双链rna或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用的制作方法

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双链rna或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了双链RNA或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用。本发明所提供的双链RNA或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用,所述双链RNA的一条链序列为序列表中SEQ?ID?No.1,所述双链RNA的另一条链序列为序列表中SEQ?ID?No.2;所述双链RNA的修饰物是经过下述A1)或A2)或A3)修饰得到的双链RNA修饰物:A1)对所述双链RNA的核糖的2′-OH进行修饰;A2)对所述双链RNA的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰;A3)对所述双链RNA的核糖的5′端连上胆固醇的修饰。实验证明,本申请的2′-OMe-dsRNA21或其修饰物能有效抑制肿瘤和肿瘤细胞。
【专利说明】双链RNA或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】中双链RNA或其修饰物在制备肿瘤抑制剂中的应用。

【背景技术】
[0002] RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种分子生物学上与祀基因序列同源的短 双链RNA(dsRNA)诱导的序列特异性的特别有效的转录后基因沉默现象(Fire,1998),其机 制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码 区同源的双链RNA时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi是真核细胞特有的一 种基因沉默机制,在决定细胞命运、细胞分化方向及存留等方面起着极为重要的作用。由 于RNAi具有锁定任何引起疾病或疾病相关蛋白表达的能力,且RNAi技术特异性高,作用迅 速,副反应小,在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统没有影响。目前RNAi已 作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极 为迅速。
[0003] 微小核酸(miRNA)是一种内源的、在体内广泛表达的包含21?25个核苷酸的内 源性非编码小RNA,是引起RNA干扰现象直接原因的物质之一。miRNA由具有发夹结构的约 70?90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,在进化上高度保守,通过翻 译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性。每个miRNA可以有多个调控(靶)基因, 而几个miRNA也可以调节同一个基因,据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因 。miRNA 调节机体重要的生理与病理过程,在细胞分化,生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大 作用,且具有很强的组织特异性,已经引起越来越多的研究人员的关注。
[0004] 周期蛋白依赖性激酶4 (cyclin dependent kinase 4,Q)K4)作为一种重要的周 期蛋白。研究表明肿瘤细胞恶性增殖主要是由于细胞周期的失调所导致,Cyclin D-CDK4/ ⑶K6是调控细胞周期由G1向S期的过渡关键因子。⑶K4基因己被证实是一种癌基因,与 肿瘤的发生、发展及患者的预后密切相关。在多种肿瘤细胞如胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、 子宫内膜癌、肝癌和癌变组织中都发现伴随有CDK4的过度表达和过度活化现象,因此CDK4 可做为肿瘤基因治疗中的一个潜在祀点。
[0005] 此外G1期是增殖细胞唯一能接受从外界传入的增殖或抑制增殖信号的时期,作 用在G1期或G1/S交界期,启动细胞周期和促进DNA合成的cyclin D是一个比其它cyclins 更加敏感的指标。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何抑制肿瘤细胞和/或抑制肿瘤。所述抑制肿瘤 细胞可为抑制肿瘤细胞增殖,所述抑制肿瘤可为抑制肿瘤的发生和/或抑制肿瘤的生长。
[0007] 为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种双链RNA或其修饰物在制备肿瘤抑 制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用,所述双链RNA,其名称为dsRNA21,所述dsRNA21的一条链 的从5'端至3'端的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1,所述dsRNA21的另一条链的从 3'端至5'端的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2。
[0008] 其中,SEQ ID No. 1由21个核糖核苷酸组成,SEQ ID No. 2由21个核糖核苷酸组 成,SEQ ID No. 1的第1-19位核糖核苷酸与SEQ ID No. 2的第3-21位核糖核苷酸反向互 补,将二者形成的双链RNA命名为dsRNA21。
[0009] 上述应用中,所述修饰物具体可为对所述dsRNA21进行修饰得到的双链RNA修饰 物,其名称为dsRNA21-mimic。所述双链RNA修饰物中,各种修饰方法均可选用,包括选自核 糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合等。如可对所述dsRNA21进行下 述A1)或A2)或A3)的修饰得到所述双链RNA修饰物:
