呕吐、寒颤、脱水等症状，在临床观察的5-6日之内可能有部分仔猪脱水后死 亡。发病程度可能轻重不同，但判定发病最基本的、也是不可少的条件是腹泻。
[0068] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述 的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途 径获得。
[0069] 实施例1猪流行性腹泻病毒S1蛋白的制备、鉴定及含量测定
[0070] 1. 1猪流行性腹泻病毒Sla蛋白的制备、鉴定及含量测定
[0071] 1. 1. 1重组载体Bacmid-Sla的构建
[0072] 根据猪流行性腹泻病毒S1蛋白核苷酸序列（见序列表SEQ ID No. 1)，采用人工合 成的方法，由上海生物工程有限公司合成，所合成的基因片段全长为2367bp。在此人工合成 S1基因片段的基础上制备S1蛋白的模板。
[0073] 以前一步骤所合成的S1全长基因片段用做PCR反应的模板，设计一对特异性引 物，并分别在上下游添加 Xhol、PstI酶切位点，引物序列如下：
[0074] Sla-Pl :5' GCTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3'，
[0075] Sla-P2 :5' GGGCTGCAGTCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3'。
[0076] 运用PCR扩增S1片段，将扩增后的片段命名为Sla。PCR扩增条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，35 个循环，72°C延伸 5min。
[0077] 将扩增产物使用1 %琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物使用DNA凝胶回收试剂盒回 收后，将目的基因片段连接至pGEM-Τ载体，并转化DH5 α感受态细胞，酶切鉴定后，将阳性 质粒测序，测序正确的质粒命名为pGEM-T-Sla。Sla的测序结果如序列表SEQ ID No. 1所示。
[0078] 重组pFastbac I-Sla的构建：将pGEM-T-Sla、pFastbac I同时进行双酶切，酶切 产物进行电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒回收相应的Sla、pFastbac I片段。将回收的Sla、 pFastbac I片段使用T4DNALigase进行连接，连接产物转化入DH5a感受态细胞。将含有充 足质粒的DH5 a感受态细胞进行培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定， 同时将酶切鉴定正确的质粒进行测序，测序正确的重组质粒命名为pFastbac I-Sla。Sla的 测序结果如序列表SEQ ID No. 1所示。
[0079] 重组穿梭载体Bacmid-Sla的构建：将上述构建的pFastbac I-Sla质粒转化 DHlOBac感受态细胞，转化细胞接种于含有三抗的LB固体培养基，同时进行蓝白斑筛选。挑 取白斑接种于含三抗的LB液体培养基进行培养。收获菌液，使用质粒提取试剂盒提取质 粒，并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒命名为Bacmid-Sla。
[0080] 1. 1. 2Bacmid_Sla质粒的转染、表达及鉴定
[0081] Bacmid-Sla质粒转染Sf9昆虫细胞：在6孔细胞板培养Sf9细胞，转染Bacmid-Sla 质粒，观察转染细胞生长状态，并换液，至细胞出现病变时，收集上清，4°C避光保存。并按照 0. 1M. 0. I进行F2代、F3代的扩增。
[0082] Sla蛋白的表达：将收获的F3代按2-5M. 0. I的体积比接种Sf9细胞进行悬浮 培养，分别置于液氮、37°C水浴中反复冻融2-3次，离心，去除细胞碎片，将所获上清进行 SDS-PAGE电泳，同时添加0. 1%甲醛于所获上清并置37°C灭活6h，电泳结果表明：相对于对 照，在相应位置出现目的蛋白。并进行Western blot鉴定，结果标明：所获得的Sla蛋白能 与猪抗PEDV阳性血清反应。
[0083] 1. 1. 3Sla蛋白含量的测定
[0084] 将上述获得的上清，使用硫酸铵法沉淀，离心后，沉淀使用PBS重悬，并测定蛋白 浓度。将Sla蛋白使用SDS-PAGE进行电泳，分别取梯度稀释后浓度为500、375、187. 5、 93. 75、46. 875μ g/mL的牛血清白蛋白（BSA)标准品同步进行电泳。SDS-PAGE电泳后，使用 考马斯亮蓝染色，脱色后使用扫描仪扫描。使用Alph-Imag er?3400软件对电泳图像进行定 量分析，以BSA标准品建立回归曲线，计算重组Sla蛋白的浓度，将测定的重组Sla蛋白稀 释至 100 μ g/mL。
[0085] 1. 2猪流行性腹泻病毒Sib蛋白的表达、鉴定及含量测定
[0086] 1. 2. 1重组载体Bacmid-Slb的构建
[0087] S1 基因的克隆及pMD18_T_Sl 载体的构建:根据 NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)中报道的PEDVCH/YNKM/2012株（登录号为JX018180. 1)中SI蛋白的基因序列（见序 列表SEQ ID No. 3)设计一对特异性引物，并分别在上下游添加 Xhol、PstI，引物序列如下：
[0088] Slb-Pl:5' GCTTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3'，
