猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，该猪伪狂犬病毒弱毒株为gI/gE/11K/28K蛋白失活的猪伪狂犬病毒变异株。本发明还提供了包含该猪伪狂犬病毒弱毒株抗原的疫苗组合物，及其制备方法和应用。经活疫苗免疫原性实验和致病性免疫原性试验证明，该猪伪狂犬活疫苗具有很好的保护力，基本没有临床症状，显示出很好的免疫保护。CCTCC NO: V 2013352013.08.26CCTCC NO：V 2013112013.05.20
【专利说明】猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、及其制备的疫苗组合物，以及制备 方法和应用，属于动物病毒学领域。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科（Herpesviridae) α亚科中的猪 疱疫病毒I型（Suid herpesvirus lstrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动 物的一种以发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003] 最近的研究报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感 染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1?2天），发病率在10%?100%之间，发病猪死亡率 在10%?100%之间（仔猪死亡率可高达100% )，感染后可引起猪只高热（40?42°C， 持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧 卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流 产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。现有技 术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废 绝等症状，感染率超过80%，发病率超过30%，死亡率在10%?20%之间。例如彭金美 等.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.中国预防兽医学报，2013， 35(1) :1-4;童武等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学 报，2013,21(3) :1-7 ;Yu et al. , Pathogenic Pseudorabies Virus,China, 2012. Emerging infectious Diseases. 2014,20(1):102-104 ;An et al. , Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs, China, Emerging infectious Diseases. 2013. 19(11)： 1749-1755)，现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
[0004] 中国专利申请CN103756977A公开了猪伪狂犬病gE和gl基因缺失病毒株 PRV-ZJ011G株（保藏号为CGMCCNo. 7957)以及使用其制备的灭活前病毒含量为106_°TCID5Q 的疫苗，以该疫苗免疫5头45日龄健康仔猪可以获得100 %保护，但由于猪伪狂犬病毒疫苗 弱毒的活疫苗能够在体内一直增殖从而产生细胞免疫和体液免疫，该专利申请未能成功提 供一种针对伪狂犬新毒株的减毒活疫苗。
[0005] Chun-Hua Wang 等公开了（Chun-Hua Wang，Jin Yuan, Hua-Yang Qin，et al，A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61_vaccinated swine population in China，Vaccine 32(2014)3379 - 3385)给 6 周龄仔猪注射 PRVTJ-gE-株活疫苗对仔猪获得100%保护，且没有发热的情况出现。但本领域技术人员所 知，猪伪狂犬活疫苗的毒力跟仔猪年龄大小相关，而且根据本领域常规经验，6周龄仔猪安 全的疫苗对于7日龄的仔猪可能会不安全。由于活疫苗会在猪群内传播，因此只对6周龄 仔猪安全的疫苗无法保证在临床使用，现有技术需要对7日龄仔猪安全并且能预防新发生 的猪伪狂犬病毒变异株的活疫苗。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种活的减毒猪伪狂犬病毒株，用于防治 变异伪狂犬病毒引起的猪狂犬病。
[0007] 本发明主要目的在于提供一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒弱 毒株为gI/gE/llK/28K蛋白失活的猪伪狂犬病毒株，优选地，所述伪狂犬病毒株为伪狂犬 变异株。
[0008] gI/gE/llK/28K蛋白失活可使用本【技术领域】的公知方式，包括其基因缺失表达上 述蛋白的功能性片段的核苷酸序列，其基因整个0RF缺失，或者其基因缺失、删除或添加一 个或多个核苷酸使其不能正常表达功能蛋白或表达的蛋白不具有其原有的功能，或功能极 弱。
[0009] 作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种缺失gI/gE/llK/28K基因的伪狂犬 病毒基因工程弱毒株。
[0010] 作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中gI/gE/llK/28K 整个0RF缺失。
[0011] 作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬变异株为gE蛋白序列为SEQ ID N0. 5或 与其序列同源性为95%以上的毒株；优选地，所述的猪伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪 狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂 犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株；更优选地， 所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失 gE、TK和gl基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后所述猪依然感染猪伪狂犬 病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
