一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，属于天然药物化学与化妆品的开发和应用领域。以漆树木质为原料、经过提取、萃取、大孔树脂纯化和干燥得到漆树多酚提取物。本发明制备的漆树多酚提取物含量高、抑制作用明显，漆树多酚含量>50%，对酪氨酸酶活性的抑制率>60%，其原料天然、无毒，因此利用漆树多酚开发天然酪氨酸酶抑制剂，用于美白化妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病，具有很好的商业前景。
【专利说明】一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，属于天然 药物、化妆品【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 漆树（Rhus verniciflua stokes)，为漆树科（Anacardiaceae)漆树属 ((Toxicodendron)的一种落叶乔木。漆树是我国重要的特用经济林，生漆是天然树脂涂 料，素有"涂料之王"的美誉。它还是一种优良的药用木材，漆树的叶、花、根、皮、果实、干漆 和木心都可入药，有止咳、消癖、通经、杀虫、消肿等功效。漆树木质部位的多酚化合物是继 生漆漆酚、漆多糖后的主要活性物，大量的研究表明其具有优良的抗氧化性、抗肿瘤、抑菌 和免疫调节等作用。
[0003] 据调研了解，我国化妆品市场以每年15%左右的速度增长，2011年已突破2000亿 大关，我国目前是全球第三大化妆品市场。根据市场研究公司Euromonitor的数据显示，在 我国的皮肤护理品市场中，美白产品占据了 71%的份额。目前市场上销售的许多美白、祛斑 产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用，从而促使了与酪氨酸酶抑制剂相关研究的蓬勃发 展。由于酪氨酸酶抑制剂在化妆品中的广泛使用，研究可以长期使用、安全、有效的药物将 成为人们要考虑的主要问题。世界各国植物资源丰富，天然资源因其药效温和、不良反应小 而被广泛认同，天然酪氨酸酶抑制剂的开发将成为化妆品领域一个备受瞩目的课题。
[0004] 酪氨酸酶（EC 1. 14. 18. 1，Tyrosinase)广泛分布于微生物、动植物以及人体中。 酪氨酸酶具有独特的双重催化功能：催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴 形成多巴醌，是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老、昆虫的伤口愈合与发育、果蔬 的褐变等有密切关系。其活性异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病（如雀斑、黄褐 斑、老年斑等）。
[0005] 我国是漆树的原产地，主要集中在陕西、四川、重庆、湖北、贵州、甘肃和云南七个 省，在镇雄、大方、毕节、赫章、北川、恩施等60多个县建立了漆树产业化种植基地，种植面 积达100万hm2,栽种漆树达150, 000万株。但是目前漆树的产业主要集中在天然生漆涂 料的生产及开发，在漆籽的利用方面也比较薄弱，另外在漆树生长、利用过程中，大量的枝 桠茎材未得到利用，为了扩大漆树产业的规模化，延伸漆树资源的产业链，因此开展漆树多 酚的提取制备和生物活性研究，对于漆树资源的开发利用具有指导意义。已知的国内外文 献对漆树多酚的的研究主要集中在抗肿瘤、抑菌和抗氧化等方法，对漆树多酚抑制酪氨酸 酶活性的研究与开发尚属空白。
【发明内容】
[0006] 为实现上述目的，发明了一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方 法，其特征在于由以下步骤组成： (1)提取 将漆树木材干燥、粉碎，去渣，按质量体积比为l:5~l:30(g:mL)，加入质量分数为 5(Γ95%的乙醇水溶液，常温或加热回流提取、或减压回流提取、或超声波辅助提取或微波辅 助提取2~3次，每次lOmirTlOh，过滤，滤液合并，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，再经真空 干燥或冷冻干燥，得到粗提物； (2) 萃取 粗提物按质量比1:5~1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取:Γ5次，分 离，在4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取:Γ5次， 分离，在4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯相； (3) 大孔树脂纯化 将乙酸乙酯相按质量比1:5~1:10 (g:mL)加入质量分数为10%的乙醇水溶液，超声震荡 溶解，加入大孔吸附树脂，先用质量分数为ΚΓ20%的乙醇水溶液进行洗脱，洗至无色，这部 分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用质量分数为3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，洗 脱剂用量为3-6倍住体积，收集洗脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多 酚提取物； (4) 提取物多酚含量和化学成分分析 将漆树多酚提取物进行化学成分分析，总多酚含量为5(Γ60%，经HPLC分析，漆树多酚 提取物的主要化学成分为漆黄素含量为〇. 4~0. 7%，黄颜木素含量为5~10%，硫黄菊素含量 为0. 5~1%和紫铆花素含量为0. 2、. 5%，漆酚的含量<5PPm; (5) 提取物抑制酪氨酸酶活性 将漆树多酚提取物进行抑制酪氨酸酶活性研究，当浓度范围在40(T600ug/mL，抑制率 为6(Γ80%，其IC50值为308 μ g/mL。通过对抑制酪氨酸酶活性的机理研究，其抑制类型为 混合型。
