树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种树突状细胞表达的TGF-β1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明首先通过cre-lox技术，成功杂交出树突状细胞(DC)不表达TGF-β1的小鼠，通过骨髓移植将这种小鼠的骨髓嵌合进动脉粥样硬化的易感小鼠Apoe-/-，通过高脂饮食诱导小鼠发生动脉粥样硬化。结果发现，DC不表达TGF-β1引起血浆总胆固醇增加，动脉粥样硬化斑块面积显著增加。表明DC表达的TGF-β1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作用。基于DC表达的TGF-β1抗动脉粥样硬化作用，DC表达的TGF-β1可用于制备抗动脉粥样硬化的药物，为开发抗动脉粥样硬化药物提供了新的方向。
【专利说明】树突状细胞表达的TGF-β 1在制备抗动脉粥样硬化药物中 的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学领域，涉及一种树突状细胞表达的TGF-β 1在制备抗动脉粥样硬 化药物中的应用。
【背景技术】
[0002] TGF-β可由多种细胞分泌，其家族包括三个成员，TGF-β 1、2和3。免疫系统表达 的最主要的亚型是TGF-βΙ。大量研究表明，TGF-βΙ的表达与动脉粥样硬化形成有关。有 些研究表明，TGF-β 1是一个抗动脉粥样硬化的血管保护性细胞因子，能限制动脉粥样硬化 斑块生长、阻止主动脉扩张并稳定斑块结构。然而，也有一些研究认为TGF-β具有促动脉 粥样硬化作用，发现TGF-β 1能通过增加血管细胞外基质的积聚及脂质的滞留而加速动脉 粥样硬化。以上研究结果提示，TGF-βΙ在动脉粥样硬化过程中确实发挥了非常重要的作 用，但研究结果并不一致，分析可能因为TGF-β的细胞来源复杂，不同细胞产生的TGF-β 作用可能不同。
[0003] 树突状细胞（Dendritic cell, DC)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞 (Antigen presenting cell，APC)，具有刺激初始T细胞增殖的独特功能，在启动获得性免 疫和维持免疫耐受中处于中心地位。有研究报道，DC还具有降低血脂的作用，DC降低血脂 是否通过表达的TGF-β 1发挥作用，最终是否影响动脉粥样硬化斑块的形成，目前尚不清 楚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种树突状细胞表达的TGF-β 1在制备抗动脉粥样硬化 药物中的应用。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] 本发明首先通过cre-lox技术，成功杂交出树突状细胞（dendritic cells, DC) 不表达TGF-β 1的小鼠，通过骨髓移植将这种小鼠的骨髓嵌合进动脉粥样硬化的易感小鼠 Ap〇e+，通过高脂饮食诱导小鼠发生动脉粥样硬化。结果发现，DC不表达TGF-β 1引起血浆 总胆固醇增加，动脉粥样硬化斑块面积也显著增加。表明DC表达的TGF-β 1可以通过降低 血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作用。
[0007] 基于DC表达的TGF- β 1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动脉粥样硬化作 用，DC表达的TGF-β 1可用于制备抗动脉粥样硬化的药物。
[0008] -种抗动脉粥样硬化的药物，包含DC表达的TGF- β 1。
[0009] 本发明首次发现了 DC表达的TGF-β 1可以通过降低血浆胆固醇水平而发挥抗动 脉粥样硬化作用，为开发抗动脉粥样硬化药物提供了新的方向。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是cre-lox技术构建DC不表达TGF-βΙ小鼠的原理图。CDllc为DC的 标志分子，⑶11c启动子下游的Cre为重组酶，该重组酶能够催化TGF-β 1两端的两个 loxp位点进行重组，从而删除loxp位点之间的TGF-β 1基因。利用cre-lox技术原理， 将 CDllc-cre (Jackson 公司，货号：007567)和 TGF-β l_f lox 小鼠 （Jackson 公司，货 号：010721)杂交，经几轮杂交后，通过PCR方法对小鼠基因型进行鉴定，选取⑶llC rae和 TGF-β lfl°x均为转基因阳性小鼠为DC不表达TGF-β 1的转基因小鼠。
[0011] 图2是Q)llcCTe-TGF-P lfl°x小鼠基因鉴定结果。按照Jackson公司小鼠鉴定方 法，分别鉴定杂交小鼠的⑶llC rae和TGF-β lfl°x的基因型。1代表⑶llCrae基因鉴定结果， 结果显示出现173bp转基因条带和324bp内参基因条带，为转基因阳性；2代表TGF-β lfl°x 基因鉴定结果，结果显示有一条324bp条带，为转基因阳性；Μ代表标准分子量marker， 500bp指示对应的Marker条带的大小；综合两种基因型的鉴定结果，判定该小鼠为DC不表 达TGF-β 1的双转基因阳性小鼠，命名为⑶llcel:e-TGF-e lfl°x小鼠。
[0012] 图3是骨髓嵌合技术制备骨髓嵌合的Ap〇ef小鼠实验流程图。无菌冲构建的 ⑶1 lCel:e-TGF- β lfl°x小鼠或TGF- β lfl°x小鼠骨髓，制备骨髓细胞，将骨髓细胞通过尾静脉回 输经12Gray致死剂量X射线照射的Apoe+小鼠，建立骨髓嵌合的Apoe+小鼠。
