小RNA miR-20b在制备抗炎药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种非编码小RNA基因miR-20b在制备抗炎药物中的应用，所述炎症是主要由反应性Th17细胞广泛参与并发挥重要致病作用的炎症反应。本发明所述的miR-20b在反应性Th17细胞中特异性低表达，且分别给na?veCD4+T细胞转染miR-20b模拟体或miR-20b阴性对照后，miR-20b模拟体能够显著减少细胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表达，且miR-20b不改变Th17细胞增殖和凋亡的水平，表明miR-20b能够有效抑制Th17细胞的分化且不依赖对细胞数量的调控。
【专利说明】小RNA miR-20b在制备抗炎药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】，涉及非编码小RNA基因 miR-20b在药物上的应用， 特别涉及miR-20b在制备涉及自身免疫性疾病相关药物和抗炎药物的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫系统稳态是维持机体正常运行的基础，其通过产生各种免疫细胞及分泌各种 细胞因子和抗体来抵御外来物侵扰或调控相关免疫进程，而免疫细胞的异常分化或细胞因 子的表达异常则会导致各种炎症的发生。
[0003] Thl7细胞可以分泌细胞因子IL-17A和IL-17F，并表达亚系特异性转录因子R0RC (小鼠中为RORYt)。在Thl7细胞的产生过程中，转录生长因子-β (TGF-β)和炎症细胞 因子IL-6, IL-21，IL-Ιβ和IL-23等发挥重要调控作用。Thl7细胞对于胞外病原体的清 除至关重要，其中包括念球菌属和克雷伯氏菌属等病原菌，但是，在特定条件下，Thl7细胞 及其效应性细胞因子IL-17、IL-21、IL-22、GM-CSF和CCL20等也会引起一些自身免疫性和 炎症性疾病的发生，例如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、银屑病、肠炎、过 敏和哮喘等。
[0004] 微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一个庞大的家族，大约为21nt (核苷酸）长度的 非编码RNAs，通过转录水平或翻译水平调节基因表达从而发挥其调控作用，广泛存在于包 括植物和动物在内的真核生物中。miRNAs可以影响生长发育、细胞进程(增殖、凋亡、粘附、 迁移等）等，对人类癌症发生及免疫系统调节均发挥重要调控作用。
[0005] 近年，miRNAs在免疫系统中的重要作用日益被揭示，已经证实miRNAs广泛参与了 免疫系统的发育，以及各种淋巴细胞的分化和抗体产生。在一些炎症性疾病中，诸如类风湿 关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮，miRNAs广泛参与了疾病的起始和进展。而通过 干预相关miRNAs的异常表达可以有效缓解疾病的发生和发展。
[0006] 我们认为通过鉴定并研究miRNAs在某些炎症中的表达及作用，可以发现一批关 键的miRNAs从而可以有效提商这种炎症的诊断及治疗水平。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种小分子RNA基因 miR_20b在制备抗炎药物中的应用，该 miR-20b能够有效抑制由Thl7细胞引起的炎症反应。
[0008] 本发明所述的miR-20b在Thl7细胞中特异性低表达，且分别给na'ive⑶4+ T细 胞转染miR-20b模拟体或miR-20b阴性对照后，miR-20b模拟体能够显著减少细胞因子白 介素17A基因水平以及蛋白水平表达，且miR-20b不改变Th 17细胞增殖和凋亡的水平，表 明miR-20b能够有效抑制Thl7细胞的分化且不依赖对细胞数量的调控。
[0009] 本发明所述的应用为小RNA miR-20b在制备抗炎药物中的应用，该治疗抗炎的药 物为治疗由反应性Thl7细胞广泛参与并发挥重要致病作用的炎症反应的药物，如特别参 与的涉及自身免疫性疾病及炎症相关的药物。
[0010]本发明提供的 miR-20b 由以下核苷酸组成：5' -CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3'。 [0011] 本发明首先在体外分化由流式细胞仪分选的幼稚型（na'ive)CD4 + T细胞，从而得 到体外分化的中性（1^11壮&1)、1111、1112、11117、诱导型调节性1'(1'^8)细胞，并利用实时定 量PCR (real-time PCR)技术分析miR-20b的表达，结果发现分别与neutral分化细胞相 t匕，miR-20b在Thl7细胞中较之Thl、Th2和Treg细胞特异性低表达。
[0012] 其次，本发明中流式分选na'ive⑶4+ T细胞，在Thl7条件下分化培养，分别给细胞 转染 miR_20b 阴性对照（miR_20b NC)及模拟体（miR_20b mimics)后，miR_20b mimics 能 够显著减少细胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表达，表明miR-20b能够有效抑制 Thl7细胞的分化。