[0007] (6)本专利采用常温或加热回流提取、或减压回流提取、或超声波辅助提取或微 波辅助提取进行提取，其中加热回流提取的温度为5(T90°C，减压回流提取的真空度为 0. 04?0. IMPa，温度4(T70°C，超声辅助提取的功率为12(T600W，温度为3(T60°C，微波辅助 提取的功率为50(T800W，温度4(T70°C。按质量体积比为1:51:30 (g:mL)，加入质量分数 为5(Γ95%的乙醇水溶液，提取2?3次，每次lOmirTlOh，过滤，滤液合并，于4(T60°C下减压 蒸发除去溶剂，再经真空干燥或冷冻干燥，得到粗提物。
[0008] (7)本专利采用大孔树脂进行漆树多酚的纯化，将乙酸乙酯相按质量比 1: 5?1:10 (g:mL)加入质量分数为10%的乙醇水溶液，超声震荡溶解，加入大孔吸附树脂，乙 酸乙酯相与大孔吸附树脂的质量体积分数为1:2(Γ50,先用质量分数为ΚΓ20%的乙醇水溶 液进行洗脱，洗至无色，这部分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用质量分数为3(Γ60% 的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱剂用量为3-6倍住体积，收集洗脱液，于4(T60°C下减压蒸发 除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。其中大孔树脂选自LK001、122、聚酰胺、DM21、DM101、 AB-8、M1180N和D285中的一种或几种。
[0009] (8)本专利采用HPLC分析漆树多酚提取物中的主要化学成分，其色谱条件为：色 谱柱为1^ _18 611(1〇3口口6(1柱（4.6\25〇111111，5 4 111)，流动相为体积比为 35:65 的甲醇-〇.5% 醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280和360nm，流速为lmL/min。
[0010] (9)本专利所得到的漆树多酚提取物对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，能够用于 美白化妆品、预防和治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。
[0011] 本发明的有益效果： 本发明所提供的一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，还具有以 下特点： 本发明采用负压、超声和微波等提取方法，可以有效地防止多酚提取物的分解，大大地 提1?提取得率； 本发明采用逐步萃取方法，可以有效地除去漆酚化合物，具有低敏性特点； 本发明采用大孔树脂纯化，可以有效地提高漆树多酚的含量(总多酚>50%); 本发明工艺操作简单，易实施，产品色浅，纯度高； 漆树多酚提取物对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，能够用于美白化妆品、预防和治疗 由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】 图1为漆树多酚提取物的HPLC色谱图； 图2漆树多酚提取物对酪氨酸酶的抑制作用； 图3漆树多酚提取物对酪氨酸酶催化L-酪氨酸形成多巴色素的抑制作用的紫外-可 见光谱图； 图4漆树多酚提取物对酪氨酸酶催化单酚底物的抑制作用； 图5漆树多酚提取物对酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的Lineweaver-Burk曲线； 图6漆树多酚提取物与酪氨酸酶和二价铜的紫外-可见光谱图。
【具体实施方式】
[0013] 以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
[0014] 实施例1漆树多酚的分析方法 精确称取没食子酸标准品20mg，加入蒸馈水溶解并定容到200mL，得到0. lmg/mL的标 准品标准溶液。分别移取〇、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8和lmL的0. lmg/mL的标准溶液至10mL的容 量瓶中，分别加入lmLFC试剂（0. 2mol/L)和2mL的15% Na2C03溶液，用蒸馏水定容至刻度， 25°C反应2h。在760nm处测吸光度。绘制吸光度与浓度的标准曲线，并拟合线性回归方程。 回归方程y=〇. 〇6895x+0. 0465,相关系数R=0. 99985。没食子酸在2-10ug/mL浓度区间具有 良好的线性关系。