[0089] Slb-P2 :5' GGGCTGCAGCCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3'。
[0090] 运用PCR扩增S1片段，将扩增后的片段命名为Sib。PCR扩增条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，35 个循环，72°C延伸 5min。
[0091] 将扩增产物使用1 %琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物使用DNA凝胶回收试剂盒回 收后，将目的基因片段连接至pGEM-Τ载体，并转化DH5 α感受态细胞，将阳性质粒测序，测 序正确的质粒命名为pGEM-T-Slb。Sib的测序结果如序列表SEQ ID No. 3所示。
[0092] 重组pFastbac I-Slb的构建：将pGEM-T-Slb、pFastbac I同时进行双酶切，酶切 产物进行电泳，使用DNA凝胶回收试剂盒回收相应的Sla、pFastbac I片段。将回收的Sib、 pFastbac I片段使用T4DNALigase进行连接，连接产物转化入DH5a感受态细胞。将含有充 足质粒的DH5 a感受态细胞进行培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切鉴定， 同时将酶切鉴定正确的质粒进行测序，测序正确的重组质粒命名为pFastbac I-Slb。Sib的 测序结果如序列表SEQ ID No. 3所示。
[0093] 重组穿梭载体Bacmid-Slb的构建：将上述构建的pFastbac I-Slb质粒转化 DHlOBac感受态细胞，转化细胞接种于含有三抗的LB固体培养基，同时进行蓝白斑筛选。挑 取白斑接种于含三抗的LB液体培养基进行培养。收获菌液，使用质粒提取试剂盒提取质 粒，并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒命名为Bacmid-Slb。
[0094] 1. 2. 2Bacmid_Slb质粒的转染、表达及鉴定
[0095] Bacmid-Slb质粒转染Sf9昆虫细胞：在6孔细胞板培养Sf9细胞，转染Bacmid-Slb 质粒，观察转染细胞生长状态，并换液，至细胞出现病变时，收集上清，4°C避光保存。并按照 0. 1M. 0. I进行F2代、F3代的扩增。
[0096] Sib蛋白的表达：将收获的F3代按2-5M. 0. I的体积比接种Sf9细胞进行悬浮 培养，分别置于液氮、37°C水浴中反复冻融2-3次，离心，去除细胞碎片，将所获上清进行 SDS-PAGE电泳，同时添加0. 1 %甲醛于所获上清置37°C灭活6h，电泳结果表明：相对于对 照，在相应位置出现目的蛋白。并进行Western blot鉴定，结果标明：所获得的Sib蛋白能 与猪抗PEDV阳性血清反应。
[0097] 1. 2. 3Slb蛋白含量的测定
[0098] 将上述获得的上清，使用硫酸铵法沉淀，离心后，沉淀使用PBS重悬，并测定蛋白 浓度。将Sib蛋白使用SDS-PAGE进行电泳，分别取梯度稀释后浓度为500、375、187. 5、 93. 75、46. 875μ g/mL的牛血清白蛋白（BSA)标准品同步进行电泳。SDS-PAGE电泳后，使用 考马斯亮蓝染色，脱色后使用扫描仪扫描。使用Alph-Imag er?3400软件对电泳图像进行定 量分析，以BSA标准品建立回归曲线，计算重组Sib蛋白的浓度，将测定的重组Sib蛋白稀 释至 100 μ g/mL。
[0099] 1. 3猪流行性腹泻病毒Sic、Sid、Sle蛋白的表达及鉴定
[0100] 根据 NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)中报道的 SD_M 株、GDS03 株、CH4 株 (登录号依次为JX560761. 1、AB857235. 1、JQ239432. 1)中S1蛋白的基因序列（依次见序 列表 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9)，分别按照实施例 L 2 中 L 2. 1 至 L 2. 2 部分 所述的方法构建重组载体，并对其进行转染、表达及鉴定，将表达后鉴定正确的蛋白依次命 名为Slc、Sld、Sle蛋白。
[0101] 按照实施例1. 2中1. 2. 3部分所述的方法对表达、鉴定后的Sic蛋白进行含量测 定，将测定后重组的Sic、Sid、Sle各蛋白均稀释至100 μ g/mL。
[0102] 实施例3猪流行性腹泻病毒疫苗组合物的制备
[0103] 3. 1猪流行性腹泻病毒亚单位抗原的制备
[0104] 使用pH7. 2PBS将实施例1制备的重组蛋白Sla、Slb、Slc、Sld、Sle分别进行稀释， 并加入铝胶佐剂充分混匀，使疫苗组合物中的重组蛋白Sla、Sib、Sic、Sid、Sle的含量如表 1所示，同时保证铝胶佐剂与疫苗组合物的体积比为1:5。将制备好的疫苗组合物作为免疫 原，于4°C保存备用。
[0105] 3. 2猪流行性腹泻全病毒灭活抗原的制备
[0106] 将PEDV HN1301株病毒液使用pH7. 2PBS稀释，将稀释病毒液按3 % (体积比） 接种量接种长满致密单层的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞，购自上海生化所），置于37 °C、 5% C02培养箱中静置培养48-72h。当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达 80% -90%时，反复冻融后收获,收获病毒液置-20°C保存。将收获的病毒液取样测定病毒 含量，病毒含量彡107 5TCID5(l/mL合格。将检验合格的病毒液以3000rpm离心lOmin，上清 按0. 1 %体积比加入甲醛溶液，置37°C灭活12h，并进行灭活检验。将检验合格的病毒液于 4°C保存。
