病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法

病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种新型有效的病毒性心肌炎环肽疫苗，所述环肽疫苗是由B3型柯萨奇病毒VP1环肽任选辅以药用赋形剂和/或佐剂组成。所述VP1环肽是通过蛋白质内含子反式剪接将B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1环化获得。与传统多肽疫苗相比，本发明的环肽疫苗不仅具备传统多肽疫苗的优点，如具有很强的免疫原性，免疫动物可诱导产生高效价的抗体，且重组表达的环肽疫苗不合有感染性组分，无致病性，应用前景广阔。同时环肽疫苗克服了线状多肽疫苗易降解的缺点，可以在体内复杂环境下，抵御各种酶的降解，提高其生物活性，延长半衰期，提高蛋白的代谢稳定性和生物利用度，增强多肽疫苗的免疫应答，是一种安全、有效的预防和/或治疗CVB3型病毒性心肌炎的多肽疫苗。
【专利说明】病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及环肽疫苗及其制备方法，具体地说，涉及一种病毒性心肌炎环肽疫苗 及其制备方法。

【背景技术】
[0002] 根据肽键的结构可将多肽分为直链肽和环肽。其中直链肽的研究最为广泛和深 入，虽然许多直链肽在体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后因体内环境复 杂，存在各种各样的酶，导致直链肽在酶的作用下很快降解，活性丧失；另外，直链肽在液相 里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求，这些不利因素造成多肽疫苗仍有许多问 题有待解决。而环肽因其具有明确的固定构象，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在 游离的氨基端和羧基端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，因此其生物活性半衰期 长，受体选择性高，使得环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。
[0003] 病毒性心肌炎是指病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变， 属于感染性心肌疾病。柯萨奇病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒（CVB3)感染所致，青 壮年发病较高，是一种常见、多发的心血管系统疾病，目前尚无有效的预防或治疗疫苗。
[0004] 多肽疫苗具有抗病毒、抗肿瘤、抗细菌、抗寄生虫感染功能。由于多肽疫苗价廉、安 全、特异性强、容易保存和应用的优点，越来越受到重视。但也因其免疫原性差、功效低以及 在体内易降解和不可复制性等不足影响了免疫效果。
[0005] CVB3为球形二十面体对称无包膜病毒，其核衣壳由4种多肽VP1、VP2、VP3和VP4 共60个结构蛋白组成，其中VP1为CVB3的主要结构蛋白。研究表明VP1中含有多个可能 的B细胞表位和T细胞表位，具有较强的免疫原性，是其主要的中和抗原，可诱导机体产生 保护性免疫应答，因此VP1是相对最好的预防或治疗CVB3型病毒性心肌炎的疫苗候选靶抗 原。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种新型有效的病毒性心肌炎环肽疫苗。
[0007] 本发明的另一目的是提供制备病毒性心肌炎环肽疫苗的方法。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的B3型柯萨奇病毒VP1环肽，其是通过蛋白质内含 子反式剪接将B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1环化，即得VP1环肽。
[0009] 本发明还提供上述VP1环肽的制备方法，将B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1基因与 蛋白内含子基因融合表达，以大肠杆菌为宿主，通过蛋白质内含子反式剪接将线状VP1蛋 白环化获得VP1环肽。
[0010] 本发明中涉及的蛋白内含子包括但不限于Rma DnaB intein等任一可将VP1成功 环化的蛋白内含子。
