一种那屈肝素钙的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种那屈肝素钙的制备工艺，包括以下步骤：S1肝素钠的降解；S2降解液的还原；S3紫外照射：用的紫外灯照射还原液，消除还原液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量；S4转钙和浓缩：用5％氯化钙溶液在超滤膜上超滤，将还原液浓缩成固液比为1∶10的浓度；S5阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂进行层析，收集洗脱液；S6冻干，得到所述的那屈肝素钙。该工艺通过阴离子交换层析来控制低分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1％以内精确控制，同时收率能提高至50％以上，并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障。
【专利说明】-种那屈肝素钙的制备工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药和化学领域中的一种药用化学药品的制备，具体涉及一种高质量 高纯度的精品那屈肝素钙的制备工艺。
【背景技术】
[0002] 普通肝素是含多种氨基葡萄糖苷的混合物。肝素钙在体内外能延缓或阻止血液凝 固。其抗凝机理复杂，对凝血的各个环节均有作用，包括抑制凝血酶原转变为凝血酶、抑制 凝血酶活性、妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白、防止血小板聚集。肝素钙还可以降低血脂， 降低LDL和VLDL，升高HDL，改变血液粘滞度，保护血管内皮细胞，预防动脉粥样硬化，促进 血液流动，改善冠状动脉循环等作用。
[0003] 肝素钙的抗F II a作用较肝素钠强，抗FXa作用较肝素钠弱。由于其是以钙盐形 式在体内发挥作用，经皮下注射后，在血液循环中缓慢扩散，不会减少局部细胞间毛细血管 的钙胶质，也不改变血管通透性，几乎无肝素钠皮下注射可引起局部出血的副作用。适用于 预防和治疗血栓-栓性疾病以及血栓形成。肝素钙还具有较明显的抗肾素和抗醛固酮活 性，故亦适用于人工肾、人工肝和体外循环使用。
[0004] 目前，国内有采用酒精分级沉淀、超滤膜分离、分子筛和凝胶吸附分离的方法来控 制小分子肝素钙的分子量，酒精分级沉淀技术落后，超滤膜分离损失大量收率，分子筛效率 低，凝胶吸附分离法代价昂贵，这些因素都限制了该产品的工业化生产和产能的扩大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种那屈肝素钙的制备工艺，该工艺通过阴离子交换层析来 控制低分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1%以内精确控制，同时收率能提高至50% 以上，并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障；克服了现有技术中的分 离方法收率低，代价昂贵、自动化程度低的缺点。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
[0007] -种那屈肝素钙的制备工艺，该制备工艺包括以下步骤：
[0008] S1肝素钠的降解：以肝素钠为原料，并将其溶解，调节pH至酸性，然后加入亚硝酸 钠，搅拌反应3?6小时，得到降解液；
[0009] S2降解液的还原：将降解液的pH调节至中性，加入硼氢化钠，10°C?30°C搅拌反 应12?24小时，得到还原液；
[0010] S3紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45?90分钟，消 除还原液中残留的亚硝基化合物，降低Ν-Ν0基团含量；
[0011] S4转钙和浓缩：将紫外照射后的还原液用10?20倍重量的5%氯化钙溶液在 lOOODa的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液 比为1 : 10的浓度，准备进行阴离子交换层析；
[0012] S5阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin 上样，温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300?500mmol/L的氯化钠溶液洗 涤，再用1?2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗 脱液，检测分子量分布为重均分子量3800?4800 ;
[0013] S6冻干：向洗脱液中加入酒精进行沉淀，静置过夜，弃去上清液，沉淀再加酒精进 行脱水，弃去上清，加入纯化水溶解，除菌，冻干，得到所述的那屈肝素钙。
[0014] 进一步优选地，步骤S1中的肝素钠的降解具体方法为：以肝素钠为原料，并将其 溶解于其重量的10?30倍纯化水中，调节pH至酸性，加入重量为肝素钠2%?5%的亚硝 酸钠，保温l〇°C?30°C搅拌反应3?6小时的降解液然后加入亚硝酸钠，搅拌反应3?6 小时，得到降解液。
