靶定补体蛋白c5的抗体的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及靶定补体蛋白C5的抗体的组合物和方法。具体而言，本发明涉及靶定补体蛋白质C5的抗体，和组合物及其使用方法。
【专利说明】靶定补体蛋白C5的抗体的组合物和方法
[0001]本申请为2009年8月3日提交的、发明名称为“靶定补体蛋白C5的抗体的组合物和方法”的PCT申请PCT/EP2009/060052的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2011年4月I日，申请号为200980138903.3。
【技术领域】
[0002]本发明涉及靶定补体蛋白C5的抗体和组合物及其使用方法。
【背景技术】
[0003]补体的正常作用是在宿主防御中，补体是先天免疫系统的一部分。补体防御细菌感染,连接适应性免疫和先天性免疫,并处理免疫复合物和炎症损伤的产物。
[0004]通过在补体激活过程中产生的生物学上有活性的产物完成防御功能，所述产物调理病原体、促进炎症或溶解易感性靶标(Marzari等，Eur J Immunol32:2773-2782 (2002))。补体系统由在免疫系统中起作用的大约25-30种血浆蛋白质组成。补体级联由至少三条主要途径激活。经典途径通常由免疫复合物激活，旁路途径可被无保护的细胞表面激活，甘露糖结合凝集素(MBL)途径由MBL结合到细胞表面的糖类上起始(Trendelenburg, Swiss MedWklyl37:413-417(2007))。
[0005]所有三条途径导致C5转化酶对C5的切割。该切割的结果是释放了有效的炎症分子C5a片段，和起始膜攻击复合体(MAC)的C5b。补体产物一旦释放就不能在外源和自身靶标之间进行区分，并且如果不加以严格调节，则在与无限制补体激活相关的临床情况中经常引起无辜细胞和组织的广泛损伤(Marzari等，2002)。
[0006] C5在细胞内表达为1676个氨基酸的单个前C5肽，其由位于成熟N末端β链和C末端α链之间的18个残基信号序列和富含Arg的接头序列(RPRR)组成。成熟的C5具有大约190kDa的分子量，并由二硫键连接的两条多肽链组成(a，115kDa ； β，75kDa)。C5转化酶在α链的74和75位残基之间切割C5，释放74个氨基酸的C5a肽和随后掺入到膜攻击复合体(MAC)中的C5b片段。
[0007]黄斑变性是主要见于老年人的医学状况，在所述老年人中称为视网膜黄斑区域的眼睛衬里中心遭受变薄、萎缩，并且在一些情况下，出血。这可导致中心视觉丧失，其使得不能看见微小细节、阅读或识别面孔。对新脉络膜脉管形成的发病机理还了解的不多，但认为诸如炎症、局部缺血和血管原性因子的局部产生等因素是重要的。
[0008]尽管目前存在用于治疗与经典或补体旁路途径相关的疾病和病征，特别是AMD的治疗选择，但仍然需要寻找产生有效并良好耐受治疗的特异性靶标。
【发明内容】
[0009]本发明提供分离的补体C5-结合分子(例如，C5-结合抗体或其抗原结合片段)、包含此类分子的药物组合物、制备此类分子和组合物的方法及其使用方法。
[0010]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有至少Ix17M-1UO8M-1UO9M-1UOkiM-1或111M-1的亲和常数(Ka)。
[0011]在一些实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合C5蛋白质，并且如通过体外溶血测定法测定以约20pM到约200pM的IC5tl范围抑制补体旁路途径。
[0012]在一些实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合C5蛋白质，并且与下文表1中描述的抗体交叉竞争。在一些实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其与下文表1中描述的抗体结合C5蛋白质的同一表位。
[0013]在一些实施方案中，本发明的抗体是特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是特异性结合C5蛋白质的分离的人或人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是特异性结合C5蛋白质的分离的嵌合抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含人重链恒定区和人轻链恒定区。
[0014]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是Fab片段。在一些实施方案中，本发明的抗体是scFv。
[0015]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合人C5和猕猴C5的分离的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明的抗体是IgG同种型。
[0016]在一些实施方案中，本发明提供包含构架的分离的抗体或其抗原结合片段，在所述构架中氨基酸已经替换为来自各自人VH或VL种系序列的抗体构架。
[0017]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、17、18、19、20、21、22、33、34、
35、36、37、38、49、50、61、62、63、64、65、66、77、78、89、95、101、107、113、119、120、131、132、133、134、135、136、145、146、147、148、149、150、159、160、161、162、163、164、173、174、175、176、177、178、195、196、197、198、199、200、209、226、235、236、237、238、239 或 240 具有至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的至少一条互补决定(CTR)序列。
[0018]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:l、2、3、17、18、19、33、34、35、49、61、62、63、77、77、95、107、113、119、132、131、133、145、146、147、159、160、161、173、174、175、195、196、197、226、235、236或237同一的至少一条重链CDR序列。
[0019]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:4、5、6、20、21、22、36、37、38、50、64、65、66、78、89、101、120、134、135、136、148、149、150、162、163、164、176、177、178、198、199、200、209、238、239或240同一的至少一条轻链CDR序列。
[0020]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含选自SEQ ID N0s:l、17、33、61、131、145、159、173、195和235 的重链 CDRl ;选自 SEQ ID NOs:2、18、34、49、62、77、95、107、113、119、132、146、160、
174、196、226 和 236 的重链 CDR2 ;和选自 SEQ ID N0s:3、19、35、63、133、147、161、175、197和237的重链⑶R3。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段还包含选自SEQ IDN0s:4、20、36、64、134、148、162、176、198和238 的轻链CDRl ;选自 SEQ ID N0s:5、21、37、65、