[0011] 具体地，前述制备方法包括以下步骤：
[0012] 1)将Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列Ic及下游外显子第一个氨基酸 残基Ser的编码基因序列（Ic+Ser)与VP1编码基因的5'端融合，将Rma DnaB intein第 1-105位氨基酸的编码基因序列IN与VP1编码基因的3'端融合；
[0013] 2)将融合蛋白的编码基因在大肠杆菌体内诱导表达，通过Rma DnaB intein的Ic 和IN的反式剪接将VP1蛋白的N末端和C末端通过肽键连接形成VP1环肽；
[0014] 3)VP1环肽以包涵体形式存在于大肠杆菌内，裂解细胞后通过变性法以His-tag 标签纯化得到VP1环肽。
[0015] 前述的制备方法，在37°C下诱导表达融合蛋白可使VP1的环化效率达到100%。
[0016] 通过蛋白质内含子反式剪接制备环状VP1蛋白的示意图见图7。
[0017] 本发明还提供病毒性心肌炎环肽疫苗，其是将所述B3型柯萨奇病毒VP1环肽任选 辅以药用赋形剂和/或佐剂组成。所述环肽疫苗可以为液体剂型或冻干剂型。
[0018] 本发明还提供上述环肽疫苗的制备方法，其是将所述B3型柯萨奇病毒VP1环肽任 选与药用赋形剂和/或佐剂混合。
[0019] 本发明还提供一种融合蛋白Ic-VPl-IN，其中，VP1为B3型柯萨奇病毒结构蛋白， Ic为Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列及下游外显子第一个氨基酸残基Ser，IN 为Rma DnaB intein第1-105位氨基酸序列。
[0020] 本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体中含有编码上述融合蛋白 Ic-VP1_IN 的基因。
[0021] 本发明还提供含有编码上述融合蛋白Ic-VPl-IN的基因的宿主细胞、转基因细胞 系及工程菌。
[0022] 本发明还提供上述环肽疫苗在预防和/或治疗病毒性心肌炎中应用。可以将环肽 疫苗通过肌肉注射及其他在体内有效的免疫方式实施免疫。例如，在一个【具体实施方式】中， 采用腿部肌肉注射方式，在小鼠体内实施免疫后，VP1环状蛋白有效诱导CVB3特异性体液 和细胞免疫应答，这些特异性全身免疫应答比VP1线性蛋白疫苗显著性强。且由该疫苗诱 导的特异性全身免疫应答可保护小鼠免受CVB3的攻击，不发生病毒性心肌炎，从而具备防 治病毒性心肌炎的作用。
[0023] 本发明的环肽疫苗与传统多肽疫苗相比，不仅具备传统多肽疫苗的优点，如具有 很强的免疫原性，免疫动物可诱导产生高效价的抗体，且重组表达的环肽疫苗不合有感染 性组分，无致病性，是一种应用前景广阔的预防性疫苗。同时环肽疫苗克服了线状多肽疫苗 易降解的缺点，可以在体内复杂环境下，抵御各种酶的降解，提高其生物活性，延长半衰期， 提高蛋白的代谢稳定性和生物利用度，增强多肽疫苗的免疫应答，是一种安全、有效的具有 强保护力的预防和/或治疗CVB3型病毒性心肌炎的多肽疫苗。

【专利附图】

【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中Rma DnaB intein环化载体示意图。
[0025] 图2为本发明实施例1中VP1环肽的表达、纯化及Western Blot鉴定结果；其中， Μ为蛋白Mark，1为未诱导的对照，2为IPTG终浓度ImM，37°C诱导4h ;3为IPTG终浓度ImM， 25°C诱导过夜；4为纯化的VP1环肽，5为Western Blot检测，P代表前体蛋白，即RB intein 和VP1的融合蛋白（RBc-VPl-RBn)，S代表RB intein剪接后的产物，即VP1环肽（C-VP1)。
[0026] 图3为本发明实施例2中C-VP1免疫诱导小鼠产生的CVB3特异性血清IgG水平。
[0027] 图4为本发明实施例2中C-VP1免疫诱导小鼠产生的CVB3特异性脾脏淋巴T细 胞CTL杀伤能力。
[0028] 图5为本发明实施例2中C-VP1免疫诱导小鼠产生的CVB3特异性脾脏Τ细胞增 殖能力。
[0029] 图6为本发明实施例3中C-VP1免疫小鼠产生的免疫保护作用；末次免疫后2周， 以3倍LD 5(I剂量的CVB3腹腔感染小鼠，感染第7天体重下降水平（Α);小鼠第7天心脏病 理改变情况（B);感染第7天免疫小鼠的心功能情况（C)。
[0030] 图7为通过蛋白质内含子反式剪接制备环状VP1蛋白的示意图。