[0010] A1)对所述dsRNA21的核糖的W -0H进行修饰;
[0011] A2)对所述dsRNA21的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰;
[0012] A3)对所述dsRNA21的核糖的Y端连上胆固醇的修饰。
[0013] 上述应用中,所述对所述dsRNA21的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰为将所 述磷酸二酯键的氧用硫取代;所述对所述dsRNA21的核糖的2' -0H进行修饰为将所述 2' -0H用甲氧基或氟取代或者对所述2' -0H进行脱氧修饰。
[0014] 在本发明的一个实施例中,所述双链RNA修饰物是将所述dsRNA21的SEQ ID No. 2 所示链中所有胞苷酸的2' -0H均取代为甲氧基且SEQ ID No. 1所示链未进行修饰得到的 修饰物,其名称为2' -0Me-dsRNA21。
[0015] 上述应用中,所述肿瘤细胞抑制剂可为抑制肿瘤细胞增殖的产品(如药物)和/ 或促进肿瘤细胞凋亡的产品(如药物或疫苗),所述肿瘤抑制剂可为抑制肿瘤发生的产品 (如药物或疫苗)和/或抑制肿瘤生长的产品(如药物或疫苗)。
[0016] 上述应用中,所述肿瘤可为鼻咽癌、肠癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 细胞肺癌或子宫内膜癌。
[0017] 上述应用中,所述抑制肿瘤细胞增殖可为抑制肿瘤细胞增殖的G1期。
[0018] 为解决上述技术问题,本发明还提供了与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑 制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。
[0019] 本发明所提供的与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制 剂中的应用中,所述生物材料为下述Bl)-B12)中的任一种:
[0020] B1)编码所述dsRNA21的DNA分子;
[0021] B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒;
[0022] B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体;
[0023] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
[0024] B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物;
[0025] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
[0026] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
[0027] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物;
[0028] B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系;
[0029] B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系;
[0030] B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系;
[0031] B12)含有M)所述重组载体的转基因动物细胞系。
[0032] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,所述肿瘤可为肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌或子宫内 膜癌。
[0033] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,B2)所述的含有编码dsRNA21的DNA分子的表达盒(dsRNA21表达盒)是指能够在宿主 细胞中表达dsRNA21的DNA,该DNA不但可包括启动dsRNA21转录的启动子,还可包括终止 dsRNA21转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
[0034] 可用现有的表达载体构建含有所述dsRNA21表达盒的重组载体。
[0035] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0036] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,B5)_B8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
[0037] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,B9)_B12)所述的转基因动物细胞系不包括繁殖材料。
[0038] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,所述肿瘤抑制剂可为抑制肿瘤发生的抑制剂和/或抑制肿瘤生长的抑制剂。
[0039] 上述与dsRNA21相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用 中,所述肿瘤细胞抑制剂为抑制肿瘤细胞增殖的产品和/或促进肿瘤细胞凋亡的产品。
[0040] 上述应用中,所述抑制肿瘤细胞增殖可为抑制肿瘤细胞增殖的G1期。
[0041] 下述Ml)或M2)的用途,也属于本发明的保护范围:
[0042] Ml)所述dsRNA21或所述dsRNA21-mimic在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白D表达试 剂中的应用;