135、149、163、177、199和239 的轻链CDR2 ;和选自 SEQ ID N0s:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、178、200、209 和 240 的轻链 CDR3。
[0021]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含选自SEQ ID N0s:4、20、36、64、134、148、162、176、198和238 的轻链CDRl ;选自 SEQ ID N0s:5、21、37、65、135、149、163、177、199和 239 的轻链CDR2 ;和选自 SEQ ID N0s:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、178、200、209 和 240 的轻链CDR3。
[0022]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277 或 281 具有至少 90 %,9597%,98%或至少99%序列同一性的重链可变区。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段还包含与 SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的轻链可变区。
[0023]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%,95%,97%,98%或至少99%序列同一性的轻链可变区。
[0024]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:9、25、41、53、69、81、97、109、115、123、139、
153、167、181、189、203、212、220、229、243、249、254、258、274、278或 282 具有至少 90 %、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的重链。在一些实施方案中，此类抗体还包含与SEQID NO:10、26、42、54、70、82、91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或290具有至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的轻链。
[0025]在一些实施方案中，本发明提供特异性结合C5蛋白质的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与SEQ ID N0:10、26、42、54、70、82、91、103、124、140、
154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或 290 具有至少 90 %、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的轻链。
[0026]本发明还包含药物组合物，其包含本发明的一种或多种C5-结合分子(例如，C5结合抗体或其抗原结合片段)和药学上可接受的载体。
[0027]在一些实施方案中，本发明提供包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含与 SEQ ID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277 或 281 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的重链可变区。
[0028]在一些实施方案中，本发明提供包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含与 SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的轻链可变区。
[0029]本发明还提供包含此类核酸的载体和宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供分离的宿主细胞，其包含(I)编码本发明抗体重链的重组DNA区段，和(2)编码本发明抗体轻链的第二个重组DNA区段；其中所述DNA区段各自有效连接第一个和第二个启动子，并能够在所述宿主细胞中进行表达。在另一实施方案中，本发明提供包含分别编码本发明抗体重链和轻链的重组DNA区段的分离的宿主细胞，其中所述DNA区段有效连接启动子，并能够在所述宿主细胞中进行表达。在一些实施方案中，所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人单克隆抗体，或其抗原结合片段。
[0030]本发明还提供使用本发明的C5结合分子(例如C5结合抗体或其抗原结合片段)的治疗或诊断方法。在一个实施方案中，本发明提供治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体或其抗原结合片段的组合物。
[0031]在另一实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述疾病是哮喘、关节炎、自身免疫心脏病、多发性硬化、炎性肠病、缺血-再灌注损伤、巴-西二氏综合征、血液透析、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化、移植、阿尔茨海默氏病、肾小球肾炎或MPGN II。
[0032]本发明还提供用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体或其抗原结合片段的组合物。
[0033]本发明还提供改善与体外循环相关症状的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发明抗体或其抗原结合片段的组合物。
[0034]3.1 定义
[0035]除非另有定义，此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同意思。
[0036] 如此处所用的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区(此处缩写为VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，它们散布着称为构架区(FR)的更保守的区域。每一 VH和VL由以下面顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一个组分(Clq)的结合。
[0037]如此处所用，术语抗体的“抗原结合部分”指完整抗体的一个或更多片段，其保留与给定抗原(例如C5)特异性结合的能力。可通过完整抗体的片段进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”中包括的结合片段的实例包括Fab片段，其为VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CHl结构域组成的Fd片段；由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等，1989Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(⑶幻。