[0012] 最优选的是伪狂犬变异株包括但不限于猪伪狂犬病毒HN1201株（Pseudorabies virus, strain HN1201)(保藏号为CCTCC NO. V 201311;保藏于中国典型培养物保藏 中心；保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年5月20日），JS-2012株 (童武，张青占，郑浩等，免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传 染病学报2013, 21 (3) : 1-7);猪伪狂犬HeNl株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCN0. 6656,公开于专利申请CN102994458A ; NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株和 NVDC-PRV-SD 株（Xiuling Yu，Zhi Zhou，Dongmei Hu, et al. Pathogenic PseudorabiesVirus, China, 2012EmergingInfectious Diseases， www.cdc.gov/eid ol. 20, No. 1，January 2014。猪伪狂犬病毒 HN1202 株（Pseudorabies virus，strain HN1202)(保藏号为CCTCC NO. V 201335;保藏于中国典型培养物保藏中心； 保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26日），PRV TJ strainpRy TJ)株，公开于 ChinaChun-Hua Wang Jin Yuanl，Hua-Yang Qinl，et al, A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid andcomplete protection from lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61_vaccinated swine population in China Vaccine 32(2014)3379 - 3385 中，猪伪狂犬病毒变异株 PRV-ZJ01， 其保藏号为 CGMCCNo. 8170 公开于 CN103627678A。
[0013] 作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬病毒株为HN1201株、HN1202株、JS-2012 株、猪伪狂犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株、PRV TJ 株或 PRV-ZJ01 株。
[0014] 作为本发明的一种实施方式，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株进一步TK蛋白失活；优 选地，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中TK位置的核苷酸序列编码表达SEQ. N0. 4的氨基 酸序列。
[0015] 作为本发明的一种优选实施方式，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中TK位置的 核苷酸序列为SEQ. N0. 3的核苷酸序列。
[0016] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种缺失gI/gE/llK/28K/TK基因 的伪狂犬病毒基因工程弱毒株。
[0017] 术语"猪伪狂犬变异株"也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的 猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1?2天），发病率在10%?100%之间，发病 猪死亡率在10%?100%之间（仔猪死亡率可商达100% )，感染后可引起猪只商热（40? 42°C，持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流 产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。优选地，所 述的伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株 感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁， 食欲下降或废绝等症状的毒株，优选地所述伪狂犬变异株为gE蛋白序列为SEQ ID N0. 5或 与其序列同源性为95%以上的蛋白序列的毒株。更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重 现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gl基因中的一个及一 个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后依然感染猪伪狂犬病并具备具有使9-10日龄仔猪精神沉 郁和食欲下降的毒株。
[0018] 本发明术语"同源性"在本申请中是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计 算得到，例如，可以将目标氨基酸（或核苷酸）序列与参比氨基酸（或核苷酸）序列进行 序列比对，必要时可以引入空缺，使得两条比对的序列间相同的氨基酸（或核苷酸）数目 达到最优化，并在此基础上计算两条氨基酸（或核苷酸）序列之间相同氨基酸（或核苷 酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的 软件实现，例如，但不限于，BLAST软件（在美国国立生物技术信息中心（NCBI)的网址上 可获得：http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi，或者见，例如，Altschul S. F. et al, J. Mol. Biol. , 215 :403-410 (1990) ；Stephen F. et al, Nucleic Acids Res. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2软件（在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www. eji. ac. uk/Toolsa/clustalw2/,另见，例如，Higgins D. G. et al,Methods in Enzymology, 266:383-402(1996) ；Larkin M. A. et al, Bioinformatics(Oxford, England),23(21)： 2947-8(2007));和TCoffee软件等（在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得： http://tcoffee. vital-it. ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index. cgi,另见，例如， Poirot 0. et al,Nucleic Acids Res. ,31 (13) :3503-6(2003) ；Notredame C. et al,J.Mol. Boil.，302 (1) :205-17 (2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数， 或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范 围内。
[0019] 术语"gl蛋白"由US7编码，包含366个氨基酸，0RF位于122298-123398之间.