[0043] M2)所述dsRNA21或所述dsRNA21-mimic在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白依赖性激 酶4表达试剂中的应用。
[0044] 上述用途中,所述肿瘤可为肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 细胞肺癌或子宫内膜癌。
[0045] 上述用途中,所述细胞周期蛋白D可为细胞周期蛋白D3。
[0046] 下述M3)或M4)的用途,也属于本发明的保护范围:
[0047] M3)上述生物材料Bl)-B12)在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白D表达试剂中的应用;
[0048] M4)上述生物材料Bl)-B12)在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白依赖性激酶4表达试剂 中的应用。
[0049] 上述用途中,所述肿瘤可为肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小 细胞肺癌或子宫内膜癌。
[0050] 上述用途中,所述细胞周期蛋白D可为细胞周期蛋白D3。
[0051] 为解决上述技术问题,本发明还提供了治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫 苗)。
[0052] 本发明所提供的治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫苗),其活性成分为所述 dsRNA21或所述dsRNA21-mimic或上述生物材料Bl)-B12)中任一种。
[0053] 上述治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫苗)中,所述治疗和/或预防肿瘤 的产品可为治疗和/或预防肿瘤的药物,所述药物的剂型可为粉针剂。
[0054] 上述治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫苗)中,所述肿瘤为肠癌、鼻咽癌、 宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌或子宫内膜癌。
[0055] 上述治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫苗)中,所述药物还可以包含其 它药学上可接受的载体。本文所用的"药学上可接受的载体"应当与本发明药物中的双 链RNA分子相容。所述"药学上可接受的载体"是指体内转染试剂,如聚乙烯亚胺(PEI), jetPEI (线性聚乙烯亚胺),脂质体,转铁蛋白,叶酸、纳米乳、纳米粒等。可作为药学上可 接受的载体或其组分的一些物质的其他例子是冻干保护剂糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀 粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬 脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如 甘油、甘露糖醇;海藻酸;乳化剂,如Tween ;磷脂,如卵磷脂,大豆磷脂,磷脂酰乙醇胺,磷脂 酰甘油,磷脂酰肌醇,磷脂酰丝氨酸,硬脂酰胺;胆固醇;大分子高聚物,如聚乙烯亚胺,壳 聚糖,透明质酸;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防 腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等;生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。
[0056] 上述治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫苗)中,所述粉针剂可以生理盐水 或者等渗葡萄糖水溶液为溶剂。
[0057] 上述治疗和/或预防肿瘤的产品(如药物或疫苗)中,所述粉针剂可以甘露醇为 冻干保护剂。
[0058] 上述粉针剂的制备方法,也属于本发明的保护范围。
[0059] 上述粉针剂的制备方法,包括样品准备、预冻、一次干燥(升华干燥)、二次干燥 (解吸干燥)和密封保存五个步骤。
[0060] 实验结果显示,本申请的dsRNA21或其修饰物能显著抑制鼻咽癌细胞的增殖:鼻 咽癌细胞在经V -0Me-dsRNA21处理48h时,2' -0Me-dsRNA21抑制了 27.7%的鼻咽癌 细胞增殖;在经W -0Me-dsRNA21处理72h时,2' -0Me-dsRNA21抑制了 33. 7%的鼻咽癌 细胞增殖;在经,-0116-(181?隱21处理9611时,2'-016-(181?隱21抑制了30.7%的鼻咽癌 细胞增殖;在经W -0Me-dsRNA21处理10天时,鼻咽癌细胞的克隆数为320个± 13个,经 2' -OMe-NC处理的鼻咽癌细胞的克隆数为147个±14个。
[0061] 本申请的dsRNA21或其修饰物能抑制细胞从G1期向S期的过渡:经 2' -0Me-dsRNA21处理的S期鼻咽癌细胞中含有Edu细胞的百分比为21.94±3. 08%, 经2' -〇Me-NC处理的S期鼻咽癌细胞中含有Edu细胞的百分比为37. 5±4. 49%,调控细 胞周期的关键因子⑶K4基因在经V -0Me-dsRNA21处理的鼻咽癌细胞中的表达为在经 2' -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞中的表达的74. 3%,CCND3基因在经W -0Me-dsRNA21处 理的鼻咽癌细胞中的表达为在经2' -OMe-NC处理的鼻咽癌细胞中的表达的60. 8%。
