一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法及其用途。本发明提供一种高ALT乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒，从而构建HBV乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。本发明所提供的小鼠模型构建过程相对简单，技术手段相对容易，构建成本低。此外，本发明所采用的HBV质粒载体本身不具有毒性，不会诱导小鼠的免疫应答，还能够避免了嵌合体小鼠模型中存在的重症免疫缺陷，且所得HBV感染模型具有更高的血清ALT水平和明显的肝脏炎症表现。
【专利说明】一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方 法及其用途，并进一步涉及由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法构建获得的小 鼠模型及其用途。本发明所构建的动物模型可用于HBV急性感染相关机制的体内实验，在 HBV感染与发病机制的研究中具有很好的应用价值。
【背景技术】
[0002] 已有的用于HBV感染体内实验的小鼠模型按其构建方法的不同分为转基因小鼠 模型、病毒载体转染小鼠模型、嵌合体小鼠模型及尾静脉高压注射小鼠模型，这些方法均存 在着一些问题，具体来说：
[0003] (1)转基因小鼠模型是将HBV基因组通过转基因技术接入小鼠基因组中，能够产 生类似人类体内的HBV病毒颗粒和具有传染性，可以用于HBV致病机制的体内研究，也可 用于抗病毒药物抑制病毒复制的相关研究，但有其先天的不足：首先，转基因技术相对复杂 且成本较高；其次，由于未知的原因，整合到小鼠基因组中的HBV基因不能产生cccDNA (在 人类体内cccDNA是HBV复制的天然转录模板）；另外，由于是转基因的关系，小鼠的免疫系 统是将病毒识别为自身物质，需要再转入特异性的T淋巴细胞才能进行相关的机体免疫研 究，限制了该模型的研究应用范围。
[0004] (2)病毒载体转染小鼠模型是将带有HBV基因组的腺病毒载体转染到小鼠体内， 通过腺病毒载体，HBV基因组可以有效地转染入小鼠肝脏内并复制，可以产生轻到中度的肝 脏炎症及血清谷丙转氨酶（ALT)升高，可以用于在体内研究免疫介导的病毒清除机制，同 样其也有自身的缺点，腺病毒本身具有毒性，且能诱导机体的免疫应答限制了其应用。
[0005] (3)嵌合体小鼠模型首先需要放射线照射灭活其骨髓细胞，与重症联合免疫缺陷 鼠 （SCID mice)的骨髓细胞重组作为预处理，再移植入已在体外感染HBV的人类肝组织 片段构建嵌合体小鼠模型，此外还有通过免疫缺陷的转基因小鼠构建嵌合体模型，如uPA\ SCID小鼠，由于携带了人类肝细胞，所以该模型还可以用于其他嗜人肝细胞病毒重叠感染 的研究，嵌合体小鼠模型构建成本高且过程复杂，由于是重症免疫缺陷小鼠，限制了其在疫 苗及适应性免疫应答机制方面的应用。
[0006] (4)尾静脉高压注射构建的小鼠模型是近年来新出现的HBV感染动物模型，构建 过程相对简单，易于推广，通过小鼠的尾静脉向小鼠体内快速高压注射HBV病毒基因组，跨 过物种特异性屏障使HBV病毒有效的转入小鼠的肝脏，从而构建体内有HBV复制的小鼠模 型，而之前采用裸鼠或C57B/L小鼠构建的小鼠模型肝脏炎症不明显，ALT升高不显著。
【发明内容】
[0007] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒感染的 小鼠模型的构建方法及其用途，并进一步提供由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建 方法构建获得的小鼠模型及其用途。本发明亦使用尾静脉高压注射，但采用的是Tlr2基因 缺陷小鼠，克服了以上小鼠模型的不足。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种高ALT乙型肝炎病毒 感染的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质 粒，从而构建HBV乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。
[0009] 优选的，所述Tlr2基因缺陷小鼠为纯合Tlr2基因缺陷（Tlrff)小鼠或杂合Tlr2 基因缺陷（Tlr2 +/_)小鼠。
[0010] 更优选的，所述Tlr2基因缺陷小鼠为杂合Tlr2基因缺陷（Tlr2+勺小鼠。
[0011] 所述杂合Tlr2基因缺陷小鼠为纯合Tlr2基因缺陷（Tlr2+)小鼠与野生型小鼠 杂交繁衍获得，野生型小鼠优选为C57BL/6小鼠。
[0012] 所述纯合Tlr2基因缺陷（Tlrf+)小鼠和C57BL/6小鼠均引进自国家遗传工程小 鼠资源库-南京大学模式动物研究所。
[0013] 相关纯合Tlr2基因缺陷小鼠（Tlrf+小鼠）与杂合Tlr2基因缺陷小鼠（Tlr2+~J、 鼠）的基因鉴定方法具体为：实验小鼠剪尾抽提基因组DNA，通过特异引物及聚合酶链反应 (PCR)方法扩增Tlr2基因片段，最后进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳条带大小鉴定小鼠的 Tlr2基因型。
[0014] 优选的，所述向Tlr2基因缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒的具体方式为经小鼠 尾静脉注射，给药量为19. 5-20. 5 μ g。
[0015] 更优选的，所述注射具体为经小鼠尾静脉高压注射。
[0016] 进一步优选的，所述小鼠尾静脉高压注射包括如下步骤：将HBV基因组DNA质粒 以9. 75-10. 25 μ g/mL的浓度溶于注射溶质中形成注射液，在5-10秒内通过小鼠尾静脉将 I. 95-2. 05mL注射液注射入小鼠体内。