[0020] 术语"gE蛋"白由US8编码，包含577个氨基酸，0RF位于123502-125235之间·
[0021] 术语"11K"由US9编码，包含98个氨基酸，0RF位于125293-125589之间。
[0022] 术语"28K"由US2编码，包含256个氨基酸，0RF位于125811-126581之间。
[0023] 术语"TK"又称为"胸苷激酶"由UL23编码，包含320个氨基酸，0RF位于 59512-60474 之间。
[0024] 本发明术语"gI/gE/llK/28K" 以及 "gI/gE/llK/28K/TK 是指 gl、gE、llK 和 28K， 其中"/"在本发明中是和的意思，例如" gl/gE/11K/28K蛋白失活"是指gl、gE、11K和28K 四个蛋白均失去活性。
[0025] 除非另有说明本发明术语"PRV-gI-gE-llK-28K-TK-"，是指缺失gI、gE、llK和28K 基因。
[0026] 作为本发明的一种优选实施方式，所述一种缺失gI/gE/llK/28K基因的伪狂犬病 毒基因工程弱毒株为猪伪狂犬HN1201株的缺失gI/gE/llK/28K基因的基因工程弱毒株。
[0027] 作为本发明的一种优选实施方式，所述的猪伪狂犬病毒弱毒株包括缺失gl/ gE/llK/28K 的 HN1201 株、HN1202 株、JS-2012 株、猪伪狂犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、 NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株。
[0028] 作为本发明的一种优选实施方式，所述伪狂犬病毒弱毒株为利用基因工程缺失 gI/gE/llK/28K 基因的猪伪狂犬病毒 HN1201 株（Pseudorabies virus, strain HN1201)其 中所述的猪伪狂犬HN1201株保藏号为CCTCCN0. V 201311 ;保藏于中国典型培养物保藏中 心；保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
[0029] 本发明所用术语"减毒"是指：经基因缺失的猪伪狂犬病毒与未经修饰的亲本株相 比毒力降低。表现在猪死亡头数、发烧头数的减少和和发烧维持时间的变短。如果病毒株 的一种或多种确定疾病严重性的参数在统计学的差异显著性降低，则其"毒力更小"。
[0030] 本发明的另一个方面涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有免疫量 的所述的猪伪狂犬病毒弱毒株抗原和载体；优选地，猪伪狂犬病毒弱毒株抗原含量为 彡 106 °TCID5Q 头份。
[0031] 作为本发明的一种优选实施方式，所述猪伪狂犬病毒弱毒株抗原为活的所述猪伪 狂犬病毒弱毒株；所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂。
[0032] 作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失gl/ gE/llK/28K基因的猪伪狂犬病病毒株变异株的减毒活疫苗和载体。
[0033] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失gl/ gE/llK/28K/TK基因的猪伪狂犬病病毒株变异株的减毒活疫苗和载体。
[0034] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失gl/ gE/llK/28K基因的猪伪狂犬病病毒株变异株HN1201株、HN1202株、JS-2012株、猪伪狂犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株、PRV TJ 株或 PRV-ZJ01 株的 减毒活疫苗和载体。
[0035] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述缺失gl/ gE/llK/28K/TK基因的猪伪狂犬病病毒株变异株HN1201株、HN1202株、JS-2012株、猪伪狂 犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株、PRV TJ 株或 PRV-ZJ01 株 的减毒活疫苗和载体。
[0036] 优选地，所述猪伪狂犬病毒弱毒株抗原为活的猪伪狂犬病毒弱毒株；所述疫苗组 合物进一步包括冻干保护剂。
[0037] 作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物为缺失gI/gE/llK/28K基因的猪伪 狂犬病病毒株的减毒活疫苗。
[0038] 任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活 的减毒的猪伪狂犬病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的 活的减毒的猪伪狂犬病毒和来自另一致病病毒或微生物（见下文）的抗原性物质的组合疫 苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂。它们增强宿主对疫苗的免疫应 答.本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素 E、非离子嵌段聚合物、 胞壁酰二肽、ISCOMs (免疫刺激复合体，参考例如欧洲专利EP 109942)、皂苷、矿物油、植物 油，和 Carbopol。
[0039] 因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
[0040] 可用于本发明的可药用载体或者稀释剂的其他实例包括稳定剂，如SPGA、糖类 (例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）、蛋白质，如白蛋白或者酪蛋白、含有 蛋白质的物质，如牛血清或者脱脂乳和缓冲液（例如，磷酸盐缓冲液）。
[0041] 特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的 更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。
[0042] 此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包 括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。本发明所用的术语"联合疫苗"用于指 从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语"复合疫 苗"指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖 与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。