[0062] 本申请的dsRNA21或其修饰物能抑制肿瘤重量、肿瘤体积的增加:NC组裸鼠肿瘤 的平均重量为0. 043g±0. 015g,dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均重量为0. 023g±0. 0084g ;注 射针剂两天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为30. 74mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为 20. 53mm3 ;注射针剂四天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为37. 74mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的 平均体积为30. 41mm3 ;注射针剂六天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为65. 20mm3, dsRNA21组 裸鼠肿瘤的平均体积为45. 27mm3 ;注射针剂八天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为75. 21mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为51. 94mm3 ;注射针剂十天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积 为93. 97mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为73. 05mm3。
[0063] 实验表明,本申请的2' -0Me-dsRNA21或其修饰物能够有效抑制肿瘤和肿瘤细 胞。

【专利附图】

【附图说明】
[0064] 图1为分别经W -0Me_dsRNA21和W -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞个数。其中, dsRNA21表示V -0Me-dsRNA21,miR-NC表示V -〇Me-NC,图A为鼻咽癌细胞在分别经 2 ^ -0Me-dsRNA21和W -〇Me-NC处理96小时细胞个数变化情况;图B为鼻咽癌细胞在经 2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC处理96h内细胞个数的变化曲线;图C为鼻咽癌细胞在 分别经W -0Me-dsRNA21和V -〇Me-NC处理72小时的外观图;图D为鼻咽癌细胞在经 2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC处理10天后的细胞个数。
[0065] 图2为经W -0Me-dsRNA21和2' -〇Me_NC处理的S期鼻咽癌细胞中含有Edu的 细胞。其中,NC表示W -0Me-NC,dsRNA21表示W -0Me-dsRNA21。左图为共聚焦显微镜 下W -0Me-dsRNA21或W -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞中Edu阳性的细胞;右图为统计计 算W -0Me-dsRNA21或W -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞中含有Edu的细胞占总细胞的百分 比。
[0066] 图3为经2' -0Me-dsRNA21和2' -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞中CCND3和CDK4的 表达情况。其中,图A为CCND3和⑶K4的琼脂糖凝胶电泳检测结果,图B为CCND3和⑶K4 的实时荧光定量检测结果,Cyclin D3表示CCND3,dsRNA21表示W -0Me-dsRNA21,miR-NC 表示 W -〇Me-NC。
[0067] 图4为分别经W -0Me_dsRNA21和W -〇Me-NC处理的裸鼠肿瘤重量、体积及外 观。其中,图A为裸鼠的肿瘤体积,图A中的"D"表示"天","MM3"表示"立方毫米";图B为 第5次注射针剂的两天后(即实验的第10天)裸鼠的肿瘤重量;图C为第5次注射针剂的 两天后(即实验的第10天)裸鼠的肿瘤外观。dsRNA21表示V -0Me-dsRNA21,NC表示 2, -〇Me-NC。

【具体实施方式】
[0068] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[0069] 下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0070] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0071] 下述实施例中的BALB/C裸鼠为广东省实验动物中心产品。
[0072] 下述实施例中的鼻咽癌细胞均为鼻咽癌细胞系(CNE细胞系),CNE细胞系为昆明 细胞库产品,保藏编号为KCB 86019YJ。
[0073] 实施例 1、2' -0Me_dsRNA21 的制备
[0074] dsRNA21的一条链的从5'端至3'端的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1,所述 dsRNA21的另一条链的从3'端至5'端的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 2。其中,SEQ ID No. 1由21个核糖核苷酸组成,SEQ ID No. 2由21个核糖核苷酸组成,SEQ ID No. 1的 第1-19位核糖核苷酸与SEQ ID No. 2的第3-21位核糖核苷酸反向互补,将二者形成的双 链RNA命名为dsRNA21。本发明选择随机双链RNA作为阴性对照,该随机双链RNA的名称为 NC,NC的一条链的从5'端至3'端的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 3,NC的一条链的从 3'端至5'端的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 4。将dsRNA21的SEQ ID No. 2所示链中 所有胞苷酸的2' -OH均取代为甲氧基且SEQ ID No. 1所示链未进行修饰得到的dsRNA21 的修饰物命名为2' -0Me-dsRNA21。将NC的SEQ ID No. 4所示链中所有胞苷酸的2' -OH 均取代为甲氧基且SEQ ID No. 3所示链未进行修饰得到的NC的修饰物命名为W -OMe-NC。