[0015] 实施例2HPLC分析 色谱柱以十八烧基化学键合固定相为填充剂，即RP_18 endcapped (250mmX4.6mm， 5 μ m);紫外检测波长为280和360nm，室温；流动相为体积比为65:35的甲醇-0. 5%醋酸水 溶液，流速为lmL/min，各标准品之间的分离度要求大于1. 5。分别称取黄颜木素、漆黄素、 紫铆花素和硫黄菊素标准品，精确至〇. OOOOlg，分别加入甲醇配成〇. 5mg/mL的溶液，再稀 释成50 μ g/mL的标准溶液。各标准溶液吸取20 μ L，16 μ L，12 μ L，8 μ L和4 μ L，进样，计 算峰面积，分别建立黄颜木素、漆黄素、紫铆花素和硫黄菊素峰面积与样品量（μ g)关系， 确定回归方程，绘制相应的标准曲线。漆黄素的回归方程y=5E+06x+25177，相关系数R= 0. 9999,在0. 25-10 μ g有良好的线性范围。黄颜木素的回归方程y =3E+06x-76260,相关系 数R = 0.9999，在0.25-10μg有良好的线性范围。紫铆花素的回归方程y=5E+06x+33948， 相关系数R = 0. 9999,在0. 25-10yg有良好的线性范围。硫黄菊素的回归方程y =6E+06x +39412,相关系数R = 0.9996，在0.25-10 μ g有良好的线性范围。图1为漆树多酚提取 物的HPLC分析图谱，280nm下主要峰为12min，为黄颜木素，360nm下主要峰为32min，36min 和38min，主要为漆黄素、硫黄菊素和紫铆花素。
[0016] 实施例3 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入95%的乙醇溶液，常温下浸提10h，提 取3次，过滤，滤液合并，在60°C下减压旋转蒸发除去溶剂，水相经过冷冻干燥得到粗提物 25g，测得多酚含量为35%，抑制率为30%。再将漆树多酚粗提物按质量比1:5 (g:mL)加入 蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取3次，分离，在40°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃 取物；水层继续用乙酸乙酯萃取5次，分离，在40°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙 酯萃取相。将乙酸乙酯相按质量比1:5~1:10 (g:mL)加入质量分数为10%的乙醇水溶液，超 声震荡溶解，加入聚酰胺大孔吸附树脂，先用质量分数为ΚΓ20%的乙醇水溶液进行洗脱， 洗至无色，这部分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用质量分数为3(Γ60%的乙醇水溶 液进行洗脱，洗脱剂用量为3-6倍住体积，收集洗脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干 燥，即得漆树多酚提取物。测得多酚含量为60%，抑制率为80%。漆黄素含量为0. 7%，黄颜木 素含量为7%，硫黄菊素含量为0. 8%和紫铆花素含量为0. 5%，漆酚的含量<5PPm。
[0017] 实施例4 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入60%的乙醇溶液，采用加热回流浸提 3h，提取温度5(T90°C，提取2次，过滤，滤液合并，在60°C下减压旋转蒸发除去溶剂，水相经 过冷冻干燥得到粗提物29g，测得多酚含量为37%，抑制率为32%。再将漆树多酚粗提物按 质量比1:8 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取4次，分离，在40°C下减压蒸发 除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取3次，分离，在60°C下减压蒸发除 去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取相。将乙酸乙酯相按质量比l:5~l:10(g:mL)加入质量分数 为10%的乙醇水溶液，超声震荡溶解，加入AB-8大孔吸附树脂，先用质量分数为ΚΓ20%的 乙醇水溶液进行洗脱，洗至无色，这部分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用质量分数 为3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱剂用量为3-6倍住体积，收集洗脱液，于4(T60°C下 减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。测得多酚含量为58%，抑制率为76%。漆黄 素含量为〇. 4%，黄颜木素含量为6%，硫黄菊素含量为0. 6%和紫铆花素含量为0. 3%，漆酚的 含量<5PPm。