[0043] 作为本发明的一种实施方式，所述疫苗进一步含有失活病原体或抗原组分，优选 地，所述抗原为猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原和/或副猪 嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
[0044] 作为本发明的一种实施方式，本发明的弱毒可以插入外源基因，所述的外源基因 编码选自感染猪的多种病原中的一种或多种抗原，所述病原体由猪繁殖呼吸综合征（PRRS) 病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪圆环病毒1型或者2型、 大肠杆菌、猪红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusi opathiae),支气管败血性博德特菌 (Bordetella bronchiseptica),副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis)、猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae)和猪链球菌（Streptococcus suis)组成。
[0045] 优选地，所述疫苗组合物还包括介质、佐剂、赋形剂。
[0046] 本发明的疫苗组合物还可包含介质、佐剂和/或赋形剂。生理盐水或蒸馏水可用 作介质。
[0047] 本发明的另一个方面涉及一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包 括：（1)扩增培养所述猪伪狂犬病毒弱毒株；以及（2)在所述扩增培养的猪伪狂犬病毒弱毒 株中加入冻干保护剂。
[0048] 本发明的另一个方面涉及所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病的药 物中的应用。
[0049] 作为本发明的一种实施方式，所述的猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒变异株导致的 猪伪狂犬病。
[0050] 本文所用的术语"猪伪狂犬病病毒相关疾病"可以指表现为任何年龄的猪都会感 染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1?2天），发病率在10 %?100 %之间，发病猪死亡率 在10%?100%之间（仔猪死亡率可高达100% )，感染后可引起猪只高热（40?42°C， 持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不 起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产（高 达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状，但不限于此。上 述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成 感染后成年猪（体重在50kg以上猪）可引起猪只高热（40?42°C，持续3日以上），呼吸 困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划 水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90 %以上； 发病仔猪主要表现为体温上升达41°C以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶 前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
[0051] 本文所用的术语"预防"指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染 或推迟疾病发作的所有行为。术语"治疗"指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂 犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图 1 为 PUCgI/gE/llK/28KA-GFP-B 质粒的构建示意图；
[0053] 图2为gI/gE/llK/28K基因缺失位置及USA和USB同源臂在基因组上所在位置示 意图；
[0054] 图3为通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株gI/gE/llK/28K基因缺失前 后的PCR片段电泳对比图；
[0055] 图4为TK基因缺失位置及TKA和TKB同源臂在基因组上所在位置示意图；
[0056] 图5为通过PCR方法确认猪伪狂犬病病毒HN1201株TK基因缺失前后的PCR片段 电泳对比图；
[0057] 序列表中：
[0058] 序列1为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株gI/gE/llK/28K基因核苷酸序列；
[0059] 序列2为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因核苷酸序列；
[0060] 序列3为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因缺失后该位置核苷酸序列； [0061] 序列4为猪伪狂犬病病毒HN1201株毒株TK基因缺失后该位置氨基酸序列；
[0062] 序列5为猪伪狂犬病病毒HN1201株的gE氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0063] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0064] 本发明中的术语"头份"是指每头猪注射的疫苗量。
[0065] 本发明中所述的"TCID^/'bO% tissue culture infective dose)是指半数细胞 培养物感染量，是表不病毒感染力的一种表不方式。
[0066] MEM液体培养基（液）用购自美国Life Technologies公司的MEM干粉培养基按 照其说明书配制。
[0067] 本发明的DMEM培养基参照GB/T18641-2002附录A配制方法配制。
[0068] 本发明中所述的"PBS"是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline)的英文缩 写，本发明中使用的是0. OlmM的PH7. 4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
[0069] 本实施例所用的猪伪狂犬病毒 HN1201 株（Pseudorabies virus, strain HN1201) 保藏号为CCTCC NO. V 201311 ;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉?武 汉大学，保藏日期为2013年5月20日。