[0075] 2 ^ -0Me_dsRNA21 和 Y -〇Me-NC 委托上海吉玛(GenePharma)制药技术有限 公司合成(ffincott F, DiRenzo A, Shaffer C, GrimmS, Tracz D, Workman C, Sweedler D, Gonzalez C,Scaringe S and Usman N.Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 1995, 23:2677-84) 〇
[0076] 实施例2』-0Me_dsRNA21对肿瘤细胞增殖的影响
[0077] 实验重复三次,每次实验的方法如下:
[0078] 将实施例1得到的2 ' -0Me-dsRNA21粉末溶解于无 RNA酶的无菌水中,使其 终浓度为 20pmol/L,得到 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液。分别取 5 μ L 该 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液和5μ L的lipofectamine 2000(Invitrogen),将其分别稀释于245μ L的无血清 培养基(Opti-ΜΕΜ)中,分别得到V -0Me-dsRNA21无血清培养液和lipofectamine 2000无血清培养液,将lipofectamine 2000无血清培养液在室温下孵育5分钟,然后 将2 ' -0Me-dsRNA21无血清培养液与lipofectamine 2000无血清培养液混合,得到 2 ^ -0Me-dsRNA21-脂质体复合物培养液500 μ L,并将该W -0Me-dsRNA21-脂质体复合物 培养液于室温静置20分钟。
[0079] 用含10%胎牛血清的DMEM液体培养基(10% FBS-DMEM液体培养基,GIBC0产品) 培养鼻咽癌细胞(CNE,昆明细胞库,保藏编号为KCB 86019YJ),收集处于对数生长期的鼻 咽癌细胞培养液,用上述含10%胎牛血清的DMEM液体培养基调整处于对数生长期的鼻咽 癌细胞培养液中细胞浓度,使细胞终浓度为30000个/mL,得到稀释鼻咽癌细胞培养液,向6 孔板中分别加入100 μ L该稀释鼻咽癌细胞培养液,使每孔中细胞含量为3000个,并用上述 含10%胎牛血清的DMEM液体培养基将每孔中培养液的体积补至2mL,得到含有鼻咽癌细胞 液的6孔板。将该含有鼻咽癌细胞液的6孔板置于含5% C02的37°C的孵箱中培养12小 时,使细胞贴壁。
[0080] 分别向上述细胞贴壁后的6孔板的每孔中加入500μ L上述W -0Me-dsRNA21-脂 质体复合物培养液及1500 μ L无血清DMEM培养基(Opti-MEM)进行转染,得到 2' -0Me-dsRNA21细胞培养液。将2' -0Me-dsRNA21细胞培养液置于含5%0)2的37°〇的 孵箱中培养6小时后,将培养基更换为10% FBS-DMEM液体培养基,正常条件下继续培养,在 培养过程中每3天按照上述方法转染一次,培养10天后,得到经W -0Me-dsRNA21处理的 鼻咽癌细胞。
[0081] 按照上述方法,2' -0Me_dsRNA21替换为Y -〇Me-NC,其余步骤不变,得到经 2' -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞。
[0082] 将经2' -0Me_dsRNA21处理的鼻咽癌细胞和经2' -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞分 别用冷甲醇固定,并分别用结晶紫染色,而后用Gel-Pro计数器分别对经2' -0Me-dsRNA21 处理的鼻咽癌细胞克隆数和经2 ' -OMe-NC处理的鼻咽癌细胞克隆数进行计数,计算鼻 咽癌细胞增殖抑制率(鼻咽癌细胞增殖抑制率=C -OMe-NC处理的鼻咽癌细胞克隆 数-2' -0Me-dsRNA21处理的鼻咽癌细胞克隆数)/2^ -OMe-NC处理的鼻咽癌细胞克隆 数),结果如图1所示。
[0083] 结果显示,鼻咽癌细胞在经V -0Me-dsRNA21处理48h时,2,-0Me-dsRNA21抑 制了27.7%的鼻咽癌细胞增殖;在经2 /-0116-(181?隱21处理7211时,2/-016-(181?隱21抑 制了33.7%的鼻咽癌细胞增殖 ;在经2^-016-(181?隱21处理9611时,2/-016-(181?隱21 抑制了 30. 7%的鼻咽癌细胞增殖;在经Y -0Me-dsRNA21处理10天时,鼻咽癌细胞 的克隆数为147个±14个,经Y -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞的克隆数为320个±13 个,2 ' -0Me-dsRNA21抑制了 54. 1 %的鼻咽癌细胞增殖。表明和经2 ' -〇Me-NC处理 的鼻咽癌细胞相比,经2' -0Me-dsRNA21处理的鼻咽癌细胞的克隆数明显减少,说明 2' -0Me-dsRNA21能显著抑制鼻咽癌细胞的增殖。
[0084] 实施例3、2' -0Me_dsRNA21对细胞周期的影响
[0085] 实验重复三次,每次实验的方法如下:
[0086] 用含10%胎牛血清的DMEM液体培养基(10% FBS-DMEM液体培养基,GIBC0产品) 培养鼻咽癌细胞培养18小时,得到DMEM细胞培养液。将DMEM细胞培养液在4°C 5000转/ 分钟下离心,得到鼻咽癌细胞。用不加青霉素和链霉素的含10%胎牛血清的DMEM液体培养 基重悬鼻咽癌细胞,用移液枪吹打均匀,得到鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液。用不加青霉素 和链霉素的含10%胎牛血清的DMEM液体培养基调整鼻咽癌细胞培养液中细胞浓度,得到 细胞浓度为2,000,000个细胞/mL的鼻咽癌细胞细胞液,将该细胞液分种于6孔板中,每孔 100 μ L,即每孔中含200,000个鼻咽癌细胞,得到含有鼻咽癌细胞液的6孔板。
