复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，该方法包括制备复方女贞子；将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定；饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验；对小鼠进行溶菌酶活性的测定；进行猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定；对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用；数据分析。本发明验证了复方女贞子作为饲料添加剂可以通过提高免疫器官指数，增加单核-巨噬细胞的活性，显著提高溶菌酶活性，从而达到对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠良好的保护作用。
【专利说明】复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理实验领域，尤其涉及一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小 鼠模型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 中国是世界上最重要的生猪养殖和猪肉消费大国，拥有悠久的养猪传统。多杀性 巴氏杆菌病是猪场常见病之一，目前主要使用疫苗预防该病，但是该菌分布广泛，血清型 多，致使疫苗预防效果不佳。现代中药药理学研究表明，"滋补"类中药具有一定的免疫增强 作用，本发明根据中药配伍原则和组方理论，将性能相关的中药配合应用，筛选和优化经验 配方得到女贞子、淫羊藿、白术、茯苓四味中药组成"复方女贞子"作为免疫增强剂饲喂小白 鼠，考察其对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠的保护作用及其机理。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构 建方法，旨在考察复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠的保护作用及其机理。
[0004] 本发明是这样实现的，一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建 方法包括：
[0005] 步骤一、用女贞子、淫羊藿、白术、茯苓制备复方女贞子，女贞子、淫羊藿、白术、茯 苓的质量比为2 : 1.5 : 1 : 1;以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成1 : 1的复 方女贞子药液（lmL药液相当于lg原药材），再分别稀释成1 : 20、1 : 40和1 : 80的复 方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子0.05%、0. 1 %、0. 15% (w/ w)的鼠料，备用；
[0006] 步骤二、将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定；
[0007] 步骤三、饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验；
[0008] 步骤四、对小鼠进行溶菌酶活性的测定；
[0009] 步骤五、进行猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定；
[0010] 步骤六、对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用；
[0011] 步骤七、数据分析。
[0012] 进一步，所述的制备复方女贞子的具体方法为：
[0013] 以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成1 : 1的复方女贞子药液（lmL药液 相当于lg原药材），再分别稀释成1 : 20、1 : 40和1 : 80的复方女贞子药液，均匀喷雾 于全价鼠料的表面，制成含复方女贞子0.05%、0. 1^^0.15% (w/w)的鼠料，备用。
[0014] 进一步，将实验小鼠分组及处理的具体方法为：
[0015] 80只3周龄和60只8周龄SPF级白雄鼠，饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28°C， 相对湿度为（50± 10) %，动物饲养适应3天后进行试验，将80只3周龄小鼠随机分成4组， 每组20只，I、ΙΙ、ΠΙ组为实验组，分别饲喂含复含方女贞子0.05%、0. 1%、0. 15% (w/w)的 鼠料，IV组为对照组，饲喂普通鼠料，连续饲喂30d，60只7周龄小鼠用于猪多杀性巴氏杆菌 半数致死量的测定。
[0016] 进一步，碳粒廓清试验的具体方法为：
[0017] 饲喂结束后，每组随机取10只小鼠，称重，每只小鼠使用胰岛素注射器由尾静脉 注入0. lmL/10g的印度墨汁（生理盐水稀释6倍），注射后分别在2min (Tl)、7min (T2)乙醚 麻醉后用玻璃毛细管从小鼠眼眶静脉丛采血20μ L，溶于20mL0. 1% Na2C03溶液中摇匀，静 置20min后每个样品取100 μ L加入到96孔板中，取两次样分别加入不同孔中，以0. 1 %溶 液为空白对照，使用酶标仪在680nm波长测量其0D值，将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸 吸干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值、校正廓清指数Ka值及免疫器官指数，计算公 式为
[0018]
【权利要求】