【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning :a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0032] 实施例1病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法
[0033] 本实施例主要是通过将蛋白质内含子的剪接结构域与VP1蛋白融合表达，以大肠 杆菌为宿主，加入IPTG诱导融合蛋白表达，蛋白质内含子在体内自发发生反式剪接将VP1 蛋白的N末端和C末端以肽键连接形成VP1环肽。VP1环肽以包涵体的形式存在于大肠杆 菌体内，经过纯化、复性等过程后获得纯的VP1环肽，即为病毒性心肌炎环肽疫苗。
[0034] 1.实施例中使用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：
[0035] 质粒、病毒、动物和细胞株：嗜心性CVB3 Nancy株，Hela细胞、基因工程S0型断裂 蛋白内含子Rma DnaB，即Rma DnaB intein由苏州大学生物医学研究院熊思东教授提供。 雄性BALB/c(H-2d)小鼠，6周龄，体重18-20克，购自上海斯莱克实验动物中心。宿主细菌 DH5 a、BL21 购自 Invitrogen 公司。
[0036] 免疫学试剂及材料：VP1237_249由上海吉尔生化有限公司合成；戊巴比妥钠 (Sigma公司）；Brdu细胞增殖检测试剂盒（Roche) ;LB培养基、Gibco血清（美国Life Technology公司）；基因合成委托上海Invitrogen公司；HRP标记羊抗小鼠 IgG多克隆抗 体（SouthernBiotech公司）；限制性核酸内切酶Bsal和BfuAI (NEB公司），HindllI和 BamHI (Takara 公司）；T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶（Takara 公司）。
[0037] 2.实施过程如下：
[0038] 2. lpGEX-5X-l_VPl 重组质粒的构建
[0039] 按照RNAex Reagent&System Kit (上海华舜生物技术有限公司）试剂盒说明书 操作，提取B3型柯萨奇病毒Nancy株总RNA，逆转录得到cDNA，逆转录反应按照2-N First Strand cDNA Synthesis Kit (上海生工生物工程股份有限公司）进行。设计VP1上、下游 引物（上游引物 Y -CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTGGAAGACGCG-3 ^，下游引物 Y -CGGGA TCCTTACTAAAATGCGCCCGTATTTGTC-3')，分别含有 HindllI 和 BamHI 酶切位点，通过 PCR 扩 增获得VP1基因片段。纯化回收VP1 DNA片段（小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，Axygen 公司），经双酶切后连入经同样双酶切的载体PGEX-5X-1。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感 受态细胞，筛选单阳性克隆。通过质粒小量抽提试剂盒（Axygen公司）抽提质粒，经酶切及 测序鉴定成功构建PGEX-5X-1-VP1重组质粒。
[0040] 2. 2pERB-VPl重组质粒的构建
[0041] 基因工程S0型断裂蛋白内含子Rma DnaB，将其剪接结构域的C端（包含下游外 显子的第一个氨基酸Ser)和N端融合构建到pET-28a载体上得到环化载体pERB，C端和N 端中间含有Bsal和BfuAI酶切位点（图1)。
[0042] 以重组质粒pGEX-5X-l-VPl为模板，通过PCR扩增得到含有Bsal和BfuAI酶切位 点的VP1 DNA序列，并通过引物在VP1的C端引入His-tag纯化标签（上游引物：5' -ggtc tcgctGGCCCCGTGGAAGACGCGATAAC-3'，下游引物：5' -acctgcagaccgccGTGGTGGTGGTGGTGGT GATTTGTCATTGTAGTGATGCTTTGC-3')。用 Bsal 和 BfuAI 分别双酶切 PCR 产物和载体 pERB 序 列，T4连接酶连接上述产物，连接物转化大肠杆菌DH5a，氨苄青霉素筛选，小抽阳性克隆 并送测序鉴定，正确的克隆即为PERB-VP1重组质粒。