[0087] 分别取 lipofectamine 2000 (Invitrogen) 5 μ L、实施例 2 中的 2' -〇Me_dsRNA21 溶液10 μ L,分别稀释于250 μ L无血清培养基(Opti-MEM)中,分别得到2' -0Me-dsRNA21 无血清培养液和lipofectamine 2000无血清培养液,将lipofectamine 2000无血清培养 液在室温下孵育5分钟,然后将2' -0Me-dsRNA21无血清培养液与lipofectamine 2000无 血清培养液混合,得到2' -0Me-dsRNA21-脂质体复合物培养液。将2' -0Me-dsRNA21-脂 质体复合物培养液于室温静置20分钟。将上述W -0Me-dsRNA21-脂质体复合物培养液 与无血清的DMEM培养液按照体积比为1:3的比例混合后取2mL,加到上述鼻咽癌细胞液 的6孔板中,得到V -0Me-dsRNA21细胞培养液。将V -0Me-dsRNA21细胞培养液在细 胞培养板上在5% C0237°C的培养箱中培养6小时,得到2' -0Me-dsRNA21转染细胞液,将 2' -0Me-dsRNA21转染细胞液在4°C 5000转/分钟下离心,得到W -0Me-dsRNA21转染后 的细胞,将2' -0Me-dsRNA21转染后的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬鼻咽癌 细胞,用移液枪吹打均匀,得到W -0Me-dsRNA21转染的细胞培养液,将W -0Me-dsRNA21 转染的细胞培养液于含5% C02的37°C的孵箱中继续培养48小时,得到W -0Me-dsRNA21 鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液。
[0088] 按照上述方法,将W -0Me_dsRNA21替换为W -〇Me-NC,其他操作步骤不变,得到 2 ^ -〇Me-NC鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液。
[0089] 48小时后,分别用羟基脲同步处理V -0Me-dsRNA21鼻咽癌细胞FBS-DMEM培 养液中的鼻咽癌细胞和2' -OMe-NC鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液中的鼻咽癌细胞,使鼻 咽癌细胞处于G1期,其他操作均按照Click-iT EdU Alexa Fluor 488荧光试剂盒(Life Technologies,C10337)说明书进行。
[0090] 激光共聚焦显微镜下观察2' -0Me-dSRNA21鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液中的鼻 咽癌细胞和2' -OMe-NC鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液中的鼻咽癌细胞,并用成像软件定量 计算,结果如图2所示。
[0091] 结果显示,经V -0Me_dsRNA21处理的S期鼻咽癌细胞中含有Edu细胞的百分 比为21.94±3. 08%,经2' -〇Me-NC处理的S期鼻咽癌细胞中含有Edu细胞的百分比为 37. 5±4. 49%,表明与转染2' -〇Me-NC的鼻咽癌细胞相比,转染2' -0Me-dsRNA21的鼻咽 癌细胞S期含有Edu的细胞显著减少。
[0092] 实施例4、2< -0Me_dsRNA21对靶基因表达的抑制作用
[0093] 取实施例3中的V -0Me_dsRNA21鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液和W -〇Me-NC 鼻咽癌细胞FBS-DMEM培养液,培养42小时后,分别收集2' -0Me-dsRNA21转染的鼻咽癌细 胞和W -〇Me-NC转染的鼻咽癌细胞,分别进行周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)基因和细胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3)基因的表达检测。
[0094] 实验重复三次,每次重复实验的步骤如下:
[0095] 按照TRIzol提取RNA的方法提取2' -0Me-dsRNA21转染的鼻咽癌细胞的总RNA, 得到含有 DNA 的 2' -0Me-dsRNA21 总 RNA。用 DNase I(RNase-free) (TaKaRa)于 37°C 下消化 处理含有DNA的W -0Me-dsRNA21总RNA 30分钟,降解含有DNA的W -0Me-dsRNA21总RNA 中的DNA,得到DNA降解后的含有DNA的2' -0Me-dsRNA21总RNA。按照DNase I产品说明重 新提取DNA降解后的含有DNA的W -0Me-dsRNA21总RNA中的RNA,得到W -0Me-dsRNA21 总 RNA。将 1 μ g 的 2,-0Me-dsRNA21 总 RNA 与 0· 5 μ g 的 50 μ M Oligo dT (16-18) (Takara 公司产品)混合,加热5分钟,迅速冷却至0°C得到。按TaKaRa公司的M-MLV逆转录酶体系 分别加入缓冲液,并于42°C孵育1小时,得到W -0Me-dsRNA21 cDNA。
[0096] 按照上述方法,将W -0Me_dsRNA21转染的鼻咽癌细胞替换为W -〇Me-NC转染 的鼻咽癌细胞,其他步骤不变,得到W -〇Me-NC cDNA。
