人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物的应用。提高皮肤表皮祖细胞活性和成纤维细胞活性，促进细胞增殖，促进胶原纤维蛋白分泌，减少基质金属蛋白酶表达，对于皮肤创伤愈合和损伤组织修复具有十分重要的作用。寻找一种能提高皮肤表皮祖细胞和成纤维细胞活性，促进胶原纤维蛋白分泌，减少基质金属蛋白酶表达的物质，能有效加快皮肤创伤愈合和损伤组织修复。首先培养皮肤角质祖细胞(KPCs)和人皮肤成纤维细胞(HDFs)，然后试用不同剂量人参皂苷Rd，利用MTT、流式细胞术、RT-PCR和Western?blot等实验方法，证实人参皂苷Rd处理后KPCs和HDFs细胞活性增强，I-型胶原纤维蛋白分泌增加，MMP1表达减少；有促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的功能。利用人参皂苷Rd开发为一种促进皮肤创伤愈合和组织修复的新药。
【专利说明】人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药 物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合 和损伤组织修复药物的应用。
【背景技术】
[0002] 加快皮肤创伤愈合和损伤组织修复是一个古老的医学课题，其中，加快皮肤创伤 愈合是外科学研究中的热点。创伤愈合和组织修复是各种修复细胞增殖、分化、迁移、凋亡 的过程，也是多种细胞因子相互作用的过程。研制促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的药 物，对提高组织自我修复能力，缩短创伤愈合时间，增强机体活力有重要意义。
[0003] 在创伤愈合组织修复过程中，（1)免疫细胞炎症反应是创伤愈合和组织修复的基 础。虽然炎症反应不直接参与创伤愈合和组织修补，但是，它能通过调节多种细胞因子分 泌，增强免疫细胞活性和功能，产生氧自由基和释放溶酶体，清除坏死组织和异物，防止感 染发生，为创伤愈合修复细胞的活动创造条件。（2)成纤维细胞和细胞外基质对创伤愈合和 组织修复起主要作用。成纤维细胞是构成肉芽组织的主要细胞成分之一，能合成和分泌胶 原、纤维连接蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和透明质酸等多种细胞外基质。细胞外基质对细胞 的形态、细胞的生长和分化有重要调节功能。（3)内皮细胞和新血管为创伤愈合和组织修复 提供保障。内皮细胞是形成毛细血管的主要细胞，为创伤组织提供足够的氧和营养物质，保 证创伤愈合。内皮细胞还能分泌多种细胞因子，参与创伤组织的修复与调控。（4)角质细胞 活化和上皮再生对创伤愈合和组织修复有重要作用。创伤愈合是由上皮组织中角质形成细 胞的迁移来完成，使暴露的创伤重新被上皮覆盖，角质形成细胞能通过分泌细胞因子，直接 或间接参与创伤修复与调控。
[0004] 总之，（1) (3)为创伤愈合和损伤组织修复提供基础条件，⑵⑷是创伤愈合和损 伤组织修复主体成分，增强皮肤成纤维细胞和皮肤角质祖细胞活性是加速皮肤创伤愈合和 损伤组织修复的关键。筛选能促进皮肤成纤维细胞和皮肤角质祖细胞增殖，加快胶原蛋白 分泌的活性成分，对研制促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物十分重要。
[0005] 文献报道，人参提取物能提高人皮肤成纤维细胞（HDF)活性，并具有明显的抗氧 化作用。人参皂苷Rgl衍生物人参皂苷F1能抵抗紫外线诱导的人皮肤角质细胞凋亡。人 参皂苷Rbl能促进皮肤烧伤创面愈合过程中的血管生成。大量实验证据表明，人参中具有 预防皮肤损伤，促进皮肤再生的活性成分。
[0006] 我们在人参中寻找到一种增强皮肤成纤维细胞活性，促进胶原蛋白产生，减少胶 原蛋白降解，加快皮肤角质祖细胞分裂，从而促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的活性成 分。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种人参皂苷Rd，在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修 复药物中应用。
[0008] 实验结果显示，增强皮肤成纤维细胞活性，促进胶原蛋白分泌和加快皮肤角质祖 细胞分裂对促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复具有十分重要的作用。人参皂苷Rd能显著 促进HDFs细胞增殖、迁移、I -型胶原蛋白表达和分泌；促进KPCs活性增强、细胞分裂加 快。
[0009] 首先在实验室培养HDFs和KPCs，试用三种不同浓度的人参皂苷Rd细胞培养液处 理HDFs和KPCs，应用MTT和ELISA等实验方法，观察到细胞活性均能显著增强，增殖加快。 应用RT-PCR和Western blot等实验方法，观察到I -型胶原蛋白表达分泌增加，MMP1表达 分泌减少。
[0010] 有益效果：提高机体自我修复能力，加快皮肤创伤愈合，缩短创伤愈合时间，恢复 机体功能。在战地急救、意外伤害救护和外科手术中有重要意义。人参皂苷Rd能提高HDFs 和KPCs活性。增加 I -型胶原蛋白分泌，抑制MMP1表达。具有提高皮肤创伤愈合和损伤 组织修复的能力，能在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复的药物中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为经Rd处理后，MTT检测KPCs细胞活性。