[0043] 2. 3融合蛋白的表达及VP1环状蛋白的纯化
[0044] 鉴定正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取单克隆接种到含氨苄抗 性的LB液体培养基中，37°C培养过夜，按1 : 100的体积比将培养物接种于含氨苄抗性的 新鲜LB培养基中，37°C振荡培养至0D6(l(lnm约为0. 8时加入终浓度为ImM的IPTG，37°C诱导 表达6h，或25°C诱导过夜。SDS-PAGE分析不同温度诱导下VP1蛋白的环化效率，结果如图 2所示，37°C下诱导表达融合蛋白可以使VP1的环化效率达到100%。离心收集37°C下诱 导表达融合蛋白的菌体，超生破碎后得到包涵体蛋白沉淀，在变性条件下通过His-tag标 签纯化得到VP1环肽，复性后用BCA法测定纯化蛋白的浓度，并通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定（图2)。
[0045] 纯化得到VP1环肽即为病毒性心肌炎环肽疫苗（C-VP1)。
[0046] 实施例2病毒性心肌炎环肽疫苗诱导的CVB3特异性体液和细胞免疫应答
[0047] 实施例2和3通过肌肉注射的方式用实施例1中制备的VP1环肽疫苗免疫小鼠， 检测该疫苗诱导的特异性全身免疫应答水平以及保护小鼠免受CVB3的攻击的能力，并与 线性VP1蛋白相比较。
[0048] 1、VP1蛋白免疫方法及血清收集
[0049] 以C-VP1环肽疫苗免疫6周龄BALB/c小鼠。方法如下：将6-8周BALB/c雄性小鼠 分为C-VP1组，L-VP1组和PBS组3组，每组6只小鼠。VP1蛋白免疫组每只免疫25 μ g的 蛋白，分别于第1、3、5周免疫，共免疫3次，第1次混合等体积的完全弗氏佐剂，第2、3次混 合等体积的不完全弗氏佐剂。免疫方法是将混合好的蛋白疫苗缓慢注射到小鼠腿部肌肉。
[0050] 于0周、2周、4周、6周分别收集小鼠血清，方法是以毛细管经小鼠眼眶后眦静脉采 血，37°C静置30min，5000rpm离心lOmin，吸取上清分装冻存于-70°C。
[0051] 2、VP1环肽疫苗免疫诱生CVB3特异性血清IgG的ELISA检测
[0052] 以 10μ g/ml CVB4 VP1237_24913肽包板（pH9. 6 Na2C03,0. 1%BSA)，4°C过夜，PBST洗 3遍；以1%85八^^5封闭，371：111，洗3遍；加入10(^11:40稀释血清原液，371：211，洗 3遍；加入ΙΟΟμΙ HRP-羊抗小鼠 IgG，37°Clh，洗4遍；加入ΙΟΟμΙ TMB底物，室温避光显 色7min，最后加入50 μ 12N H2S04终止反应，测0D49(lnm值。
[0053] 结果如图3所示，与L-VP1免疫组相比，C-VP1诱生了较高水平的特异性血清IgG 的产生，其0D值达到约1. 5,接近L-VP1组的三倍。
[0054] 3、VP1环肽疫苗免疫诱生CVB3特异性CTL的应答
[0055] 处死末次免疫后2周小鼠，无菌取脾脏，脾细胞在体外经特异性抗原刺激培养3 天后作为效应细胞；以灭活的CVB3刺激培养24h的SP2/0细胞作为靶细胞。靶细胞按 100 μ 1/1 X 104/孔加入96孔U底板，将效应细胞浓度调至5 X 106/ml，以该浓度为起始浓 度（即效靶比50 : 1)在板外进行倍比稀释，依次为2.5X106/ml(25 : 1)、L 25X 106/ ml (12. 5 : 1)，各按100 μ 1/孔加入96孔板中，LDH释放对照组的设计（每组均设3个复 孔）：（1)培养液对照组：单纯无血清1640培养液200 μ 1/孔；（2) LDH低释放组：靶细胞 100 μ 1/孔+无血清1640培养液100 μ 1/孔；(3) LDH高释放组：祀细胞100 μ 1/孔+细胞 裂解液（2%TritonX-100溶液）100μ 1/孔；（4)效应细胞对照组：分别为效应细胞5Χ105/ 孔，2. 5Χ 105/孔，1. 25Χ 105/孔+培养液100 μ 1/孔。将已加入细胞的96孔板置于37°C， 体积分数5% C02培养箱中培养72h。培养结束后将培养板以250g速度离心lOmin。每孔 取100 μ 1细胞培养上清液，加入96孔平底细胞培养板中，于每孔中加入100 μ 1 LDH反应 液（Roche)，室温避光放置30min。将细胞板置于酶标仪中检测492nm的吸光度（Α)值。