[0018] 实施例5 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用超声波辅助提 取l(T30min，超声功率为12(T600W，温度为3(T60°C，提取3次，过滤，滤液合并，在40°C下 减压旋转蒸发除去溶剂，水相经过冷冻干燥得到粗提物28g，测得多酚含量为40%，抑制率 为40%。再将漆树多酚粗提物按质量比1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃 取5次，分离，在40°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取4 次，分离，在60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取相。将乙酸乙酯相按质量比 1: 5?1:10 (g:mL)加入质量分数为10%的乙醇水溶液，超声震荡溶解，加入LK001大孔吸附树 月旨，先用质量分数为ΚΓ20%的乙醇水溶液进行洗脱，洗至无色，这部分收集液不用，以除去 极性大的杂质，再用质量分数为3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱剂用量为3-6倍住体 积，收集洗脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。测得多酚含 量为50%，抑制率为60%。漆黄素含量为0. 4%，黄颜木素含量为5%，硫黄菊素含量为0. 5%和 紫铆花素含量为〇. 2%，漆酚的含量<5PPm。
[0019] 实施例6 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入70%的乙醇溶液，采用微波辅助提 取2(T30min，超声功率为50(T800W，温度4(T70°C，提取3次，过滤，滤液合并，在50°C下减 压旋转蒸发除去溶剂，水相经过冷冻干燥得到粗提物26g，测得多酚含量为38%，抑制率为 40%。再将漆树多酚粗提物按质量比1:7 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取 4次，分离，在50°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取4 次，分离，在60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取相。将乙酸乙酯相按质量比 1:5?1:10 (g:mL)加入质量分数为10%的乙醇水溶液，超声震荡溶解，加入122大孔吸附树 月旨，先用质量分数为ΚΓ20%的乙醇水溶液进行洗脱，洗至无色，这部分收集液不用，以除去 极性大的杂质，再用质量分数为3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱剂用量为3-6倍住体 积，收集洗脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。测得多酚含 量为54%，抑制率为70%。漆黄素含量为0. 5%，黄颜木素含量为8%，硫黄菊素含量为0. 6%和 紫铆花素含量为〇. 3%，漆酚的含量<5PPm。
[0020] 实施例7 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用减压回流提取 l~2h，真空度为0. 04、. IMPa，温度4(T70°C，提取3次，过滤，滤液合并，在60°C下减压旋转 蒸发除去溶剂，水相经过冷冻干燥得到粗提物30g，测得多酚含量为40%，抑制率为40%。再 将漆树多酚粗提物按质量比1:7 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取4次，分 离，在50°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取4次，分离， 在60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取相。将乙酸乙酯相再将漆树多酚粗提 物按质量比1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入DM101大孔吸附树脂，先用(Γ20%的 乙醇水溶液进行洗脱，这部分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用3(Γ60%的乙醇水溶 液进行洗脱，收集洗脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。测 得漆树多酚的含量为56%，抑制率为78%。漆黄素含量为0. 6%，黄颜木素含量为10%，硫黄菊 素含量为1%和紫铆花素含量为〇. 5%，漆酚的含量<5PPm。