[0015] 进一步优选地，用醋酸将pH调节至4?5。
[0016] 进一步优选地，亚硝酸钠的加入量为肝素钠重量的2. 1 %?2. 5%。
[0017] 进一步优选地，步骤S2中硼氢化钠的加入量为肝素钠重量的0. 5%?2%。
[0018] 进一步优选地，步骤S6中所述冻干的具体方法为：向洗脱液中加入两倍酒精进行 沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液，沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，力口 入一定量的纯化水溶解，除菌，在-40?-10°C下进行冻干，得到所述的那屈肝素钙。
[0019] 进一步优选地，所述的除菌为通过除菌膜进行除菌。
[0020] 本发明提供了一种那屈肝素钙的制备工艺，该工艺通过阴离子交换层析来控制低 分子肝素钙的分子量，使得分子量能在1 %以内精确控制，同时收率能从30%以下提高至 50%以上，且该方法能够制备出高纯度、高活性的那屈肝素钙产品，产品质量明显高于EP 现行版药典标准；并且自动化程度高，操作便捷，为提升产能提供了有力保障；故该方法具 有重要的工业应用前景。
【具体实施方式】
[0021] 本发明实施例所述的一种那屈肝素钙的制备工艺，下面以具体实验案例为例来说 明【具体实施方式】，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定 本发明。
[0022] 实施例1 :那屈肝素钙的制备
[0023] 肝素钠的降解：按30kg肝素钠投料，溶解于21?30倍肝素钠重量的纯化水中，调 节pH至5. 5?6,加入投料量4. 5%?5%的亚硝酸钠，保温10°C?30°C搅拌反应3?6小 时的降解液。
[0024] 降解液的还原：将降解液的pH调回至中性，加入肝素钠投料量的1. 5%?2%的硼 氢化钠，l〇°C?30°C搅拌反应12?24小时，得到降解还原液。
[0025] 紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45?90分钟，消除溶 液中残留的亚硝基化合物，降低Ν-Ν0基团含量。
[0026] 转钙、浓缩：还原液用10?13倍肝素钠重量的5%氯化钙溶液在lOOODa的超滤 膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成约1 : 10的浓度，准 备上阴离子层析柱。
[0027] 阴离子交换层析调节分子量：采用GE healthcare公司生产的Q Sepharose FF 阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为 UV232nm，上样结束后先用300?500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1?2mol/L的氯化钠 溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均 分子量3800?4800。
[0028] 放入冰箱冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天 弃去上清液,沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过 除菌膜，进箱冻干，收得最终产品17. 5kg，收率为58. 33%。
[0029] 实施例2 :那屈肝素钙的制备
[0030] 肝素钠的降解：按30kg肝素钠投料，溶解于15?20倍肝素钠重量的纯化水中，调 节pH至4. 5，加入投料量2%?2. 3%的亚硝酸钠，保温15°C?30°C搅拌反应3?6小时的 降解液。
[0031] 降解液的还原：将降解液的pH调回至中性，加入肝素钠投料量的0. 6%?1 %的硼 氢化钠，15°C?20°C搅拌反应12?24小时，得到降解还原液。
[0032] 紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45?90分钟，消除溶 液中残留的亚硝基化合物，降低Ν-Ν0基团含量。
[0033] 转钙、浓缩：还原液用13?16倍肝素钠重量的5%氯化钙溶液在lOOODa的超滤膜 上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比约为1 : 10的 浓度，准备上阴离子层析柱。
[0034] 阴离子交换层析调节分子量：采用GE healthcare公司生产的Q Sepharose FF 阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为 UV232nm，上样结束后先用300?500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1?2mol/L的氯化钠 溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液，检测分子量分布为重均 分子量3800?4800。
