一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特点在于以人二倍体细胞为培养基质，应用反应器培养工艺，接种水痘OKa株，收获后使用自主发明的含山梨醇和重组人血清白蛋白的冻干保护剂，生产冻干水痘减毒活疫苗。应用反应器养技术，不但降低了生产成本，解决了静止培养工艺中产量低，生产占地大，劳动强度大等弊端，提高了疫苗的产量，增加了病毒滴度稳定性而且同时使用含山梨醇和重组人血清白蛋白的保护剂，此保护剂无明胶，去除了动物源性成分，并且使疫苗内毒素含量明显降低，极大地降低了疫苗对人体的刺激性及危害性，提高了疫苗的安全性和稳定性。
【专利说明】一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法。
【背景技术】
[0002] 水痘是由水痘-带状疱疹病毒引起的急性呼吸道传染病，具有高度传染性，常见 于儿童，发热伴全身瘙痒性皮疹、斑疹、丘疹和水泡疹是其主要临床特征。由于儿童期水痘 发病绝大多数症状轻微，过去常不被人们所重视，但患水痘后处理不当，会并发肺炎、脑炎 等严重疾病，甚至死亡，且感染后潜伏在体内，激活后又可发生带状疱疹。我国儿童水痘的 发病和危害日益凸显。接种水痘疫苗是目前控制水痘感染与流行的有效手段，如何进一步 增加水痘疫苗供应量，提高水痘疫苗的质量是公共卫生领域不可忽视的重要问题之一。
[0003] 反应器细胞培养技术是以反应器悬浮培养动物细胞生产或研制生物制品的一种 通用的平台技术，可广泛地用于生产单抗、人用疫苗或者兽用疫苗等生物制品。国内人用 和兽用疫苗生产企业有100多家，但只有5家左右企业是采用反应器细胞培养技术生产疫 苗，其他超过95%的疫苗企业生产仍然采用批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多的转 瓶机，细胞培养和病毒生产效率低。美国FDA和我国SFDA都鼓励和要求各生物公司建立起 规模化、自动化的疫苗生产技术平台，从而提高和保证疫苗质量。反应器细胞培养技术是疫 苗生产的重要的发展趋势。
[0004] 目前使用的疫苗冻干保护剂多数是以明胶、蔗糖为主要成分。明胶和明胶衍生物 能直接引起被接种者的变态反应，另外明胶也是细菌内毒素的主要来源，可导致人体产生 发热反应。为了减轻或避免疫苗使用过程中出现的不良反应，冻干保护剂中去除明胶和血 液源性白蛋白的需求变得更加迫切。
[0005] 目前，人血清白蛋白在疫苗领域被广泛应用于细胞培养和冻干保护剂。常见的人 血清白蛋白大多是从人的血浆中提取，这样的生产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还 可能含有危险的传染病病原体，如肝炎病毒、HIV病毒等，这使得人们对于使用血浆中提取 的人血清白蛋白存在巨大的担忧。随着现代DNA重组和合成技术的发展，人们开始利用DNA 重组技术生产人血清白蛋白替代传统的生产方式。国际上以重组人血清白蛋白替代血源性 产品的应用已成为趋势，目前国内已有企业利用水稻胚乳表达技术，研发出重组人清血白 蛋白产品，并成功实现重组人血清白蛋白规模化和产业化，完全摆脱了相关制约，具有纯度 更高、无动物组分、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等优势。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明目的在于，公开一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法， 所述方法利用生物反应器大规模培养水痘疫苗，不仅提高了疫苗的产量，而且收获后使用 一种含山梨醇和重组人血清白蛋白的冻干保护剂，生产冻干水痘减毒活疫苗，此保护剂去 除了动物源性成分，使疫苗内毒素含量明显降低，极大地降低了疫苗对人体的刺激性及危 害性。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，所述生产方法包括以下步骤：
[0009] 1)人二倍体细胞株的复苏和传代培养；
[0010] 2)人二倍体细胞使用微载体在生物反应器中培养；
[0011] 3)接种水痘病毒OKa株，病毒增殖，待细胞病变达到75%以上时准备收获水痘病 毒培养液，得到初步培养液；
[0012] 4)向所述初步培养液中加入冻干保护剂，收获水痘病毒培养液，经纯化后配制成 水痘疫苗原液；
[0013] 5)将上述水痘疫苗原液分装，冻干，即得到所述的新型冻干水痘减毒活疫苗。
[0014] 进一步的，所述冻干保护剂的原料包括山梨醇、重组人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖 酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸钠和尿素，所述各个原料的重量份数比为：