[0017] 所述注射溶质可为本领域中各种常用的适合于小鼠的医用注射溶质，优选为医用 林格式液（Ringer液）。
[0018] 通过高压注射的方法可以迅速让小鼠肝脏处于充血状态，从而使得HBV基因组 DNA质粒在肝脏充分灌注并转染。
[0019] 优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平> 100IU/L。相对于传统尾静脉高压注射 构建的小鼠模型的ALT水平（通常在50-80范围）有较大幅度提高。
[0020] 更优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平彡150IU/L。
[0021] 更优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平彡250IU/L。
[0022] 进一步优选的，所述高ALT具体指血清ALT水平> 300IU/L。
[0023] 优选的，所述HBV基因组DNA质粒为野生型HBV质粒或突变型HBV质粒。
[0024] 所述野生型HBV质粒中HBV基因组DNA的参考序列号为NC_003977. 1。
[0025] 更优选的，所述突变型HBV质粒中HBV基因组DNA的突变位点为：1753T>C、 1762A>T/1764G>A、1896G>A。其中 1762 和 1764 是联合突变，故用 1762A>T/1764G>A 表示。
[0026] 优选的，所述HBV基因组DNA质粒的构建方法为：将HBV基因组DNA构建入载 体质粒后获得，具体构建方法可参见Yu等，JOURNAL OF VIROLOGY，Distinct Modes of Regulation of Transcription of Hepatitis B Virus by the Nuclear Receptors HNF4 a and C0UP-TF1，February 2003vol.77no. 42489-2499。
[0027] 更优选的，所述载体质粒为pSP65质粒，质粒购自美国Promega公司。
[0028] 携带HBV基因组DNA的野生型HBV质粒或突变型HBV质粒由复旦大学分子病毒学 重点实验室提供。
[0029] 本发明第二方面提供所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法在动物模型 构建领域的用途。
[0030] 本发明第三方面提供一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型，由所述乙型肝炎病毒感 染的小鼠模型的构建方法构建获得。
[0031] 本发明第四方面提供由所述乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法构建获得 的乙型肝炎病毒感染的小鼠模型在筛选预防或治疗乙型肝炎的药物中的用途。
[0032] 本发明通过检测反应小鼠模型中HBV复制水平及肝脏炎症程度，验证了相关小鼠 模型的成功构建，包括检测血清中ALT水平，血清乙肝病毒核酸（HBV DNA)水平，血清乙肝 表面抗原（HBsAg)及乙肝e抗原（HBeAg)定量，肝组织病理学检查直接观察肝脏炎症，免疫 组化检测肝组织中HBsAg，具体方法为：经小鼠眼眶下静脉丛采血，全血经离心后分离出血 清进行相应的检测；肝病理学检查在实验最后进行，牺牲小鼠后剖腹取得其肝脏大体标本， 使用福尔马林液固定，制片后行相应的病理学及免疫组化检查。
[0033] 本发明构建的HBV急性感染小鼠模型与已有的类似小鼠模型相比具有众多有益 效果。首先，本小鼠模型构建过程相对简单，技术手段相对容易，构建成本低，不像转基因小 鼠及嵌合体小鼠那样对技术要求高，构建过程复杂且成本高，所以本小鼠模型更易推广应 用；其次，本发明所采用的HBV质粒载体不像腺病毒载体，本身不具有毒性，也不会诱导小 鼠的免疫应答；此外，本小鼠模型避免了嵌合体小鼠模型中存在的重症免疫缺陷；最后，不 同于在C57B/L小鼠（B6小鼠）中通过尾静脉高压注射构建的小鼠模型，本发明通过Tlr2 基因缺陷小鼠构建的HBV感染模型具有更高的血清ALT水平和明显的肝脏炎症表现。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1显示为本发明构建的急性HBV感染小鼠模型可模拟急性乙型肝炎的血清ALT 升高表现示意图，其中B代表B6小鼠，C代表Tlr2-/_小鼠，Z代表Tlr2+/_小鼠；W代表注 射野生型HBV质粒，M代表注射突变型HBV质粒；
[0035] 图2显示为本发明构建的急性HBV感染小鼠模型可以模拟急性乙型肝炎的肝组织 病理学的肝炎表现；
[0036] 图3显示为本发明鉴别小鼠的Tlr2基因型电泳图；
[0037] 图4显示为本发明实验小鼠血清ALT水平变化示意图，其中B代表B6小鼠，C代表 Tlr2-/_小鼠，Z代表Tlr2+/_小鼠；R代表注射Ringer液，K代表注射空质粒，W代表注射野 生型HBV质粒，M代表注射突变型HBV质粒，每个时间点数据用均值土标准差（mean 土 SD) 表不；
[0038] 图5显示为本发明实验小鼠血清HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平变化示意图，其中 B代表B6小鼠，C代表Tlrf+小鼠，Z代表Tlr2+/_小鼠；R代表注射Ringer液，K代表注射 空质粒，W代表注射野生型HBV质粒，M代表注射突变型HBV质粒，每个时间点数据用均值 土标准差（mean 土 SD)表不；
[0039] 图6显示为本发明肝组织病理学示意图：图a所示为对照组（B6)小鼠肝组织病理 (放大100倍）；图b所示为本发明构建小鼠模型肝组织病理（放大200倍）；
[0040] 图7显示为本发明注射HBV质粒的小鼠的免疫组化检查示意图；