[0056] 特异性CTL活性的计算方法：CTL细胞毒相对活性=[(A效靶细胞混合-A效应细 胞对照-A低释放对照）ΛΑ高释放对照-A) ] X 100 %
[0057] 结果如图4所示，从图4可以看出，效靶比为25 : 1时，C-VP1免疫组特异性杀伤 率达38 %，而L-VP1组的特异性杀伤率只有20 %，统计显示有显著差异，提示C-VP1环肽疫 苗诱生了较强的CVB3特异性细胞免疫应答。
[0058] 4、Brdu检测特异性淋巴细胞增殖反应
[0059] 处死末次免疫后2周小鼠，无菌取脾脏，制备无红细胞的淋巴细胞悬液，调整浓度 为 4X 106/ml，加入 96 孔板，100 μ 1/ 孔，以 1640、20 μ g/ml VP1237_249 为刺激物，培养 72h 加 入 Ο.?μ? Brdu labeling solution/孔，至 24h 收集细胞，FixDenat 固定细胞后，加入 Ιμ? anti-Brdu-POD，PBS 洗涤后，ΤΜΒ 室温显色 10min，测 0D45(lnm 值。
[0060] 结果如图5所示，与L-VP1免疫组相比，C-VP1免疫组脾脏淋巴细胞对VP1237_ 24913 短肽产生的特异性细胞增殖反应具有显著差异，提示C-VP1免疫能够产生很强烈的CVB3特 异性脾脏淋巴细胞增殖反应。
[0061] 实施例3病毒性心肌炎环肽疫苗在防治病毒性心肌炎中的应用
[0062] 1、CVB3病毒传代
[0063] 用含10% NBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPMI-1640培 养基，在37°C、5%C02条件下培养Hela细胞，隔天传代。以100μ1 CVB3病毒冻存液感染 约5 X 106Hela细胞，培养40hr后80 %细胞被复制病毒裂解，将液体及细胞碎片以3000rpm/ min离心20min，所得上清即新鲜CVB3悬液，于-70°C保存。
[0064] 2、CVB3病毒的LD5(I (半数致死量）滴定
[0065] 取出生48h的BALB/c乳鼠，分为8组，每组6只小鼠，将新鲜制备的CVB3悬液以 10倍梯度稀释法依次稀释为10'10'10'10'10'10'10'10'分别取1〇〇 μ 1经腹腔 注射8组乳鼠，逐日观察乳鼠存活情况，按病毒学常规方法计算该批次CVB3病毒的LD5(I效 价。
[0066] 距离比例=(大于50 %的死亡百分数-50V (大于50 %的死亡百分数-小于50 % 的死亡百分数）
[0067] LD5(I =大于50 %的死亡率稀释度的对数（Log) +距离比例
[0068] 本试验中同一批次内CVB3的LD5Q效价为ΚΓ5 5"^1。
[0069] 3、CVB3感染后免疫小鼠体重和心肌损伤血清学指标变化情况
[0070] 环状VP1蛋白末次免疫后2周，以3倍LD5(I剂量的活CVB3病毒100 μ 1经腹腔感 染小鼠，逐日观察小鼠存活情况至攻击后28天。通过小鼠体重变化，心脏组织病理切片，小 鼠存活率以及心脏超声等手段观察各组小鼠发病情况。通过称取第〇天和第7天体重改变， 初步评估心肌炎严重程度。结果显示，感染初期，各组小鼠体重基本相同，但至第7天，PBS 组小鼠体重下降最为显著，其次为L-VP1组而C-VP1组体重变化最小（图6Α)。
[0071] 观察小鼠在28天内的存活率，结果显示，PBS组小鼠在7天内全部死亡，L-VP1组 有50 %小鼠实现长期存活，而C-VP1免疫组小鼠存活率高达70 %，上述结果表明C-VP1可 有效保护小鼠免受病毒攻击，起到有效的免疫保护效果。
[0072] 心肌细胞HE染色显示，C-VP1免疫组小鼠的心肌细胞无明显病变及炎性细胞浸 润，类似于正常小鼠心肌，而L-VP1组心肌细胞呈现较为严重的灶性坏死，并伴随有炎性细 胞浸润，表明C-VP1诱导的CVB3特异性免疫应答可较好的清除CVB3,使心肌不受感染或感 染程度较轻（图6B)。
[0073] 小鼠心功能检测：CVB3攻击后第7天进行小鼠心脏收缩功能监测，每只小鼠腹腔 注射150 μ 10. 75 %戊巴比妥钠，待轻度麻醉后采用RMV707B型高频超声探头对小鼠进行超 声心动图检查。心功能的各种收缩和舒张指标如：左室舒张末期容积（LVEDV)、左室射血分 数（LVEF% )、左室短轴缩短率均由软件自动计算得出，所有数据及计算值均根据ASE推荐 方法获得，每组原始数据取连续3个心动周期的平均值，超声检查的操作及分析均由专业 人员完成。