[0038]此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可使用重组方法，通过人工肽接头将它们连接，所述人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参阅例如Bird等，1988Science242:423-426 ；和 Huston 等，1988Proc.Natl.Acad.Sc1.85:5879-5883)。此类单链抗体包括抗体的一个或更多“抗原结合部分”。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选所述片段，以与完整抗体相同的方式使用所述片段。
[0039]抗原结合部分也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv (参阅例如Hollinger和 Hudson, 2005, Nature B1technology, 23, 9, 1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植到基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参阅美国专利号6，703，199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体体)。
[0040]抗原结合部分可掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，所述串联Fv区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，1995ProteinEng.8 (10): 1057-1062 ;和美国专利号 5，641，870)。
[0041]如此处所用，术语“亲和力”指抗体与抗原在单个抗原位点上相互作用的强度。在每一抗原位点中，抗体“臂”的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
[0042]如此处所用，术语“亲合力”指抗体-抗原复合物的总稳定性或强度的信息化量度。其受三个主要因素控制:抗体表位亲和力；抗原与抗体两者的效价；和相互作用部分的结构排列。最终这些因素决定了抗体的特异性，即特定抗原结合精确抗原表位的可能性。
[0043]术语“氨基酸”指天然发生的和合成的氨基酸，以及与天然发生的氨基酸以相似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及稍后被例如羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸修饰的那些氨基酸。氨基酸类似物指这样的化合物，其与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然发生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同结构的化合物，但它以与天然发生的氨基酸类似的方式起作用。
[0044]如此处所用，术语“结合特异性”指各抗体结合位点与仅一个抗原决定簇相互作用的能力。抗体的结合部位位于分子的Fab部分，并从重链和轻链的高变区构建。抗体的结合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合部位之间反应的强度。其为抗原决定簇与抗体结合部位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。
[0045]两个实体之间的特异性结合表示平衡常数(Ka)为至少lxKfM'KfM'lOl1、1kT1或111M-1的结合。短语与抗体的“特异性(或选择性)结合”指决定近亲抗原(例如人C5或猕猴C5)在蛋白质和其它生物产品的异质群体中的存在的结合反应。除了上文指出的平衡常数(ΚΑ)，本发明的C5结合抗体通常还具有约IxKT2s'IxKT3s'ΙχΙΟΛ1、ΙχΙΟ?或更低的解离速率常数(Kd)，并且以比其结合非特异性抗原(例如C3、C4、BSA)的亲和力高至少两倍的亲和力结合C5。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”此处可与“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
[0046]术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接不同种类或改变种类的恒定区、效应功能和/或物种，或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，可通过来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区进行替换，嵌合抗体在识别抗原中可保留其特异性，同时与最初的小鼠抗体相比，在人中具有降低的抗原性。
[0047]术语“补体C5蛋白质”或“C5”可互换使用，并指不同物种中的C5蛋白质。例如，人C5具有如SEQ ID NO: 296中阐明的序列，猕猴C5具有SEQ ID NO: 297中阐明的序列(Macaca fascicularis)(见表 I)。可从 Quidel (Cat.Number A403)获得人 C5。可如下文实施例部分说明产生猕猴C5。
[0048]术语“保守修饰的变体”应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者其中所述核酸不编码氨基酸序列，则指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一位置上(其中密码子确定丙氨酸)，可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的每一密码子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一沉默变异。
[0049]对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的各替换、缺失或添加，其导致对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有彼此为保守替换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸⑶，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W) ；7)丝氨酸⑶，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton, Proteins (1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
[0050]术语“交叉-阻断”、“交叉-阻断的”在此处可互换使用，表示抗体或其它结合剂在标准的竞争性结合测定中干扰其它抗体或结合剂与C5结合的能力。
[0051]可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与C5结合的能力或程度，并因此是否可以被称为本发明的交叉阻断。一种合适的测定法包括使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore3000仪器(Biacore, Uppsala, Sweden)),其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一测定法使用基于ELISA的方法。
[0052]术语“表位”表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位一般由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链组成，并一般具有特定的三维结构特征，以及比电荷特征。构象和非构象表位可以区分开，因为在变性溶剂的存在下失去与前者的结合，而不失去与后者的结合。