[0097] 以2 ' -0Me-dsRNA21cDNA为PCR反应的模板对靶基因 CCND3 (CCND3的引物 为:CCND3F:TACCCGCCATCCATGATCG,CCND3R:AGGCAGTCCACTTCAGTGC)和 CDK4(CDK4 的 引物为:⑶K4F :CCTACCTTTATATTTGGGGTCCT,CDK4R :GGCCCTGTAATTTAACCAGT)进行半定 量 PCR 检测,内参为 GAPDH(GAPDH 的引物为:GAPDHF :GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT,GAPDHR : GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG),PCR反应完成后,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图3 中A所示。结果表明,经W -0Me-dsRNA21和经W -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞中的⑶K4 基因和CCND3基因均有表达,经W -0Me-dsRNA21处理后的鼻咽癌细胞中的⑶K4基因和 CCND3基因的表达均有所降低。与转染小核酸的阴性对照组比较,转染W -0Me-dsRNA21 明显抑制肿瘤细胞的CCND3和⑶K4的表达。
[0098] 分别以上述 W -0Me-dsRNA21cDNA 和上述 W -〇Me_NC cDNA 为模板,以 GAPDH 为 内参(GAPDH 的引物为:GAPDHF :GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT,GAPDHR :
[0099] GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG),按照 Syb 试剂盒使用说明进行 CDK4 基因和 CCND3 基因表达的实时荧光定量检测,CDK4基因的引物为:CDK4F:CCTACCTTTATATTTGGGGTCCT, CDK4R :GGCCCTGTAAITTAACCAGT,CCND3 基因的引物对为:CCND3F :
[0100] TACCCGCCATCCATGATCG,CCND3R :AGGCAGTCCACTTCAGTGC,结果如图 3 中 B 所示。结果 显示,经2' -0Me-dsRNA21处理的鼻咽癌细胞中⑶K4基因的表达量为经2' -〇Me-NC处理 的鼻咽癌细胞中⑶K4基因的表达量的74. 3%,经W -0Me-dsRNA21处理的鼻咽癌细胞中 CCND3基因的表达量为经W -〇Me-NC处理的鼻咽癌细胞中CCND3基因的表达量的60. 8 %, 表明经W -0Me-dsRNA21处理后的鼻咽癌细胞中的⑶K4基因和CCND3基因的表达量均有 所降低。
[0101] 实施例5、2' -0Me-dsRNA21冻干粉针剂的制备
[0102] 1、配液
[0103] 将实施例1中的2 ' -0Me-dsRNA21用无 RNA酶的注射用水溶解,得到无 RNA酶 的 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液,该无 RNA 酶的 2 ' -0Me-dsRNA21 溶液中 2 ' -0Me-dsRNA21 的 含量为2. 29 μ g/ μ L ;将冻干保护剂甘露醇4. 4g用无 RNA酶的注射用水溶解,并用氢氧化 钠溶液和盐酸溶液调节其pH为6-7,补加注射用水至100mL,得到冻干保护剂溶液;按照 lmL无 RNA酶的2 ' -0Me-dsRNA21溶液与50mL冻干保护剂溶液的体积比进行混合,得到 2 ^ -0Me-dsRNA21保护剂混合液。
[0104] 2、冻干
[0105] 预冻:将上述2' -0Me-dsRNA21保护剂混合液分装好于西林瓶中,于-80°C冰箱中 预冷冻过夜。冷冻干燥:将预冷冻的2' -0Me-dsRNA21保护剂混合液抽真空,然后在避光 条件下冷冻干燥,得到W -0Me-dsRNA21冻干粉针剂。
[0106] 按照上述方法,将W -0Me_dsRNA21替换为实施例1中的W -〇Me-NC,其他均不 变,得到W -〇Me-NC冻干粉针剂。
[0107] 将W -0Me_dsRNA21冻干粉针剂与W -〇Me-NC冻干粉针剂密封,低温保存。
[0108] 实施例6、2< -0Me_dsRNA21对肿瘤生长的抑制作用
[0109] 取4周龄的雄性BALB/C裸鼠10只,分别在每只裸鼠的背侧翼部皮下注射0. lmL 鼻咽癌细胞悬液(鼻咽癌细胞悬液中鼻咽癌细胞含量为3 X 105个细胞/mL),10天后成瘤, 共得到10只背侧翼部皮下形成移植瘤的BALB/C裸鼠。将上述10只背侧翼部皮下形成移 植瘤的BALB/C裸鼠随机分为两组,每组5只,分别为NC组裸鼠和dsRNA21组裸鼠。
[0110] 用无 RNA酶的无菌水11. 3μ L溶解20μ g实施例5中的2' -0Me-dsRNA21冻干 粉针剂,并加入转染试剂jetPEI (Polyplus公司产品)L 2 μ L,得到V -0Me-dsRNA21和 jetPEI的混合溶液,向2' -0Me-dsRNA21和jetPEI的混合溶液中加入是该溶液等体积的 10%葡萄糖溶液,混合均匀,得到总体积为25μ 1的2' -0Me-dsRNA21针剂。按照上述方 法,将实施例5中的2' -0Me-dsRNA21冻干粉针剂替换为实施例5中的2' -OMe-NC冻干 粉针剂,其他均不变,得到总体积为25 μ 1的W -〇Me-NC针剂。
[0111] 向NC组裸鼠中每只裸鼠的移植瘤内注射上述2' -OMe-NC针剂25μ 1,注射 当天记为实验的第0天,每只裸鼠每隔1天注射一次上述含有20yg2' -OMe-NC的 2' -OMe-NC针剂25 μ 1,共注射5次;向dsRNA21组裸鼠中每只裸鼠的移植瘤内注射上述 2' -0Me-dsRNA21针剂25μ 1,注射当天记为实验的第0天,每只裸鼠每隔1天注射一次上 述含有20 μ g2' -0Me-dsRNA21的W -0Me-dsRNA21针剂25 μ 1,共注射5次。每次注射针 剂前(即实验的第0天、第2天、第4天、第6天、第8天)和第5次注射针剂的两天后(即 实验的第10天)用游标卡尺测量分别测量NC组裸鼠和dsRNA21组裸鼠的肿瘤最长径(L) 和横径(S),并计算肿瘤的近似体积。计算公式为:V(mm3) =0.5XLXS2。在每组的裸鼠第 5次注射针剂的两天后(即实验的第10天),取出每组中每只裸鼠的肿瘤,并测量肿瘤体 积、称量肿瘤重量、拍照记录,结果如图4所示。
