一种防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法
【专利摘要】一种防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法，属于动物用中药领域。本发明的目的是提供一种现代中兽药新制剂，用于预防和治疗猪、鸡、牛、羊、马、犬、兔大肠杆菌病的防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法。本发明组方为：地锦草、黄连、白头翁。本发明以中兽医药学理论为指导，主要是针对家禽、家畜的大肠杆菌病因而组方，以减少或替代抗生素和其它化学抗菌药，解决大肠杆菌耐药性日趋严重与肉、蛋、奶等动物产品中药物残留超标影响食品安全等问题，更加安全、有效且质量可控的中药制剂用于动物大肠杆菌病的防治，对于促进动物养殖业发展，防控人畜共患病和维护食品安全均具有重大的现实意义。
【专利说明】一种防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物用中药领域。
【背景技术】
[0002] 致病性大肠杆菌可引起多种动物和人感染发病，如猪的黄痢、白痢、水肿病，鸡的 急性败血症、气囊炎、心包炎和肝周炎，牛、羊、马、犬、兔急性胃肠炎等，发病率和致死率均 较高，给动物养殖业和人类健康带来严重威胁。当前对动物大肠杆菌病的防治还存在许多 亟待解决的重大问题：一是致病性大肠杆菌血清型众多，迄今还没有研制出理想的菌苗来 用于防控；二是动物饲养场综合防治措施不够完善，饲养管理水平还不够高，为大肠杆菌病 的发生和传播提供了外部条件；三是由于抗生素和化学抗菌药物的大量使用，大肠杆菌产 生了广泛的耐药性，使治疗效果不断下降，临床又不得不加大剂量并延长给药时间，大幅度 提高了治疗难度与成本；四是抗生素和化学药物在动物体内及其产品中形成有害药物残留 而危害食品安全。在现有文献资料中不乏采用中药防治动物大肠杆菌病的报道，但大多源 于经验之谈，没有经过系统的药学研究去确认其药效与毒理，没有从现代药理学和传染病 学角度去证明其安全性和有效性，且药物剂型在现代集约化饲养场不便使用。
[0003] 中国专利201310406071. 7 (-种猪用止泻中药及制备方法)，其方剂是由柴胡、白 头翁、地锦草、黄连、甘草构成，1、柴胡为解表药，能"发表和里，升举阳气，舒肝解郁（《中国 兽药典》)，主治感冒发热与寒热往来"，《伤寒论》的小柴胡汤（以柴胡为君药）是用来治疗半 表半里证的；而猪的腹泻属于里证，用不好可能加重病情。
[0004] 2、柴胡品种较多，临床容易混杂使用。例如药典就有柴胡及 DC.和狭叶柴胡 Wi 1 Id.两个种，大叶柴胡及腫 Turcz.是有毒的（《中国兽药典》）。日本人就因为用小柴胡汤不对症而引发 了严重的毒性事件。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种现代中兽药新制剂，用于预防和治疗猪、鸡、牛、羊、马、 犬、兔大肠杆菌病的防治动物大肠杆菌病的中药及制备方法。
[0006] 本发明制成有效成分的重量份为：地锦草40-80、黄连20-40、白头翁20-40。
[0007] 本发明的制备方法是：将地锦草、白头翁和黄连3味，加10倍量50%乙醇浸润 30min后，回流提取3次，每次90min，滤过，收集醇提液，回收乙醇，继续浓缩至稠膏状， 50?60°C干燥，制成细粉，加辅料，充分混匀，用70%乙醇制粒，60?80°C烘干，整粒，制成 1000g，即得；其中辅料为：糊精：乳糖：蔗糖=1:1:1。