[0053]如此处所用，术语IgG抗体的“高亲和力”指对靶抗原具有10_8M或更低、10_9M或更低、ΙΟ,Μ、或1-11M或更低的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可以发生变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合指具有10_7Μ或更低，或10_8Μ或更低的KD的抗体。
[0054]如此处所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，在所述可变区中构架和⑶R区均来自人来源的序列。此外,如果抗体含有恒定区,所述恒定区也来自此类人序列,例如人种系序列，或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
[0055]术语“人单克隆抗体”指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体，在所述可变区中构架和CDR区均来自人序列。在一个实施方案中，所述人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因非人动物，例如转基因小鼠中获得的B细胞，所述转基因非人动物具有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
[0056]“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性，而在人中具有更低免疫原性的抗体。例如这可通过保留非人⑶R区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分(即，恒定区以及可变区的构架部分)来实现。参阅例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855，1984 ；Morrison 和 0i, Adv.1mmunol., 44:65-92，1988 ；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536，1988 ；Padlan,Molec.1mmun.，28:489-498，1991 ；和Padlan, Molec.1mmun.，31:169-217, 1994。人工程化技术的其它实例包括，但不限于在US5, 766，886中公开的Xoma技术。
[0057]在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”指相同的两条或更多序列或子序列。当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查测定，比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时，如果两条序列具有特定百分比(即，在特定区域上或当不指定时，在全长序列上60 %同一性，任选地65%、70 %、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性)的相同氨基酸残基或核苷酸，那么两条序列“基本相同”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选地在长度至少100到500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的区域。
[0058]对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定可选参数。所述序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
[0059]如此处所用，“比较窗口”包括参考选自20到600、一般约50到约200，更一般约100到约150的任何一定数量相邻位置的区段，其中可在两条序列进行最佳比对后将序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.App1.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman 和 ffunsch, J.Mol.B1l.48:443, 1970 的同源性比对算法，通过搜索 Pearson 和Lipman, Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA85:2444, 1988的相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575ScienceDr.，Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手工比对和视觉检查(参阅，例如 Brent 等，Current Protocols in Molecular B1logy, John ffiley&Sons, Inc.(ringbou编辑，2003))进行序列最佳比对用于比较。
[0060]适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0 算法，其分别描述于 Altschul 等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402，1977 ；和Altschul 等，J.Mol.B1l.215:403-410，1990 中。用于进行BLAST分析的软件通过Nat1nalCenter for B1technology Informat1n公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSPs)，当在数据库序列中用相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某一正值阈值得分T15T称为邻近字得分阈值(Altschul等，上文)。这些初始邻近字命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的更长HSPs。只要可增加累积比对得分，则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列，使用参数M(对一对匹配残基的奖赏得分?’总>0)和N(对错配残基的罚分；总〈0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当:所述累积比对得分从其最高达到值跌落X量；因一个或更多负得分残基比对累积，所述累积比对得分到达零或以下；或到达任何一条序列的末端时，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W) 11、期望值(E) 10,M = 5、N = -4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3，和期望值(E) 10和BL0SUM62得分矩阵(参阅 Henikoff 和 Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915, 1989)比对(B) 50,期望值(E) 10、M = 5、N = -4和两条链的比较。
[0061]BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(参阅例如，Karlin和Altschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787，1993)。BLAST 算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，并最优选低于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。