[0021] 实施例8 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用减压回流提取 1?2h，真空度为0. 04、. IMPa，温度4(T70°C，提取3次，过滤，滤液合并，在60°C下减压旋 转蒸发除去溶剂，水相经过冷冻干燥得到粗提物30g，测得多酚含量为40%，抑制率为40%。 再将漆树多酚粗提物按质量比1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取5次， 分离，在40°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取4次，分 离，在60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取相。将乙酸乙酯相按质量比1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入Ml 180N大孔吸附树脂，先用(Γ20%的乙醇水溶液进行洗 脱，这部分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗 脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。测得漆树多酚的含量 为58%，抑制率为80%。漆黄素含量为0. 65%，黄颜木素含量为8%，硫黄菊素含量为0. 9%和 紫铆花素含量为0. 45%，漆酚的含量<5PPm。
[0022] 实施例9 将500g漆树木为原料，经干燥、粉碎去渣后，加入80%的乙醇溶液，采用减压回流提取 1?2h，真空度为0. 04、. IMPa，温度4(T70°C，提取3次，过滤，滤液合并，在60°C下减压旋 转蒸发除去溶剂，水相经过冷冻干燥得到粗提物30g，测得多酚含量为40%，抑制率为40%。 再将漆树多酚粗提物按质量比1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取5次， 分离，在40°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取4次，分 离，在60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取相。将乙酸乙酯相按质量比1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入D285大孔吸附树脂，先用(Γ20%的乙醇水溶液进行洗 脱，这部分收集液不用，以除去极性大的杂质，再用3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗 脱液，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥，即得漆树多酚提取物。测得漆树多酚的含量 为56%，抑制率为74%。漆黄素含量为0. 5%，黄颜木素含量为7%，硫黄菊素含量为0. 85%和 紫铆花素含量为〇. 34%，漆酚的含量<5PPm。
[0023] 实施例10漆树多酚提取物抑制酪氨酸酶活性研究 (1)蘑菇酪氨酸酶溶液精密称取5mg蘑菇酪氨酸酶，加入适量4 °C的磷酸盐缓冲液 溶解、定容，配制成浓度为0.5 mg. mL-1的蘑菇酪氨酸酶溶液，4°C保存。
[0024] (2)L_酪氨酸溶液精密称取0. 0181g L-酪氨酸，加入适量pH6. 8磷酸盐缓冲液， 超声至完全溶解、定容，配制成浓度为1 mm〇l.L-l的L-酪氨酸溶液，4 °C保存。
[0025] 将漆树多酚提取物配制成浓度为5、10、50、100、200、300、400、500和600 μ g/mL进 行测定。结果如图2所示，从图可以看出，漆树多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用对浓 度呈现依赖性，随着浓度的增大，其抑制率增加，对漆树多酚提取物的浓度与酪氨酸酶抑制 率的变化规律进行线性拟合，可以得到拟合方程为： Y = 0. 001X + 0. 192 (1) 式中：Y=漆树多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制率，％ ; x=漆树多酚提取物的质量浓度，μ g/mL。
[0026] 该拟合方程（1)的相关系数R2为0.995，说明，这组数据的线性拟合是有效的。 根据方程可以计算漆树多酚提取物的IC50为308 μ g/mL。Vc的IC50为130 μ g/mL。
[0027] 实施例11漆树多酚提取物对多巴色素形成的抑制作用 将漆树多酚提取物与L-酪氨酸、酪氨酸酶混合，在酶标仪中记录12min内250-600nm 波长范围光谱吸收的变化，如图3所示，320nm处为多巴醌，492nm处为多巴色素，从图中可 以看出，随着时间的延长，多巴色素的不断升成，含量变大，但是在漆树多酚提取物存在的 情况下，虽然多巴色素有在生成，但生成缓慢，说明漆树多酚提取物对多巴色素的形成具有 一定的抑制作用。
[0028] 酪氨酸酶催化单酚底物具有迟滞效应，主要是由于酪氨酸酶对单酚底物羟基化 时，由于酪氨酸酶的自身特点使该过程受到较大的空间位阻。为了考察漆树多酚提取物对 迟滞时间的影响，L-酪氨酸的浓度为lmmol/L，测定不同质量浓度的提取物物对酪氨酸酶 单酚酶抑制作用的进程曲线，如图4所示。当增大漆树多酚提取物在反应体系中的浓度时， 在相同反应时间内，反应体系中的产物生成量降低，当漆树多酚提取物质量浓度为500ug/ mL时，在30min内，多巴色素的吸光度增加不明显，说明漆树多酚提取物对酪氨酸酶具有一 定的抑制作用。