[0015] 山梨醇 2-8 重组人血清白蛋白 5-30 蔗糖 15-25 右旋糖酐-40 10-50 海藻糖 45-55 精氨酸 0.5-4
[0016] 谷氨酸钠 5-15 尿素 2-8。
[0017] 进一步的，所述的重组人血清白蛋白为水稻胚乳中或非动物源细胞中表达的白蛋 白。
[0018] 进一步的，所述人二倍体细胞株为WI-38, MRC-5,2BS，KMB-17中的任一种。
[0019] 进一步的，所述微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系 列微载体或Fibra-Cel Disks微载体中的任一种。
[0020] 进一步的，所述生物反应器为搅拌式生物反应器或填充床生物反应器。
[0021] 本发明与现有技术相比的有益效果为：
[0022] 1、本发明所述的方法利用反应器大规模培养技术，不但降低了生产成本，解决了 静止培养工艺中产量低、生产占地大、劳动强度大的弊端，而且提高了疫苗的产量，增加了 病毒滴度的稳定性；
[0023] 2、本发明所述的方法中使用了一种含有山梨醇和重组人血清白蛋白的冻干保护 齐U，生产冻干水痘减毒活疫苗，所述保护剂不含明胶，去除了动物源性成分，并且使疫苗内 毒素含量明显降低，避免了被接种者接种疫苗后的变态反应，极大的降低了疫苗对人体的 刺激性及危害性，提高了疫苗的安全性和稳定性；
[0024] 3、本发明所述的方法中使用重组人血清白蛋白代替人血清白蛋白，所述重组人血 清白蛋白纯度更高，无动物源组分，安全、高效、环保，价格低廉；
[0025] 4、本发明所述的方法，工艺易于实现，生产效率高，能够快速制备出高质量的水痘 疫苗。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] -种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，所述生产方法包括以下步骤：
[0028] 1)人二倍体细胞株的复苏和传代培养；
[0029] 复苏MRC-5细胞：从液氮中取出冻存的MRC-5细胞，立即放入37°C水浴中解冻， lOOOrpm离心5min，弃去上层冻存液，加入新鲜培养液，轻轻混匀置37°C培养2?4天至细 胞长满单层；其中，所述培养液为含10%小牛血清、1 %谷氨酰胺的MEM液，疫苗生产过程中 不加抗生素。
[0030] 消化传代：待细胞长成均匀、致密的单层，倾去培养瓶中培养液，加入胰蛋白酶消 化液消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰蛋白酶消化液，加入 新鲜细胞培养液后吹打，得到细胞悬液，按1 : 2的比例传代扩增到新培养瓶中。
[0031] 2)人二倍体细胞使用微载体在生物反应器中培养；
[0032] 待细胞在新培养瓶中长成均匀、致密的单层后，消化细胞制备细胞悬液，所述消化 如步骤1)中消化传代中所述，接种14L生物反应器，其中反应器中预先加入8g/L处理好的 无菌微载体，接种细胞终浓度为5X 105cells/mL，然后在37°C、pH7. 2、溶氧20%、搅拌转速 50rpm的条件下培养6?8天，至MRC-5细胞在微载体上长满单层。
[0033] 3)接种水痘病毒OKa株，病毒增殖，待细胞病变达到75%以上时准备收获水痘病 毒培养液，得到初步培养液；
[0034] 取水痘工作种子批毒种按0. 01?0. 1M0I比例，接种于培养好上述的MRC-5细 胞，加入维持液，调整培养温度35°C，至出现10?30%病变时，停止搅拌，弃去维持液，用 EarlV s液冲洗细胞面，去除牛血清，并换以维持液继续培养；所述维持液为含0. 1% g/mL 人血白蛋白的MEM培养基，待细胞病变达到75%以上时准备收获水痘病毒培养液，即得到 初步培养液。
[0035] 4)向所述初步培养液中加入冻干保护剂，收获水痘病毒培养液，经纯化后配制成 水痘疫苗原液；
[0036] 观察细胞出现病变达75%以上时，向所述初步培养液中加入冻干保护剂收集病毒 液，将细胞培养物经_80°C冻融，经澄清过滤后即为原液。
[0037] 5)将上述水痘疫苗原液分装，冻干，即得到所述的新型冻干水痘减毒活疫苗。
[0038] 将原液分装于西林瓶中，每支0. 6mL，经半加塞后置于冻干箱内，预冻至-45°C并 在此温度保温2小时，然后抽真空至0. lmbar，同时隔板升温至-25°C开始一次升华10小 时，于33°C控温5小时，即完成冻干，得到所述的新型冻干水痘减毒活疫苗。
[0039] 进一步的，所述冻干保护剂的原料包括山梨醇、重组人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖 酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸钠和尿素，所述各个原料的重量份数比为：