[0062]也可使用已经整合到ALIGN算法(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller (Comput.Appl.B1sc1., 4:11-17, 1988)的算法，使用PAM120加权残基表，空位长度罚分12和空位罚分4测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合到GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch (J.Mol, B1l.48:444-453，1970)算法，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，以及空位加权16、
14、12、10、8、6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
[0063]除了上文指出的序列同一性的百分比，两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应，如下文描述。因此，多肽通常与第二条多肽基本相同，例如，其中两条肽仅因保守替换而不同。两条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
[0064]术语“分离的抗体”指抗体，其基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体(例如，特异性结合C5的分离的抗体基本不含特异性结合除C5外的抗原的抗体)。然而，特异性结合C5的分离的抗体可对其它抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本不含其它细胞物质和/或化学品。
[0065]术语“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体种类(例如，IgM、IgE、IgG如IgGl或IgG4)。同种型也包括这些种类中一种的修饰形式，其中已经进行修饰以改变Fe功能，例如来增强或减弱效应功能或与Fe受体的结合。
[0066]如此处所用，术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如此处所用，术语“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如此处所用，术语“KD”旨在指解离常数，其获得于Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)并表达为摩尔浓度(M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的Kd值。用于测定抗体Kd的方法是通过使用表面等离振子共振，或使用生物传感器系统如Biacore?系统。
[0067]如此处所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单个分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
[0068]术语“核酸”此处与术语“多核苷酸”可互换使用，并指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，其为合成的、天然发生的和非天然发生的，其与参考核酸具有相似的结合性质，并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括，但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
[0069]除非另有指出，特定核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。尤其是，如下文详细描述，可通过产生这样的序列完成简并密码子替换，其中用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选(或全部)密码子的第三个位置(Batzer 等，Nucleic Acid Res.19:5081, 1991 ;0htsuka 等，J.B1l.Chem.260:2605-2608，1985 ;和 Rossolini 等，Mol.Cell.Probes8:91-98, 1994)。
[0070]术语“有效连接”指两个和更多多核苷酸(例如DNA)区段的功能关系。通常，其指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达系统中的转录，那么该启动子或增强子序列有效连接编码序列。一般地，有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻近，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节序列，如增强子不需要与编码序列(增强子增强其转录)在物理空间上邻近或位于其附近。
[0071]如此处所用，术语“优化的”表示已经使用生产细胞或生物，一般是真核细胞，例如毕赤酵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列，以编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)最初编码的氨基酸序列。已经改造了此处的优化序列以具有哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，此处也考虑其它真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
[0072]术语“多肽”和“蛋白质”此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用到氨基酸聚合物，其中一个或更多氨基酸残基是相应天然发生氨基酸的人工化学模拟物，还应用到天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
[0073]如此处所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从中制备的杂交瘤中分离的抗体、从经转化以表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤中分离的抗体、从重组、组合人抗体库文中分离的抗体，和通过任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体，所述手段包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪切成其它DNA序列。此类重组人抗体具有可变区，其中构架和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中，此类重组人抗体可进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是当来自并与人种系VH和VL序列相关时可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
[0074]术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)指已经向其中引入重组表达载体的细胞。应理解此类术语不仅旨在指特定受试者细胞，还指此细胞的后代。因为某些修饰可能因突变或环境影响而在后代中出现，所以该后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然包括在此处所用术语“宿主细胞”的范围内。