[0029] 实施例12漆树多酚提取物对二酚催化活性抑制的类型 在反应体系中，固定酶的浓度，通过改变底物L-多巴的浓度，测定不同浓度样品对反 应体系的影响。采用Lineweaver-Burk即双倒数作图法，以底物浓度的倒数1/[S]为X轴， 反应速度的倒数1/V为y轴作图，双倒数曲线如图5所示，其线性拟合方程如表2所示，从 图表可以看出随着提取物浓度增大，Κ π值增大而反应初速度Vn值随之下降，双倒数曲线交 于第二象限，其抑制类型表现为混合型抑制。再以各直线的斜率和截距分别对浓度进行二 次作图，由横轴截距可求出复合物[ΕΙ]和[ESI]的解离常数，计算结果分别为75. 94 和137. 29 μ g/mL。从数据可知K'L可知，[ESI]的稳定性较[ΕΙ]差，因此，在体系中漆树 多酚提取物更容易与游离酶结合，从而影响了酶对底物的催化。
[0030] 表2漆树乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的Lineweaver-Burk 方程
【权利要求】
1. 一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，其特征在于由以下步骤 组成： 第一步 将漆树木材干燥、粉碎，去渣，按质量体积比为l:5~l:30(g:mL)，加入质量分数为 5(Γ95%的乙醇水溶液，常温或加热回流提取、或减压回流提取、或超声波辅助提取或微波辅 助提取2~3次，每次lOmirTlOh，过滤，滤液合并，于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，再经真空 干燥或冷冻干燥，得到粗提物； 第二步 粗提物按质量比1:5~1:10 (g:mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取:Γ5次，分 离，在4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取:Γ5次， 分离，在4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯相； 第三步 将乙酸乙酯萃取物按质量比1:5~1:10加入质量分数为10%的乙醇水溶液，超声震荡 溶解，用大孔吸附树脂柱吸附分离，乙酸乙酯萃取物与大孔吸附树脂质量体积比（g:mL)为 1:2(Γ50 ;先用质量分数为ΚΓ20%的乙醇水溶液进行洗脱，洗至无色，除去极性大的杂质， 再用质量分数为3(Γ60%的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱剂用量为3-6倍住体积，收集洗脱液， 于4(T60°C下减压蒸发除去溶剂，真空干燥，即得漆树多酚提取物； 第四步 将漆树多酚提取物进行HPLC分析，总多酚含量为5(Γ60%，其中漆黄素含量为 0. 4、. 7%，黄颜木素含量为5~10%，硫黄菊素含量为0. 5~1%和紫铆花素含量为0. 2~0. 5%，漆 酚的含量<5PPm; 第五步 将漆树多酚提取物进行抑制酪氨酸酶活性研究，当浓度范围在40(T600ug/mL，抑制率 为6(Γ80%，其IC50值为308 μ g/mL ;通过对抑制酪氨酸酶活性的机理研究，其抑制类型为混 合型。
2. 根据权利要求所述一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，其特 征在于第一步中加热回流提取的温度为5(T90°C，减压回流提取的真空度为0. 04~0. IMPa， 温度4(T70°C，超声辅助提取的功率为12(T600W，温度为3(T60°C，微波辅助提取的功率为 50(T800W，温度 4(T70°C。
3. 根据权利要求1所述一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，其 特征在于第二步中石油醚萃取的目的为除去漆树漆酚化合物，漆酚的含量<5PPm。
4. 根据权利要求1所述一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，其 特征在于第三步中的大孔吸附树脂选自1^001、122、聚酰胺、011101、48-8、]\1118(^和0285中 的一种或几种。
5. 根据权利要求1所述一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方 法，其特征在于第四步中的HPLC分析，其色谱条件为：色谱柱为RP-18 endcapped柱 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，流动相为体积比为35:65的甲醇-0. 5%醋酸水溶液，紫外检测器，检测 波长为280和360nm,流速为lmL/min。
6. 根据权利要求1所述一种有抑制酪氨酸酶活性的漆树多酚提取物及其制备方法，其 特征在于漆树多酚提取物对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，能够用于美白化妆品、预防和 治疗由于人体黑色素过多导致的沉着性疾病。
【文档编号】A61P17/00GK104147064SQ201410402087
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】王成章, 陈虹霞, 叶建中 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所