[0008] 本发明以中兽医药学理论为指导，主要是针对家禽、家畜的大肠杆菌病因而组方， 以减少或替代抗生素和其它化学抗菌药，解决大肠杆菌耐药性日趋严重与肉、蛋、奶等动物 产品中药物残留超标影响食品安全等问题，更加安全、有效且质量可控的中药制剂用于动 物大肠杆菌病的防治，对于促进动物养殖业发展，防控人畜共患病和维护食品安全均具有 重大的现实意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是本发明制备工艺流程图； 图2是本发明抑菌试验效果图。
【具体实施方式】
[0010] 本发明制成有效成分的重量份为：地锦草40-80、黄连20-40、白头翁20-40。 [0011] 本发明的制备方法是：将地锦草、白头翁和黄连3味，加10倍量50%乙醇浸润 30min后，回流提取3次，每次90min，滤过，收集醇提液，回收乙醇，继续浓缩至稠膏状， 50?60°C干燥，制成细粉，加辅料，充分混匀，用70%乙醇制粒，60?80°C烘干，整粒，制成 1000g，即得；其中辅料为：糊精：乳糖：蔗糖=1:1:1。
[0012] 实施例1 : 本发明制成有效成分的重量份为：地锦草40、黄连20、白头翁20; 制备方法同上。
[0013] 实施例2: 本发明制成有效成分的重量份为：地锦草60、黄连30、白头翁30; 制备方法同上。
[0014] 实施例3 : 本发明制成有效成分的重量份为：地锦草80、黄连40、白头翁40 ; 制备方法同上。
[0015] 提取配方中药有效成分加工制成口服液、颗粒剂或胶囊剂，含量规格：lg成品相 当于生药1.2g。
[0016] 用途：预防和治疗猪、鸡、牛、羊、马、犬、兔大肠杆囷病。
[0017] 给药途径：内服(混饲、混饮、灌服)。
[0018] 地锦草：为大戟科植物地锦Aawi/iAsa Willd.或斑地 L.的干燥全草，味辛性平，归肝与大肠经；具有清热解毒，凉血止血功效，主治动 物下痢，肠炎，便血，尿血，咳血，跌扑损伤，痈肿恶疮和鱼烂鳃等病证，为君药。
[0019] 白头翁：为毛茛科植物白头翁(Bge. ) Regel的干燥根， 味苦性寒，归胃、大肠经，具有清热解毒，凉血止痢功效。主治动物热毒血痢，湿热肠炎，为臣 药。辅助君药地锦草清热解毒，凉血止血作用；二药相须为用，能增强全方对动物大肠杆菌 病的防治功效，为臣药。
[0020] 黄连：为毛茛科植物黄连Franch.、三角叶黄连 ofe/ioiofea C. Y. Cheng et Hsiao或云连teeta Wall.的干燥根莖，味苦性寒，归 心、脾、胃、肝、胆、大肠经；具有清热燥湿，泻火解毒功效，主治动物湿热泻痢，心火亢盛，胃 火炽盛，肝胆湿热，目赤肿痛，火毒疮痈以及鱼赤皮，白头白嘴，出血等病证；为佐使药。辅佐 君臣药发挥作用，使方剂整体突显清热燥湿，泻火解毒功效；同时黄连归经较广，可引导药 物多靶点发挥整体防治作用，为佐药。
[0021] 以下通过实验对本发明进一步证明：（以下将本发明的方剂定名为地翁颗粒） 以打孔法证明本产品对动物致病性大肠杆菌具有显著地的抑菌作用： 将动物致病性大肠杆菌标准菌株(购自中国兽医药品检查所）接种于肉汤培养基37°C 培养24 h，按比浊计数法计数，配制成菌浓度为109个/ml的菌液。无菌条件下，用移液枪 吸取供试菌液ιοομ?滴入肉汤琼脂平板培养基表面，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表 面，用灭菌的打孔器(直径为6mm)在每个平板培养基上打上等距3孔，将药液滴满孔，每种 药做3个样，作好标记，静置30 min后平稳转入37°C培养16h，取出测量抑菌直径，取平均 值。
[0022] 结果表明地翁颗粒对动物致病性大肠杆菌具有显著地的抑菌作用。