[0075]术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了指出时，术语“患者”或“受试者”此处可互换使用。
[0076]术语“治疗”包括施用组合物或抗体，以防止或延迟症状、并发症或疾病(例如AMD)的生物化学指征的开始，缓解症状或阻止或抑制疾病、状况或病征的进一步发展。治疗可以是预防性的(以防止或延迟疾病开始，或防止其临床或亚临床症状的表现)或在疾病表现后治疗性抑制或缓解症状。
[0077]术语“载体”旨在指能够转运已经连接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指已经连接额外DNA片段的环形双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在其中引入载体的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与所述宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明旨在包括此类其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其起等同的功能。
[0078]发明详述
[0079]本发明提供特异性结合补体C5蛋白质(例如，人C5，猕猴C5)的抗体、药物组合物、产生方法和使用此类抗体和组合物的方法。
[0080]5.1C5 抗体
[0081]本发明提供特异性结合C5(例如，人C5，猕猴C5)的抗体。在一些实施方案中，本发明提供特异性结合人和猕猴C5的抗体。本发明的抗体包括，但不限于如实施例中所述分离的人单克隆抗体(参阅下文第6部分)。
[0082]本发明提供特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体，所述抗体包含具有 SEQ ID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或281的氨基酸序列的VH结构域。本发明还提供特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体，所述抗体包含具有下文表1中列出的任何一个VH CDRs的氨基酸序列的VH CDR0具体而言，本发明提供特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体，所述抗体包含(或者，组成为)具有下文表1中列出的任何一个VH⑶Rs的氨基酸序列的一个、两个、三个、四个、五个或更多VH⑶Rs。
[0083]本发明提供特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体，所述抗体包含具有 SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285或289的氨基酸序列的VL结构域。本发明还提供特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体，所述抗体包含具有下文表1中列出的任何一个VL CDRs的氨基酸序列的VL CDR0具体而言，本发明提供特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体，所述抗体包含(或者，组成为)具有下文表1中列出的任何一个VL⑶Rs的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多VL⑶Rs。
[0084]本发明的其它抗体包括已经突变的氨基酸，其在CDR区中仍然与表1所述序列中描述的⑶R区具有至少百分之60、70、80、90或95的同一性。在一些实施方案中，其包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中描述的⑶R区比较时⑶R区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经发生突变。
[0085]本发明还提供编码特异性结合C5蛋白质(例如，人和/或猕猴C5)的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表达(例如，表 I 显示了抗体 8109、8110、8111、8113、8114、8112、8125、8126、8127、8128、8129、8130,8131,8132和8091的重链和轻链的优化核酸序列)。
[0086]表1.本发明C5抗体与C5蛋白质的实例
[0087]
【权利要求】
1.特异性结合补体C5蛋白质的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有至少 IxlO7M'18M'19M'1iqIT1 或 111ITi 的亲和常数(Ka)。
2.权利要求1的抗体,其如通过体外溶血测定法所测定以20-200pM的IC5tl抑制补体芳路。
3.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合补体C5蛋白质，并与表1中描述的抗体交叉竞争。
4.抗体或其抗原结合片段，其与表1中描述的抗体结合相同的表位。
5.权利要求1、3或4的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求5的抗体，其中所述抗体是人或人源化抗体。
7.权利要求5的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
8.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含人重链恒定区和人轻链恒定区。
9.权利要求5的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
10.权利要求5的抗体，其中所述抗体是Fab片段。
11.权利要求5的抗体,其中所述抗体是scFv。
12.权利要求5的抗体，其结合人C5和猕猴C5。
13.权利要求5的抗体，其是IgG同种型。
14.权利要求5的抗体，其中所述抗体包含构架，其中氨基酸已经替换成来自各自人VH或VL种系序列的抗体构架。
15.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID ΝΟ:1、2、3、4、5、6、17、18、19、20、21、22、33、34、35、36、37、38、49、50、61、62、63、64、65、66、77、78、89、95、101、107、113、119、120、131、132、133、134、135、136、145、146、147、148、149、150、159、160、161、162、163、164、173、174、175、176、177、178、195、196、197、198、199、200、209、226、235、236、237、238,239或240具有至少95%序列同一性的至少一个互补决定(OTR)序列，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
16.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID ΝΟ:1、2、3、17、18、19、33、34、35、49、61、62、63、77、77、95、107、113、119、132、131、133、145、146、147、159、160、161、173、174、175、195、196、197、226、235、236或237相同的至少一个重链CDR序列，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