[0013] 同时，本发明中流式分选na'ive⑶4+ T细胞，在Thl7条件下分化培养，分别给细 胞转染miR-20b阴性对照（miR-20b NC)及模拟体（miR-20b mimics)后，检测发现miR-20 mimics在体外对Thl7细胞的增殖和凋亡是没有影响的。说明miR-20b在本质上对Thl7细 胞的分化产生了抑制，而不会改变细胞的数量。
[0014] 因此，miR-20b在制备由Thl7细胞特别参与的涉及自身免疫性疾病及炎症相关的 药物方面有巨大潜力。
[0015] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1 :体外不同分化方向⑶4+ T细胞中miR-20b的表达检测； 图2 :流式细胞术检测miR-20b在体外抑制Thl7细胞表达IL-17A ; 图3 :real-time PCR技术检测miR-20b在体外抑制Thl7细胞表达IL-17A ; 图4 :ELISA技术检测miR-20b在体外抑制Thl7细胞分泌IL-17A ; 图5 :miR-20b在体外对Thl7细胞增殖影响的统计学分析； 图6 :流式细胞术检测miR-20b在体外对Thl7细胞的增殖没有影响； 图7 :流式细胞术检测miR-20b在体外对Thl7细胞的凋亡没有影响。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 : 选取6-8周野生型小鼠，制备脾及淋巴结单细胞悬液，用APC-anti⑶4, Pe-Cy5-anti CD44，PE-anti CD62L抗体，4°C避光表面染色15min;RPMI 1640培养基，4°C洗细胞两次； 用RPMI 1640培养基将细胞浓度调整为5X107 cell/ml，流式分选CD4+ 0)44^0)621^^10 为naive CD4+ T细胞；得到naive CD4+ T细胞前，用10 μ g/ml CD3抗体包板，37°C，2h备 用；按下面细胞因子浓度刺激细胞，使其向neutral (培养48小时）、Thl (培养48小时）、 Th2 (培养48小时）、Thl7 (培养72小时）和Treg (培养72小时）方向分化。
[0018] Neutral: anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; anti-IL-4 10 μg/ml; anti-IFN-y 10 μ g/ml〇
[0019] Thl:anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; rmIL-12 5 ng/mL; anti-IL-4 10 μ g/ml〇
[0020] Th2:anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; IL-4 20 ng/mL; anti-IFN-γ 10 μ g/ml〇
[0021] Thl7:anti-CD28 lug/ml; TGF-β 2ng/mL; IL-6 10 ng/mL; anti-IL-4 10ug/ ml; anti-IFN- γ 10ug/ml〇
[0022] Treg:anti_CD28 1 μ g/ml; rmIL-2 2ng/ml; TGF-β 2 ng/mL。
[0023] 上面培养细胞用Trizol法提取细胞总RNA，分别取总RNA各10ng为模板，然后利 用 TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies)反转录为 cDNA， 反应体系如下：dNTPs (100mM)0. 15 ul;MultiScribe? 逆转录酶1 ul;10XRTbuffer 1. 5 μ 1 ；RNase inhibitor (20 U/ μ 1)0. 19 μ 1 ；RT primer 2. 0 μ 1 ；Total RNA 5 μ 1 ； DEPC H20 补至总体积 15μ1。反应条件：16°C 30 min，42°C 30 min，85°C 5 min 使酶失活， 4°C保存。
[0024] 再以 cDNA 为模板，利用 Premix Ex Taq? (Probe qPCR) (Takara)试剂盒进行 Real-time PCR。反应体系如下：2XPCR mix 10 ul;cDNA 2 ul;Probe 0.4 ul;DEPC H20 7.6 μ?。反应条件：95DC，2 min;95DC 15 sec，60DC 30 sec，40 个循环，以 U6 为内参 对照。采用f λλ ct相对定量法来处理数据。
[0025] Real-time PCR 结果显不，相对于 neutral 分化细胞，miR_20b 在 Thl、Th2、Treg 分 化细胞中高表达，分别上调为1. 54、3. 07和1. 53倍，在Thl7分化细胞中特异性低表达，下 调达0. 53倍（图1)。