[0074] 实验结果分析（图6C)，C-pVPl免疫组小鼠的LVEF以及LVFS的数值明显高于 L-VP1免疫组，这表明免疫C-VP1疫苗的小鼠有效的抵抗了 CVB3病毒的攻击，从而可有效预 防CVB3诱导的病毒性心肌炎。
[0075] 以上实施例表明，以VP1环肽为靶抗原肌肉注射免疫小鼠，可有效增强B3型柯萨 奇病毒特异性血清抗体应答，明显加强全身特异性CD4/CD8 T细胞杀伤能力，显著提高免疫 小鼠抵御病毒感染的能力，具备作为新型蛋白疫苗的应用价值和潜力。
[0076] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0077] 序列表 <110> 申请人:名称；苏州大学 <120〉病毒性心肌炎环肽疫苗及其制备方法 <160> 4 <170〉Patentln version 3, 3 <210> 1 <211> 36 <212〉 DNA <213>人工序列 <400> 1 cccaagcttg ccaccatggg cccagtggaa gacgcg 36 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <2i3>人工序列 <400> 2 cgggatcctt actaaaatgc gcccgtattt gtc 33 <210〉 3 <211> 32 <212> DNA <2i3>人工序列 <!00> 3 ggtctcgctg gccccgtgga agacgcgata ac 32 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213〉人工序列 C100> 4 acctgcagac cgccgtggtg gtggtggtgg tgatttgtca ttgtagtgat gctttgc 57
【权利要求】
1. B3型柯萨奇病毒VP1环肽，其特征在于，其是通过蛋白质内含子反式剪接将B3型柯 萨奇病毒结构蛋白VP1环化，即得VP1环肽。
2. 权利要求1所述VP1环肽的制备方法，其特征在于，将B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1 基因与蛋白内含子基因融合表达，以大肠杆菌为宿主，通过蛋白质内含子反式剪接将线状 VP1蛋白环化获得VP1环肽。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白内含子包括但不限于Rma DnaB intein〇
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列Ic及下游外显子第一个氨基酸残基 361*的编码基因序列与￥?1编码基因的5'端融合，将1^^〇1^8丨拉6丨11第1-105位氨基酸 的编码基因序列1 1<与％1编码基因的3'端融合； 2) 将融合蛋白的编码基因在大肠杆菌体内诱导表达，通过Rma DnaB intein的Ic和IN 的反式剪接将VP1蛋白的N末端和C末端通过肽键连接形成VP1环肽； 3. VP1环肽以包涵体形式存在于大肠杆菌内，裂解细胞后通过变性法以His-tag标签 纯化得到VP1环肽。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在37°C下诱导表达融合蛋白。
6. 病毒性心肌炎环肽疫苗，其特征在于，所述环肽疫苗是由权利要求1所述VP1环肽任 选辅以药用赋形剂和/或佐剂组成。
7. 根据权利要求6所述的环肽疫苗，其特征在于，所述环肽疫苗为液体剂型或冻干剂 型。
8. 权利要求6所述环肽疫苗的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述VP1环肽任选 与药用赋形剂和/或佐剂混合。
9. 融合蛋白Ic-VPl-IN，其特征在于，VP1为B3型柯萨奇病毒结构蛋白，Ic为Rma DnaB intein第388-428位氨基酸序列及下游外显子第一个氨基酸残基Ser，INS Rma DnaB intein第1-105位氨基酸序列。
10. -种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有编码权利要求9所述融 合蛋白的基因。
【文档编号】A61K39/125GK104151402SQ201410384017
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】熊思东, 齐兴梅 申请人:苏州大学