17.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID N0:4、5、6、20、21、22、36、37、38、50、64、65、66、78、89、101、120、134、135、136、148、149、150、162、163、164、176、177、178、198、199、200、209、238、239或240相同的至少一个轻链CDR序列，其中所述抗体结合人C 5蛋白质。
18.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含选自SEQID ΝΟ:1、17、33、61、131、145、159、173、195 和 235 的重链 CDRl ;选自 SEQ ID NO:2、18、34、49、62、77、95、107、113、119、132、146、160、174、196、226 和 236 的重链 CDR2 ;和选自 SEQ ID NO:3、19、35、63、133、147、161、175、197和237的重链CDR3，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
19.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含选自SEQID N0:4、20、36、64、134、148、162、176、198和 238 的轻链 CDRl ;选自 SEQ ID NO:5、21、37、65、135、149、163、177、199和 239 的轻链 CDR2 ;和选自 SEQ ID N0:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136 150、164、178、.200,209和240的轻链⑶R3，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
20.权利要求18的抗体，或其抗原结合片段，其还包含选自SEQID NO:4、20、36、64、.134、148、162、176、198和238 的轻链CDRl ;选自 SEQ ID NO:5、21、37、65、135、149、163、177、.199 和 239 的轻链 CDR2 ;和选自 SEQ ID N0:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、.178、200、209 和 240 的轻链 CDR3。
21.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID NO:7、23、39、51、67、79、.96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或 281具有至少95%序列同一性的重链可变区，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
22.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID N0:8、24、40、52、68、80、.90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285和 289 具有至少95%序列同一性的轻链可变区，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
23.权利要求21的抗体，或其抗原结合片段，其还包含与SEQID NO:8、24、40、52、68、.80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少95%序列同一性的轻链可变区。
24.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID NO:9、25、41、53、69、81、.97、109、115、123、139、153、167、181、189、203、212、220、229、243、249、254、258、274、278或.282具有至少95%序列同一性的重链，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
25.分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，其包含与SEQID N0:10、26、42、54、70、82、.91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或 290具有至少95%序列同一性的轻链，其中所述抗体结合人C5蛋白质。
26.权利要求24的抗体，或其抗原结合片段，其还包含与SEQID NO: 10、26、42、54、70、.82、91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286 或.290具有至少95%序列同一性的轻链。
27.药物组合物，其包含选自权利要求1-26的抗体和药学上可接受的载体。
28.包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含与SEQID NO:7、23、39、51、67、.79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或.281具有至少95%序列同一性的重链可变区。
29.包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含与SEQID N0:8、24、40、52、68、.80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285和 289 具有至少95%序列同一性的轻链可变区。
30.载体，其包含权利要求28或29的核酸。
31.分离的宿主细胞，其包含(I)编码权利要求18的抗体重链的重组DNA区段，和(2)编码所述抗体的轻链的第二个重组DNA区段；其中所述DNA区段有效连接启动子，并能够在所述宿主细胞中表达。
32.权利要求31的宿主细胞，其中所述抗体是人单克隆抗体。
33.权利要求31的宿主细胞，其为非人哺乳动物细胞系。
34.治疗年龄相关性黄斑变性的方法，其包括向需要该治疗的受试者施用有效量的包含选自权利要求1-26的抗体的组合物。
35.权利要求34的方法，其中所述受试者是人。
36.治疗疾病的方法，其包括向需要该治疗的受试者施用有效量的包含选自权利要求1-26的抗体的组合物，其中所述疾病是哮喘、关节炎、自身免疫心脏病、多发性硬化、炎性肠病、缺血-再灌注损伤、巴-西综合征、血液透析、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、牛皮癣、多发性硬化、移植、阿尔茨海默氏病、肾小球肾炎或MPGN 11。
37.权利要求36的方法，其中所述疾病是肾小球肾炎。
38.治疗阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的方法，其包括向需要该治疗的受试者施用有效量的包含选自权利要求1-26的抗体的组合物。
39.改善与体外循环相关症状的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量的包含权利要求1-26的抗体的 组合物。
【文档编号】A61P11/06GK104177495SQ201410336233
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2009年8月3日 优先权日:2008年8月5日
【发明者】B·迪芬巴赫-施特赖贝尔, A·埃博斯, B·C·吉尔德, Y-I·金, M·罗古斯卡, I·斯普劳斯基 申请人:诺华股份有限公司