[0023] 中药药理学研究证明本品能促进动物细胞免疫功能 采用3H法进行刀豆蛋白A (ConA)、脂多糖（LPS)诱导脾脏淋巴细胞增殖实验，ELISA 方法检测ConA或金黄色葡萄球菌Cown株灭活菌体（SAC)刺激的脾淋巴细胞上清液IL-2、 IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的含量。结果显示，在安全浓度范围内，地翁颗粒能 够明显促进T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖；能够促进ConA刺激的淋巴细胞分泌INF- γ ;能 够促进SAC刺激的淋巴细胞分泌IL-12、INF- γ和IL-6,并抑制IL-10的分泌。结果表明， 地翁颗粒能够有效调节小鼠脾淋巴细胞的功能，促进细胞免疫。
[0024] 安全药理学评价 急性毒性试验结果表明：内服地翁颗粒，剂量为5000 mg/kg生药的高剂量组，小鼠均 健康成活。表明地翁颗粒的毒性较低，为实际无毒。以最大给药量和最高浓度的地翁颗粒 灌胃小鼠，小鼠均健康成活，无一死亡病例，经剖检观察主要脏器发育正常，无明显病变。测 定地翁颗粒的最大耐受量约为10000 mg/kg生药，证明本品经小鼠口服给药属于无毒性药 品，可以作为一种安全可靠的药物使用。
[0025] 长期毒性试验结果表明：给大鼠连续灌服地翁颗粒28天，外观体征、行为活动、大 便性状、体重均未见任何不良影响。各剂量组的血液生理生化学指标和脏器指数在给药期 间与空白对照组比较，均无显著性差异；停药14天后，给药组的各项指标与空白对照组相 t匕，均无显著性差异（P > 0.05)。通过组织病理学剖检，大鼠主要脏器均发育正常，未见异 常病变。结果表明，不同剂量的地翁颗粒对大鼠连续使用28天后，未见有明显的药物所致 毒性反应及相关组织病理学改变。停药14天，亦未见药物引起的延迟性毒性反应。上述研 究结果表明，地翁颗粒长期使用具有较高安全性。
[0026] 靶动物安全性试验证明本品安全无毒副作用 将地翁颗粒以每lkg体重0. 2g、0. 6g、1. 0g，相当于1倍、3倍和5倍于推荐剂量给猪灌 月艮，连续用药7天，给药后详细观察受试猪的一般临床表现、采食量与体重变化、血液学及 血清生化指标、剖检与病理组织学变化。结果显示1倍、3倍和5倍于临床推荐剂量的地翁 颗粒未引起试验猪死亡和其它毒性反应。试验猪精神状态、饮食欲及粪便无异常，生长发育 良好，红细胞数、血红蛋白含量、白细胞总数和分类计数以及各项血清生化指标均在正常范 围。组织切片观察，各脏器组织结构形态未发现有任何异常病变。以上结果表明，地翁颗粒 对猪具有较高的临床用药安全性。
[0027] 实验临床试验证明其能有效治疗猪大肠杆菌病(仔猪白痢） 参照预备临床试验结果，将猪源致病性大肠杆菌08株以2. 5 X 101° cfu/头的攻菌剂量 给21日龄离乳仔猪灌服加腹腔注射，并模拟低温、潮湿和多重应激条件，使受试猪感染发 病，待出现典型、稳定的临床症状并符合仔猪白痢疾病模型标准后用于临床试验。将中药制 剂地翁颗粒以0. 4g/kg、0. 2g/kg、0. lg/kg的剂量给患病仔猪灌服，每日1次，连服5d。选 择白龙散为对照药物，同时设阴性和空白对照组，在预定时期内观测地翁颗粒对人工感染 仔猪白痢的治疗效果、疗程和对患病猪生长发育情况的影响。结果证明：在多重应激存在的 前提下，灌服加腹腔注射猪源致病性大肠杆菌08株成功造成了仔猪白痢疾病模型，感染仔 猪出现了较典型且稳定的临床症状，发病率100%。服用地翁颗粒高、中剂量（0.4 g/kg及 0. 2g/kg)组的仔猪临床症状得到较快改善并治愈，精神活泼，饮食欲增进迅速，排便逐渐恢 复正常，体增重得到较快恢复；高、中剂量组疗效优于低剂量组和对照药物组，而且疗程较 短，以其治疗的仔猪较快恢复了正常生长发育。由此得出结论：以每lkg体重0.2g和0.4g 剂量的地翁颗粒内服，可有效治疗人工感染致病性大肠杆菌08株引发的仔猪白痢，其治愈 率均为91. 67%，有效率均为100%。用地翁颗粒（0. 4 g/kg及0. 2g/kg)内服治疗人工感染 所致仔猪白痢，平均疗程为2. 75和2. 92天，病猪精神、饮食欲、粪便性状和体增重得到较快 恢复。地翁颗粒高、中剂量（0. 4 g/kg及0. 2g/kg)间没有显著差异，建议以0. 2g/kg体重 为临床用药推荐剂量。高剂量〇. 4g/kg体重的地翁颗粒内服也没有发现明显的毒、副作用， 表明该剂量地翁颗粒对猪临床用药也是安全的。