[0026] 实施例2 : 按照实施例1中方法分选得到na'ive⑶4+ T细胞。FAM标记的miR_20b mimics及nc 由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列分别如下： miR-20b mimics ： 5, -CAAA⑶GCUCAUA⑶GCAG⑶AG-3， 5, -ACCUGCACUAUGAGCACUU腳U-3 miR-20b nc ： 5, -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3， 5, -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3， 所得na'ive CD4+ T细胞按照实施例1中方法使其向Thl7细胞方向分化，同时将FAM 标记的miR-20b mimics及nc分别转染至上面细胞中，转染试剂为美国invitrogen公司 的Lipofectamine? 2000试剂，继续培养72h后，收获细胞前4-6h，在新鲜的培养基中加入 PMA、Inomycin和Golgi Plug以刺激细胞分泌相应细胞因子达到检测丰度。吸取细胞于5ml BD流式管，补加冰冷的1 XPBS，4°C，1400rpm离心7min，弃上清，lml 2%甲醛重悬细胞，室温 避光固定30min。固定结束，用冰冷的PBS清洗细胞两次后，用2ml 0.5% Saponin重悬，室 温避光打孔 30min。尔后 4°C，1400rpm 离心 7min，弃上清，加 FITC- anti-mouse IFN-γ、 PE- anti-mouse IL_17A、APC_ anti-mouse CD4,4°C，避光染色30min。染色结束，补满0.5% Saponin，4°C，1400rpm 离心 7min，弃上清。用 4ml 1 XPBS 重悬，4°C，1400rpm 离心 7min 后 用美国BD公司FACS Calibur Flow Cytometer仪器检测CD4+IL-17A+细胞比例。
[0027] 结果显示miR-20b mimics可以显著抑制CD4+IL-17A+细胞的比例（图2)。
[0028] 实施例3 : 完全按照实施例2中方法得到na'ive CD4+ T细胞，同时使其向Thl7细胞方向分化并 将miR-20b抑制剂（inhibitor)、mimics及nc分别转染至上面细胞中，培养72h后，收获 细胞，按照实施例1中方法得到细胞的总RNA，并按照实施例1中Real-time PCR方法分析 IL-17A 和 IL-17F 表达。
[0029] miR_20b inhibitor 序列如下： 5, -CUACCUGCACUAUGAGCACUUUG-3， 结果显示miR-20b mimics可以显著抑制IL-17A和IL-17F的表达（图3)。
[0030] 实施例4 : 按照实施例3中方法得到na'ive CD4+ T细胞，同时使其向Thl7细胞方向分化并将 miR-20binhibitor、mimics及nc分别转染至上面细胞中，培养72h后，收获上清，用美国 BioLegend公司的Mouse IL-17 ELISA kits试剂盒按照ELISA方法分析IL-17A的分泌表 达。
[0031] 结果显不miR_20b mimics可以显著抑制IL-17A的分泌表达（图4)。
[0032] 实施例5 : 用美国BD公司的APC BrdU Flow Kit检测miR-20b对Thl7细胞增殖的影响。按照 实施例2中方法得到na'ive CD4+ T细胞，同时使其向Thl7细胞方向分化并将FAM荧光标 记miR-20b mimics及nc分别转染至上面细胞中。按照终浓度为10 μΜ在培养细胞起始或 者收获细胞1小时前于细胞培养上清中加入BrdU进行孵育。转染72小时后，细胞用ΡΕ-antinouse CD4 抗体于冰上染色 15min。然后用 Cytofix/Cytoperm Buffer 和 Cytoperm Permeabilization Buffer Plus对细胞进行固定和打孔，并用APC标记的BrdU抗体染色， 最后用美国BD公司FACS Calibur Flow Cytometer仪器检测细胞增殖。
[0033] 结果显示miR-20b对Thl7细胞增殖没有影响（图5和图6)。
[0034] 实施例6 : 按照实施例2中方法得到na'ive⑶4+ T细胞，同时使其向Thl7细胞方向分化并将FAM 突光标记miR-20b mimics及nc分别转染至上面细胞中。细胞转染72小时后，用天津三箭 生物技术有限公司的Annexin V-APC Cell Apoptosis Analysis Kit检测miR_20b对Thl7 细胞凋亡的影响。
[0035] 结果显示miR-20b对Thl7细胞凋亡没有影响（图7)。
[0036] 虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而其并非用以限定本发明，任何所属技 术领域的技术人员，在不脱离本发明精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明 之保护范围当视权利要求所界定者为准。
【权利要求】
1. 小RNA miR-20b在制备抗炎药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述抗炎药物为治疗由反应性Thl7细胞广 泛参与并发挥重要致病作用的炎症反应的药物。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述miR-20b由以下核苷酸组成： 5, -CAAA⑶GCUCAUA⑶GCAG⑶AG-3，。
【文档编号】A61P37/02GK104147615SQ201410349266
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】尹芝南, 吴震州, 赵立青, 朱恩东 申请人:南开大学