[0040] 山梨醇 2-8 重组人血清白蛋白 5-30 蔗糖 15-25 右旋糖酐-40 10-50 海藻糖 45-55 精氨酸 0.5-4 谷氨酸钠 5-15 尿素 2-8;
[0041] 所述冻干保护剂为含上述各原料的199综合培养基。
[0042] 进一步的，所述的重组人血清白蛋白为水稻胚乳中或非动物源细胞中表达的白蛋 白。
[0043] 进一步的，所述人二倍体细胞株为WI-38, MRC-5,2BS，KMB-17中的任一种。
[0044] 进一步的，所述微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系 列微载体或Fibra-Cel Disks微载体中的任一种。
[0045] 进一步的，所述生物反应器为搅拌式生物反应器或填充床生物反应器。
[0046] 所述水痘疫苗滴度、水分分析及稳定性检测结果，请参见表1。
[0047] 表1为不同实施实例生产的水痘疫苗滴度和水分检测，及37°C稳定性检测结果
[0048]
【权利要求】
1. 一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括以下步 骤： 1) 人二倍体细胞株的复苏和传代培养； 2) 人二倍体细胞使用微载体在生物反应器中培养； 3) 接种水痘病毒OKa株，病毒增殖，待细胞病变达到75 %以上时准备收获水痘病毒培 养液，得到初步培养液； 4) 向所述初步培养液中加入冻干保护剂，收获水痘病毒培养液，经纯化后配制成水痘 疫苗原液； 5) 将上述水痘疫苗原液分装，冻干，即得到所述的新型冻干水痘减毒活疫苗。
2. 根据权利要求1所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述冻 干保护剂的原料包括山梨醇、重组人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸 钠和尿素，所述各个原料的重量份数比为： 山梨醇 2-8 重组人血清白蛋白 5-30 蔗糖 15-25 右旋糖酐-40 10-50 海藻糖 45-55 精氨酸 0.5-4 谷氨酸钠 5-15 尿素 2-8。
3. 根据权利要求1所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述的 重组人血清白蛋白为水稻胚乳中或非动物源细胞中表达的白蛋白。
4. 根据权利要求1所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述人 二倍体细胞株为WI-38, MRC-5, 2BS，KMB-17中的任一种。
5. 根据权利要求1所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述微 载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体或Fibra-Cel Disks微载体中的任一种。
6. 根据权利要求1所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述生 物反应器为搅拌式生物反应器或填充床生物反应器。
7. 根据权利要求2所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述冻 干保护剂的原料包括山梨醇、重组人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸 钠和尿素，所述各个原料的重量份数比为： 山梨醇 8 重组人血清白蛋白 20 蔗糖 25 右旋糖酐-40 40 海藻糖 45 精氨酸 2 谷氨酸钠 10 尿素 8。
8. 根据权利要求2所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述冻 干保护剂的原料包括山梨醇、重组人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸 钠和尿素，所述各个原料的重量份数比为： 山梨醇 5 重组人血清白蛋白 20 蔗糖 20 右旋糖酐-40 30 海藻糖 50 精氨酸 1 谷氨酸钠 15 尿素 5。
9. 根据权利要求2所述的新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法，其特征在于，所述冻 干保护剂的原料包括山梨醇、重组人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨酸 钠和尿素，所述各个原料的重量份数比为： 山梨醇 3 重组人血清白蛋白 10 蔗糖 15 右旋糖酐-40 20 海藻糖 55 精氨酸 3 谷氨酸钠 5 尿素 3。
【文档编号】A61K47/42GK104188923SQ201410419586
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】高辉 申请人:北京合康源生物科技有限公司