[0028] 扩大临床试验证明其能有效治疗自然发生的猪大肠杆菌病(仔猪白痢） 以流行病学调查、临床检查、病理剖检和实验室检查确定诊断，随机分组后分别灌服地 翁颗粒和白龙散进行治疗。通过观察排便次数、粪便形态、精神、食欲等临床症状和实验室 指标变化，以及给药前和给药结束5天后体重等，综合判定地翁颗粒治疗仔猪白痢的有效 性及安全性。结果表明：以〇. 2g/kg体重的剂量灌服地翁颗粒对仔猪白痢确有较好疗效。月艮 用地翁颗粒的仔猪临床症状得到较快改善并治愈，精神渐显活泼，聚堆渐少，活动增多，口 鼻润泽，饮食欲增进迅速，排便逐渐恢复正常，皮毛渐显亮泽，体增重得到较快恢复；与对照 药物组相比，地翁颗粒治疗组症状恢复较快，疗程较短，仔猪较快恢复了正常生长发育。由 此得出结论：地翁颗粒以〇. 2g/kg体重内服，连续给药5天，可有效治疗由猪致病性大肠杆 菌引起的仔猪白痢，治愈率92. 86%，有效率96. 43%，平均疗程为3. 02天，症状得道较快减轻 或消失，治愈仔猪生长发育得到较快恢复。治疗期间未发现地翁颗粒明显的毒性或其他不 良反应，证明以0. 2g/kg体重内服是安全的。
[0029] 中药地翁颗粒对小鼠脾淋巴细胞功能的影响。
[0030] 受试药物的溶解将地翁颗粒用适量1640培养液溶解，2500rpm离心lOmin，取上 清液经0· 22 μ m滤膜过滤后，稀释为中药浓度40(^g/ml、4(^g/ml、4Pg/ml 3个浓度。
[0031] 脾细胞悬液的制备无菌取出小鼠脾脏，用毛玻璃片将小鼠脾脏磨碎，制成脾细胞 悬液。裂解红细胞后，用PBS洗涤三次，计数(活细胞在95%以上)。用含10%FBS的RPMI 1640培养液将脾细胞浓度调为4X 106细胞/ml。
[0032] 淋巴细胞毒性实验（MTT法）于96孔培养板中每孔加入ΙΟΟμΙ的细胞悬液，5〇μ1 的中药样品（阴性对照组加5〇μ1的培养液)，总体积15〇μ1。每实验组设3个孔。置5%C0 2 培养箱内37°C温育48h，培养终止前4h加5 mg/ml ΜΤΤ (2〇μ1/孔)，终止培养后，离心，弃 去上清，每孔加 DMS0 15〇μ1，摇床震荡lOmin，用酶标仪于570nm处测定每孔0D值。结果表 明，地翁颗粒对小鼠淋巴细胞无毒(见表1)。
[0033] 表1地翁颗粒对淋巴细胞的毒性实验
【权利要求】
1. 一种防治动物大肠杆菌病的中药，其特征在于：制成有效成分的重量份为：地锦草 40-80、黄连 20-40、白头翁 20-40。
2. 权利要求书1所述的防治动物大肠杆菌病的中药的制备方法，其特征在于：将地锦 草、白头翁和黄连3味，加10倍量50%乙醇浸润30min后，回流提取3次，每次90min，滤 过，收集醇提液，回收乙醇，继续浓缩至稠膏状，50?60°C干燥，制成细粉，加辅料，充分混 匀，用70%乙醇制粒，60?80°C烘干，整粒，制成1000g，即得；其中辅料为：糊精：乳糖：蔗糖 =1:1:1。
【文档编号】A61K36/718GK104147165SQ201410395588
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】韦旭斌, 付本懂, 伊鹏霏, 夏方 申请人:韦旭斌