[0012] 图2为经Rd处理后，MTT检测HDFs细胞活性。
[0013] 图3为经Rd处理后，RT-PCR检测HDFs细胞I -型胶原mRNA表达水平。
[0014] 图4为经Rd处理后，Western blot检测HDFs细胞I -型胶原蛋白水平。
[0015] 图5为经Rd处理后，RT-PCR检测HDFs细胞MMPlmRNA表达水平。
[0016] 图6为经Rd处理后，Western blot检测HDFs细胞MMP1蛋白水平。
【具体实施方式】
[0017] 1. KPCs 和 HDFs 细胞培养
[0018] 分别用6孔培养板在角质细胞生长培养基（KGM2)和10 %胎牛血清DMEM培养基中 接种KPCs (4X104)和HDFs (3X104)两种细胞。之后更换无血清培养基，过夜。再用不同浓 度人参皂苷Rd分组处理。在KGM2或DMEM完全培养基中37°C、5% C02恒温培养箱培养24 小时。
[0019] 2·ΜΤΤ 实验
[0020] 经不同浓度人参皂苷Rd分组处理后的KPCs和HDFs，每孔加入ΜΤΤ溶液（5mg/ml)， 所加入MTT溶液约为培养基体积的5%。37°C、5% C02恒温培养箱培养2小时。离心后弃 上清液，加入二甲基亚砜（DMS0)，摇床低速振荡，酶联免疫检测仪595nm测量各组吸光值。
[0021] 3. RT-PCR 检测
[0022] 经不同浓度人参皂苷Rd分组处理HDFs24小时后，使用Trizol提取细胞中总RNA， 通过测量260nm和280nm处0D值，检测所提取RNA量以及纯度。根据Takara公司提供的 RT-PCR试剂盒说明进行反转录和扩增实验，引物序列如下：1_型胶原上游引物为5' -TAG GGTCTAGACATGTTCAGCTTTGT-3'，下游引物为 5，-GTGAGGGGTGGGATGTCTTCGT-3，；MMP1 上 游引物为 5' -AGATGTGGAGTGCCTGATGT-3'，下游引物为 5' -CTAGGGTACATCAAAGCC-3'; GAPDH 上游引物为 5 ' -CGATATCCCTCCAAAATCAA-3 '，下游引物为 5' -TGTGGTCATGAGTCCTCCCA-3'。选用退火温度分别为 95°C、54°C和 72°C。使用 1.5%琼 脂糖凝胶电泳分析PCR产物量。检测I型胶原和MMP-1各组灰度值。
[0023] 4. Western blotting 检测
[0024] HDFs细胞接种于6孔培养板，细胞密度2 X105,过夜。无血清培养24小时。用不 同浓度的人参皂甙Rd处理24小时，检测I型胶原和MMP-1。用细胞被裂解缓冲液I处理 后4°C离心13000rpml5min。收集上清。巴德福特法酶标仪测定样品中的总蛋白。SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，MMP1 (1:1000)，抗胶原（1:1000)处 理。膜漂洗后二抗孵育，用TBST缓冲液水平摇床漂洗，暗室PVDF膜X光曝光及显影。
[0025] 5.结果分析
[0026] (1)人参皂苷Rd促进KPCs和HDFs细胞增殖
[0027] 用三组不同浓度人参皂苷Rd培养皮肤角质祖细胞（KPCs)和人皮肤成纤维细胞 (HDFs) 24小时，均能不同程度提高两种细胞活性，并有浓度依赖性，人参皂苷Rd高浓度组 促进KPCs和HDFs活性增强程度更加明显（图1、图2)。人参皂苷Rd促进KPCs和HDFs细 胞增殖对损伤组织修复和皮肤创伤愈合有重要作用。
[0028] (2)人参皂苷Rd促进HDFs细胞I -型胶原mRNA表达和蛋白产生
[0029] 人生皂苷Rd除促进HDFS增殖和迁移增外，还提高I -型胶原mRNA的表达水平和 蛋白水平（图3、图4)。胶原蛋白是主要细胞间质，在皮肤创伤愈合与损伤组织修复过程中， 发挥重要功能。由于纤维细胞会随着结缔组织间质移动，由胶原蛋白纤维形成的立体结构 可以协助纤维细胞聚集，能加快损伤组织的修复。
[0030] (3)人参皂苷Rd抑制HDFs细胞MMPlmRNA表达和蛋白产生
[0031] 人参阜苷Rd能降低MMPlmRNA表达水平。Western blot分析显示，也显著降低了 MMP1蛋白水平（图5、图6)。在伤口愈合初期，MMP1对清除坏死组织，预防组织感染有重要 作用。在组织修复期间，抑制MMP1表达，能防止结缔组织过度分解，对加快皮肤创伤愈合和 损伤组织修复。
[0032] 综上可以看出，人参皂苷Rd通过增加皮肤角质细胞和人皮肤成纤维细胞活性，促 进其增殖；提高对HDFs细胞I -型胶原mRNA的表达水平和蛋白水平；抑制MMP1表达，能加 快皮肤创伤愈合和损伤组织的修复。
【权利要求】
1.人参皂苷Rd在制备促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复药物中的应用，其特征是人 参皂苷Rd可提高皮肤角质祖细胞和人皮肤成纤维细胞活性，促进增殖，增加 I-型胶原纤维 蛋白分泌，抑制MMP1表达，从而促进皮肤创伤愈合和损伤组织修复。
【文档编号】A61K31/704GK104055785SQ201410312581
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】霍洪亮, 李凤玉, 彭雪薇 申请人:东北师范大学