[0112] 实验结果显示,NC组裸鼠肿瘤的平均重量为0. 043g±0. 015g,dsRNA21组裸鼠 肿瘤的平均重量为〇. 〇23g±0. 0084g。注射针剂两天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为 30. 74mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为20. 53mm3 ;注射针剂四天时,NC组裸鼠肿瘤的 平均体积为37. 74mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为30. 41mm3 ;注射针剂六天时,NC组 裸鼠肿瘤的平均体积为65. 20mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为45. 27mm3 ;注射针剂八 天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为75. 21mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积为51. 94mm3 ; 注射针剂十天时,NC组裸鼠肿瘤的平均体积为93. 97mm3, dsRNA21组裸鼠肿瘤的平均体积 为73. 05mm3。结果表明,与NC组裸鼠相比,dsRNA21组裸鼠肿瘤重量、肿瘤体积的增加明显 小,2' -0Me-dsRNA21针剂明显抑制了裸鼠肿瘤的生长。
【权利要求】
1. 双链RNA或其修饰物在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用,所述双链RNA 的一条链序列为序列表中SEQ ID No. 1,所述双链RNA的另一条链序列为序列表中SEQ ID No. 2。
2. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述双链RNA的修饰物是经过下述A1)或 A2)或A3)修饰得到的双链RNA修饰物: A1)对所述双链RNA的核糖的2' -0H进行修饰; A2)对所述双链RNA的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰; A3)对所述双链RNA的核糖的5'端连上胆固醇的修饰。
3. 与权利要求1或2中所述双链RNA相关的生物材料在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑 制剂中的应用,所述生物材料为下述Bl)-B12)中的任一种: B1)编码权利要求1或2中所述双链RNA的DNA分子; B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒; B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体; B4)含有B2)所述表达盒的重组载体; B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物; B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物; B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物; B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物; B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系; B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系; B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系; B12)含有M)所述重组载体的转基因动物细胞系; B13)含有B1)所述DNA分子的转基因植物细胞系。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述肿瘤抑制剂为抑制肿瘤发 生的抑制剂和/或抑制肿瘤生长的抑制剂。
5. 根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述肿瘤细胞抑制剂为抑制肿 瘤细胞增殖的产品和/或促进肿瘤细胞凋亡的产品。
6. 下述Ml)或M2)的用途: Ml)权利要求1或2中所述的双链RNA或所述双链RNA的修饰物在制备抑制肿瘤细胞 周期蛋白D表达试剂中的应用; M2)权利要求1或2中所述的双链RNA或所述双链RNA的修饰物在制备抑制肿瘤细胞 周期蛋白依赖性激酶4表达试剂中的应用。
7. 下述M3)或M4)的用途: M3)权利要求3中所述的生物材料在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白D表达试剂中的应 用; M4)权利要求3中所述的生物材料在制备抑制肿瘤细胞周期蛋白依赖性激酶4表达试 剂中的应用。
8. 治疗和/或预防肿瘤的产品,其活性成分为权利要求1或2中所述的双链RNA或所 述双链RNA的修饰物。
9. 治疗和/或预防肿瘤的产品,其活性成分为权利要求3中所述的生物材料。
10. 根据权利要求8或9所述的产品,其特征在于:所述治疗和/或预防肿瘤的产品为 治疗和/或预防肿瘤的药物,所述药物的剂型为粉针剂。
【文档编号】A61K39/00GK104147616SQ201410383877
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】王纠, 张雅鸥, 吴江斌, 何杰, 许乃寒, 谢伟东 申请人:清华大学深圳研究生院
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