[0035] 放入冰箱冻干：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天 弃去上清液,沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，溶解液过 除菌膜，进箱冻干，收得最终产品18.4kg。
[0036] 实施例3 :那屈肝素钙的制备
[0037] 肝素钠的降解：按30kg肝素钠投料，溶解于10?14倍肝素钠重量的纯化水中，调 节pH至5，加入投料量3%?4%的亚硝酸钠，保温20°C?30°C搅拌反应3?6小时的降解 液。
[0038] 降解液的还原：将降解液的pH调回至中性，加入肝素钠投料量的0. 5%?0. 8%的 硼氢化钠，l〇°C?30°C搅拌反应12?24小时，得到降解还原液。
[0039] 紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45?90分钟，消除溶 液中残留的亚硝基化合物，降低Ν-Ν0基团含量。
[0040] 转钙、浓缩：还原液用17?20倍的5%氯化钙溶液在lOOODa的超滤膜上超滤，将 肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比为1 : 10的浓度，准备上 阴离子层析柱。
[0041] 阴离子交换层析调节分子量：采用GE healthcare公司生产的Q Sepharose FF 阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样，温度为室温，检测波长为 UV232nm，上样结束后先用300?500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再用1?2mol/L的氯化钠
【权利要求】
1. 一种那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：该制备工艺包括以下步骤： S1肝素钠的降解：以肝素钠为原料，并将其溶解，调节pH至酸性，然后加入亚硝酸钠， 搅拌反应3?6小时，得到降解液； S2降解液的还原：将降解液的pH调节至中性，加入硼氢化钠，10°C?30°C搅拌反应 12?24小时，得到还原液； S3紫外照射：室温下用254nm波长的紫外灯插入还原液中照射45?90分钟，消除还 原液中残留的亚硝基化合物，降低N-NO基团含量； S4转钙和浓缩：将紫外照射后的还原液用10?20倍重量的5 %氯化钙溶液在lOOODa 的超滤膜上超滤，将肝素钠上的钠离子转化为钙离子的同时，将还原液浓缩成固液比为 1 : 10的浓度，准备进行阴离子交换层析； S5阴离子交换层析：采用阴离子交换树脂，按25-35mg低分子肝素钙/ml-resin上样， 温度为室温，检测波长为UV232nm，上样结束后先用300?500mmol/L的氯化钠溶液洗涤，再 用1?2mol/L的氯化钠溶液洗脱，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳，收集洗脱液， 检测分子量分布为重均分子量3800?4800 ; S6冻干：向洗脱液中加入酒精进行沉淀，静置过夜，弃去上清液，沉淀再加酒精进行脱 水，弃去上清，加入纯化水溶解，除菌，冻干，得到所述的那屈肝素钙。
2. 根据权利要求1所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：步骤S1中的肝素钠的 降解具体方法为：以肝素钠为原料，并将其溶解于其重量的10?30倍纯化水中，调节pH至 酸性，加入重量为肝素钠2%?5%的亚硝酸钠，保温10°C?30°C搅拌反应3?6小时的降 解液然后加入亚硝酸钠，搅拌反应3?6小时，得到降解液。
3. 根据权利要求2所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：用醋酸将pH调节至 4?5〇
4. 根据权利要求2所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：亚硝酸钠的加入量为 肝素钠重量的2. 1 %?2. 5%。
5. 根据权利要求1所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：步骤S2中硼氢化钠的 加入量为肝素钠重量的〇. 5%?2%。
6. 根据权利要求1所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：步骤S6中所述冻干的 具体方法为：向洗脱液中加入两倍酒精进行沉淀，开启冷媒，静置过夜，第二天弃去上清液， 沉淀再加一倍酒精进行脱水，弃去上清，加入一定量的纯化水溶解，除菌，在-40?-10°C下 进行冻干，得到所述的那屈肝素钙。
7. 根据权利要求6所述的那屈肝素钙的制备工艺，其特征在于：所述的除菌为通过除 菌膜进行除菌。
【文档编号】A61P37/08GK104086673SQ201410361423
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】周翔, 金晶, 陶翎, 费清清 申请人:常州千红生化制药股份有限公司