【具体实施方式】
[0041] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0042] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0043] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0044] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition, 2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press，San Diego ;Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego,1998 ;METH0DS IN ENZYM0L0GY， Vol.304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe,eds.),Academic PressiSan Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker， ed.)Humana Press，Totowa，1999 等。
[0045] 本发明实施例中所使用的实验材料和仪器如下：GoTaqR DNA聚合酶体系（美国 Promega)，dNTP混合液（日本TaKaRa) ;Eppendorf 541?型高速离心机,BIO-RAD稳压稳流 电泳仪，BIO-RAD 凝胶成像系统，GerieAmp? PCR System 9700 热循环仪，Beckman Coulter 全自动生化分析仪，DK-8D型电热恒温水槽。
[0046] 实验小鼠：纯合Tlr2基因缺陷小鼠（Tlrff小鼠）与C57BL/6小鼠（B6小鼠） 引进至国家遗传工程小鼠资源库-南京大学模式动物研究所，杂合Tlr2基因缺陷小鼠 (Tlr2 +/_小鼠）由本发明实验中使用Tlr2+小鼠与B6小鼠杂交繁殖而来。所有实验小鼠 均饲养在上海瑞金医院实验医学研究中心SPF级动物房内并喂食常规饲料和水源，近交繁 殖实验小鼠。实验组小鼠分为Tlrff小鼠组（代号C)，Tlr2+小鼠组（代号Z)，对照组 小鼠为B6小鼠组（代号B)，每组再根据注射液成分的不同分为4个亚组，注射液成分包括 Ringer液（代号R)，空载体质粒（代号K)，野生型HBV质粒（代号W)，突变型HBV质粒（代 号Μ)，每亚组每次实验的小鼠数不少于3只，采用8到10周龄的健康雄性小鼠构建动物模 型。
[0047] 实施例1
[0048] 小鼠 Tlr2基因型的鉴定：
[0049] (1)抽提实验小鼠基因组DNA :剪取小鼠尾端约0. 8厘米，以50 μ 1蛋白酶K液 裂解（1011^/1^)，561：水浴过夜，次日离心（12000转/分，室温离心10分钟），加70%乙 醇0. 5ml，吹吸数次至出现絮状沉淀，室温下以13200转/分离心3分钟，弃上清后晾干，力口 200 μ I CldH2O溶解得到小鼠基因组DNA，4°C保存。
[0050] (2)PCR及凝胶电泳实验鉴定小鼠基因型：
[0051] PCR 体系配制（50 μ 1):
【权利要求】
1. 一种高ALT乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：向Tlr2基因 缺陷小鼠给药HBV基因组DNA质粒，从而构建HBV乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。
2. 如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Tlr2基因缺陷小鼠为 纯合Tlr2基因缺陷小鼠或杂合Tlr2基因缺陷小鼠。
3. 如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，向Tlr2基因缺陷小鼠给药 HBV基因组DNA质粒的给药量为19. 5-20. 5 μ g。
4. 如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述高ALT具体指血清ALT 水平彡100IU/L。
5. 如权利要求4所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述高ALT具体指血清ALT 水平彡300IU/L。
6. 如权利要求1所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述HBV基因组DNA质粒为 野生型HBV质粒或突变型HBV质粒。
7. 如权利要求6所述的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述野生型HBV质粒中HBV 基因组DNA的参考序列号为NC_003977. 1。
8. 如权利要求6所述的乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述 突变型HBV质粒中HBV基因组DNA的突变位点为：1753T>C、1762A>T/1764G>A、1896G>A。
9. 如权利要求1-8任一权利要求所述的小鼠模型的构建方法在动物模型构建领域的 用途。
10. 如权利要求1-8任一权利要求所述的小鼠模型的构建方法构建获得的乙型肝炎病 毒感染的小鼠模型在筛选预防或治疗乙型肝炎的药物中的用途。
【文档编号】A61K49/00GK104212835SQ201410425641
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】张欣欣, 刘晶, 谷雷雷, 韩悦, 杨慧娟, 谢幼华, 沈忠良 申请人:张欣欣, 刘晶, 谷雷雷, 韩悦, 杨慧娟, 谢幼华, 沈忠良