1. 一种复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述 的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法包括： 步骤一、用女贞子、淫羊藿、白术、茯苓制备复方女贞子，女贞子、淫羊藿、白术、茯苓的 质量比为2 : 1.5 : 1 : 1;以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成1 : 1的复方女 贞子药液，再分别稀释成1 : 20、1 : 40和1 : 80的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠 料的表面，制成含复方女贞子0.05%、0. 1^^0.15% (w/w)的鼠料，备用； 步骤二、将实验小鼠分组及处理，用于猪多杀性巴氏杆菌半数致死量的测定； 步骤三、饲喂结束后，对小鼠进行碳粒廓清试验； 步骤四、对小鼠进行溶菌酶活性的测定； 步骤五、进行猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定； 步骤六、对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用； 步骤七、数据分析。
2. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，所述的制备复方女贞子的具体方法为： 以药材的10倍水量采用水提法提取浓缩制成1 : 1的复方女贞子药液，再分别稀释成 1 : 20、1 : 40和1 : 80的复方女贞子药液，均匀喷雾于全价鼠料的表面，制成含复方女贞 子0.05%、0.1%、0.15%(￥/￥)的鼠料，备用。
3. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，将实验小鼠分组及处理的具体方法为： 80只3周龄和60只8周龄SPF级白雄鼠，饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为28°C，相 对湿度为（50 ± 10) %，动物饲养适应3天后进行试验，将80只3周龄小鼠随机分成4组，每 组20只，I、ΙΙ、ΠΙ组为实验组，分别饲喂含复含方女贞子0.05%、0. 1%、0. 15% (w/w)的鼠 料，IV组为对照组，饲喂普通鼠料，连续饲喂30d，60只7周龄小鼠用于猪多杀性巴氏杆菌半 数致死量的测定。
4. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，碳粒廓清试验的具体方法为： 饲喂结束后，每组随机取10只小鼠，称重，每只小鼠使用胰岛素注射器由尾静脉注入 0. lmL/10g的印度墨汁（生理盐水稀释6倍），注射后分别在2min(Tl)、7min(T2)乙醚麻 醉后用玻璃毛细管从小鼠眼眶静脉丛采血20μ L，溶于20mL0. 1% Na2C03溶液中摇匀，静置 20min后每个样品取100 μ L加入到96孔板中，取两次样分别加入不同孔中，以0. 1 %溶液 为空白对照，使用酶标仪在680nm波长测量其0D值，将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸吸 干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值、校正廓清指数Ka值及免疫器官指数，计算公式 为
其中，Μ =体重，=肝脏重，M2 =脾脏重，A为吸光光度值。
5. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，溶菌酶活性的测定的具体方法为： 每组剩下的10只小鼠采用眼眶静脉丛采血约0. 6mL，4°C冰箱静置保存2h后分离血清， 按以下方法检测溶菌酶（LZM)活性： 取200μ?的待测血清、溶菌酶标准液（0. lmg/mL : 200U/mL)作为阳性对照、双蒸水 作为空白样，分别加入2. OmL浓度0. 25mg/mL微球菌菌液，立即混匀，37°C水浴15min，按时 取出置于〇°C的冰水浴中3min，530nm，lcm光径，以蒸馏水调透光度100%，测定各管的透光 度，计算公式如下： 溶菌酶含量（U/mL)=(测定管透光度-对照管透光度V (标准管透光度-对照管透 光度）X2000U/mL。
6. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，猪多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量的测定的具体方法为： 将菌株？1^439在加有5%犊牛血清的138培养基在371：恒温摇床上18〇17/1^11培养 10h，将细菌依次10倍稀释，分别取10 μ L涂于巧克力平板培养后计数；同时将上述10倍稀 释的菌液分别腹腔注射（100 μ L/稀释浓度）小鼠，每个浓度处理10只7周龄的白小鼠，采 用6个浓度，每天观察并记录小鼠死亡情况，连续观察4天，小鼠半数致死量的计算按Reed 和Muench氏法，计算公式为： 距离比例=(高于50%的死亡百分数-50 % )八高于50%的死亡百分数-低于501% 的死亡百分数）； 0)50的对数（1^0)50)=死亡率高于50%的对数+距离比例\稀释系数的对数。
7. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，对感染猪多杀性巴氏杆菌小鼠保护作用的具体方法为： 将进行溶菌酶活性测定的小鼠饲喂3天，待其恢复健康后，腹腔注射1000个LD50菌液 (100 μ L)进行攻毒，每天观察小鼠状态并记录死亡情况，连续观察4d。
8. 如权利要求1所述的复方女贞子对猪多杀性巴氏杆菌感染小鼠模型的构建方法，其 特征在于，数据分析的数据使用"平均值土标准差"表示，使用SPSS17.0软件以单因素变 异数分析进行组间差异显著性检验，P < 〇. 05为具有统计学意义。
【文档编号】A61K36/638GK104095934SQ201410322558
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】朱丽娜, 陈仕贵, 雷凌华, 陈扬, 张子烨 申请人:湖南农业大学