[0013] 图4是骨髓嵌合的Ap〇e+小鼠血浆总胆固醇检测结果图，与对照组TGF- β lfl°x嵌 合的Apoe^小鼠相比，CDllceIe-TGF-i3 lfl°x嵌合的Apoe^小鼠血浆总胆固醇显著升高。
[0014] 图5是骨髓嵌合的Ap〇ef小鼠主动脉根部油红0染色结果图。嵌合小鼠高脂饮 食12周，取主动脉根部进行冷冻切片，油红0染色显示主动脉根部动脉粥样硬化斑块位置。
[0015] 图6是骨髓嵌合的Apoe+小鼠主动脉根部油红0染色斑块面积的统计结果图。
[0016] 图7是骨髓嵌合的Ap〇ef小鼠主动脉根部油红0染色的斑块面积/官腔面积的 统计结果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0018] 实施例1利用cre-lox技术构建DC不表达TGF-β 1的小鼠
[0019] cre-lox技术的原理是：Cre为重组酶，能够催化两个loxp位点进行重组，从而删 除loxp位点之间的基因。为了利用cre-lox技术构建DC不表达TGF-β 1的小鼠，首先从 Jackson公司购买两种小鼠，CDllcel:e(货号：007567)和TGF-β lfl°x小鼠（货号：010721)，然 后利用cre-lox技术原理，将两种小鼠杂交，杂交原理如图1。将F1代小鼠进行PCR鉴定， 挑选后代的基因型为CDllc-cre (转基因）和TGF-β Ι-flox (杂合子）的小鼠再进行杂交； 在F2代小鼠中挑选⑶1 lc-cre为转基因而TGF-β 1-f lox为纯合子的小鼠再进行杂交来扩 大繁殖；F3代中⑶llc-cre (转基因，hemizygous)和TGF-β Ι-flox (纯合子）为构建成功 的DC不表达TGF-β 1的实验组小鼠，命名为CDllcel:e-TGF-e lfl°x(图2);而CDllc-cre (野 生型）和TGF- β lfl°x (突变体）为DC可表达TGF- β 1的对照组小鼠，命名为TGF- β lfl°x (与 图2鉴定标准相似，图略）。
[0020] 杂交小鼠鉴定方法包括小鼠 DNA提取，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统 拍照和结果分析。下面是具体的操作步骤。
[0021] 1、小鼠 DNA提取
[0022] (1)试验准备：
[0023] SNET (裂解缓冲液）：lMTris-HCl (pH8. 0)20mL，0. 5MEDTA10mL，NaC123. 376g，10% SDSlOOmL，蒸馏水定容至1L。
[0024] 蛋白酶K :贮存液浓度50mg/mL，终浓度10 μ g/mL，-20°C保存。
[0025] 饱和NaCl、70%乙醇、异丙醇。
[0026] (2)实验步骤
[0027] 1)用打孔器采4-6周龄的小鼠耳片，也可剪0. 5-lcm的尾巴组织，将其放进1. 5mL 离心管中。
[0028] 2)在50mL离心管中混合裂解缓冲液和蛋白酶K(终浓度10 μ g/mL)，向装有鼠尾 的离心管中每管加入500 μ L裂解液。
[0029] 3) 55°C放置6个小时以上（消化过程中样品的充分混合是非常重要的。判断依据 是看不到鼠尾，混合液呈灰色乳状液）。
[0030] 4)取出裂解充分的样品管，每管加入300 μ L饱和NaCl溶液，颠倒混合6?8次， 冰浴15min。
[0031] 5) 12000rpm室温离心15min，小心地将上清移至新的1. 5mL离心管中（尽量避免 沉淀被搅动，保证每管倒出的上清等量）。
[0032] 6)加入700 μ L的异丙醇（此量根据倒出的上清确定，异丙醇与上清等体积）于 各管，颠倒直至形成絮状沉淀（如没有出现絮状沉淀，可将其置于_20°C 2小时或者4°C过 夜）。
[0033] 7) 12000rpm室温离心15min，弃上清（小心观察白色DNA沉淀，确保其没有被倒 掉）。
[0034] 8)加入500 μ L的70%乙醇于各管，颠倒冲洗DNA沉淀。
[0035] 9) lOOOOrpm离心lmin，用200μ L的枪头将乙醇吸掉，留下DNA沉淀在管内（小心 别吸走DNA沉淀，此步所用的枪头在各管间操作不需要更换）。
[0036] 10)自然风干DNA沉淀10min。
[0037] 11)将DNA沉淀重溶于20 μ L的超纯水中，储存于-20°C冰箱或直接进行PCR。
[0038] 2、PCR鉴定小鼠基因型
[0039] (1)试验准备
[0040] 1) PCR 鉴定用 2 X Taq PCR MasterMix 和 lOObp DNA ladder (Marker)购自北京天 根生化科技公司。
[0041] 2)引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列如下。
[0042] 鉴定⑶lie-小鼠基因型（货号：007567)引物序列如下：
[0043]
【权利要求】
1. 树突状细胞表达的TGF-β 1在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。
2. -种抗动脉粥样硬化的药物，其特征在于：包含树突状细胞表达的TGF-β 1。
【文档编号】A61K38/18GK104147593SQ201410336639
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】李雅林, 唐华, 宋文刚, 刘有旺 申请人:泰山医学院