[0107] 将检验合格的病毒液用PBS稀释，并与铝胶佐剂混合，使其与疫苗组合物的体积 比为1:5,以制备猪流行性腹泻灭活疫苗（疫苗I)，使所制备的疫苗中抗原的病毒含量为灭 活前lX10 5_°TCID5(l/mL(见表1)。将制备好的疫苗组合物作为免疫原，于4°C保存备用。
[0108] 3. 3猪流行性腹泻病毒亚单位抗原与全病毒灭活抗原疫苗组合物的制备
[0109] 同时制备猪流行性腹泻病毒亚单位抗原与全病毒灭活抗原的疫苗组合物，其组成 如表1疫苗Η所示，同时保证错胶佐剂与疫苗组合物的体积比为1:5。将制备好的疫苗组合 物作为免疫原，于4°C保存备用。
[0110] 表1猪流行性腹泻疫苗组合物所含组分及比例 [0111]
【权利要求】
1. 一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括猪流行性腹泻病 毒亚单位抗原和载体；其中，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原包括猪流行性腹泻病毒S 蛋白、S1蛋白、Μ蛋白、N蛋白。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白核 苷酸序列编码 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8 或 SEQ ID No. 10 氨基酸 序列；优选地，所述猪流行性腹泻病毒SI蛋白核苷酸序列编码SEQ ID No. 2氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S1蛋白的 含量为 0. 5-20μ g/mL。
4. 一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1-2任 一项所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。
5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗 原为猪流行性腹泻病毒S1蛋白，其核苷酸序列编码SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8或SEQ ID No. 10氨基酸序列；所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流 行性腹泻病毒HN1301株。
6. 根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒S1 蛋白的含量为〇. 5-20 μ g/mL ;所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原的含量为灭活前 lX104cl-lX107CITCID5(l/mL。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述载体包括佐剂，所 述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯 酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block c〇-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒 素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种；优选地，所述佐剂为铝胶佐剂。
8. 根据权利要求1-6任一项所述疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括其 他抗原，所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌 抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病 毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。
9. 一种制备权利要求1-3所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 克隆表达所述亚单位抗原；以及 (2) 按比例混合所述表达的亚单位抗原和佐剂。
10. -种制备权利要求4-6所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 克隆表达所述亚单位抗原； (2) 增殖培养所述猪流行性腹泻病毒，灭活；以及 (3) 按比例混合所述表达的亚单位抗原和灭活的猪流行性腹泻全病毒抗原，加入佐剂。
11. 权利要求1-6任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药 物中的应用。
【文档编号】A61K39/215GK104248762SQ201410290911
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】张许科, 孙进忠, 王莹, 王延辉, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司