[0070] 本实施例所用的猪伪狂犬病毒 ΗΝ12〇2 株（Pseudorabies virus, strain ΗΝ12〇2) 保藏号为CCTCC NO. V 201335 ;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉?武 汉大学，保藏日期为2013年8月26日。
[0071] PRV是术语猪伪狂犬病毒Pseudorabies virus的英文简写。
[0072] 以下【具体实施方式】中，分别以猪伪狂犬病毒变异株PRV HN1201株、NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、HN1202株为例说明本发明。
[0073] 实施例1、PRV HN1201株gI/gE/llK/28K缺失毒株的制备
[0074] 1. 1PRV HN1201GFP重组病毒转移载体的构建
[0075] 根据要缺失的US区段（gI/gE/llK/28K)的序列，在其两端设计同源臂，分别为 USA和USB。将USA和USB克隆到pUC19载体上，命名为pU⑶SAB。然后将GFP基因克隆至 pU⑶SAB上，获得重组病毒转移载体，命名pU⑶SA-GFP-B。转移载体中同源臂为US两侧序 列，所以重组后得到的重组病毒即为包含gI/gE/llK/28K的US区段缺失的。重组转移载体 构建示意图见图1，图2为USA和USB同源臂在基因组上所在位置。
[0076] 1. 1. 1、同源重组臂的扩增及克隆
[0077] 1. 1. 1. 1引物设计和模板制备
[0078] 根据HN1201病毒的基因序列设计两对引物，用于扩增缺失区段两侧的同源臂：
[0079] 左侧同源臂USA的上下游引物分别为：
[0080] USAF: CCGGAATTCTCGTCGTGGGCATCGTCATCAT (下划线为 EcoR I 酶切位点）
[0081] USAR:CTATCTAGAataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCGGTACTGCGGAGGCTACGGA C (下划线为Xba I酶切位点，小写字母为loxp位点）
[0082] 右侧同源臂USB的上下游引物分别为：
[0083] USBF:ACATGCATGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttatACGGCAGGATCTCTCCGCGT CCC (下划线为SphI酶切位点，小写字母为loxp位点）
[0084] USBR:CCCAAGCTTAGGAGGGGGCGGGGAGCGCGAGC(下划线为 Hind III 酶切位点）
[0085] 取？1^圆1201感染￥從〇细胞，待细胞80%以上发生病变后，取部分上清，采用 Geneaid Viral Nucleic Acid Extraction试剂盒提取病毒基因组DNA，作为同源臂扩增的 模板。
[0086] 1. 1. 1. 2同源臂USA、USB的扩增及克隆
[0087] 利用TAKARA的PrimeSTAR进行PCR扩增USA、USB，体系及条件如下：
[0088]
【权利要求】
1. 一种猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒弱毒株为gI/gE/llK/28K蛋白 失活的猪伪狂犬病毒株，优选地，所述伪狂犬病毒株为伪狂犬变异株。
2. 根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因 组中gI/gE/llK/28K整个ORF缺失。
3. 根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述伪狂犬变异株为gE蛋白序 列为SEQ ID NO. 07或与其序列同源性为95%以上的毒株；优选地，所述的猪伪狂犬变异株 为经分离的所述猪伪狂犬病毒变异株当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有 技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症 状的毒株；更优选地，所述的猪伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免 疫了现有技术中缺失gE、TK和gl基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后所述 猪依然感染猪伪狂犬病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉 郁和食欲下降的毒株。
4. 根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述伪狂犬病毒株为HN1201株、 HN1202 株、JS-2012 株、猪伪狂犬 HeNl 株、NVDC-PRV-BJ 株、NVDCPRV-HEB 株或 NVDC-PRV-SD 株、PRV TJ 株或 PRV-ZJ01 株。
5. 根据权利要求1?4任一项所述的猪伪狂犬病毒弱毒株，其中，所述的猪伪狂犬病毒 弱毒株进一步TK蛋白失活；优选地，所述猪伪狂犬病毒弱毒株基因组中TK位置的核苷酸序 列编码表达SEQ. NO. 4的氨基酸序列。
6. -种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1?5任一项所述 的猪伪狂犬病毒弱毒株抗原和载体；优选地，猪伪狂犬病毒弱毒株抗原含量为> 1〇6_°TCID5(i 头份。
7. 根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病毒弱毒株抗原为活的所 述猪伪狂犬病毒弱毒株；所述疫苗组合物进一步包括冻干保护剂。
8. 根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗进一步含有失活病原体或抗原 组分，优选地，所述抗原为猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原 和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
9. 一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：（1)扩增培养权利要求1?5任 一项所述猪伪狂犬病毒弱毒株；以及（2)在所述扩增培养的猪伪狂犬病毒弱毒株中加入冻 干保护剂。
10. 权利要求6?7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病的药物中 的应用，优选地，所述的猪伪狂犬病是由权利要求3所述的猪伪狂犬病毒株变异株导致的 猪伪狂犬病。
【文档编号】A61P31/22GK104250640SQ201410418379
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】田克恭, 张许科, 孙进忠, 谭菲菲 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司