鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用，属于菌株诱变【技术领域】；具体为一株鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株，命名为鰤鱼诺卡氏菌NSX1(NocardiaseriolaeNSX1)，菌种保藏号为CGMCCNO.9437；一种免疫组合物，包含鰤鱼诺卡氏菌弱毒株作为免疫原性组分，其中鰤鱼诺卡氏菌弱毒株的浓度为103-109CFU/ml；该鰤鱼诺卡氏菌弱毒株用于制造抗鱼类诺卡氏菌病的药物，具有显著的低毒效果，同时能有效地保护鱼类免受诺卡氏菌病致病菌株或毒力株导致的鰤鱼诺卡氏菌的侵害，免疫效果显著，具有非常好的诺卡氏菌病的防治效果。
CGMCC No.9437
2014.07.10
【专利说明】鮞鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鱼类诺卡氏菌的诱变及其应用，具体涉及一种蛳鱼诺卡氏菌诱变 弱毒株及其应用，属于菌株诱变【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 鱼类诺卡氏菌病是池塘养殖、浮筏式网箱养殖和深水网箱养殖模式中的常见病害 之一，是一种慢性系统性肉芽肿疾病，蛳鱼诺卡氏菌 seriohe)是其主要的致病 菌。该病能在鱼体内及体表形成大量结节，还会引起鱼类体表出血及溃疡，严重影响成鱼 的商品价值，其感染率和死亡率都较高，自然发病率可达到15?30%，严重时可达50? 60%，平均死亡率约20%，人工感染的死亡率可高达90%?100%。近年来鱼类诺卡氏菌病 在我国和东南亚地区呈上升趋势，染病的鱼种不断增加(据不完全统计已有近20种)，造成 的经济损失也日益严重。根据已有报道，在我国蛳鱼诺卡氏菌感染的鱼种既有卵形鲳鰺 {Trachinotus ovatus) {Larimichthys crocea) {Fugu obscurus) ^ 鱼卢和花身删（Tkra/7〇/7 j'ar/wa)等海水鱼类，又有乌體（CXa/zaa 大口黑自卢等淡水鱼类。
[0003] 传统意义上，治疗和预防鱼类细菌病主要依赖其菌株敏感性的抗生素。然而，由于 诺卡氏菌主要存在于患病鱼体的结节中，药物的临床应用基本无效，目前尚无该病害的有 效防治措施。再加上抗生素的滥用还会引起鱼体药物残留、造成环境污染、破坏水体有益菌 群平衡等更为严重的问题。因此，为避免上述问题的产生，且能有效控制该病的发生与流 行，我们必须不遗余力地研发出实用性和可操性强的免疫防控新技术，其中首当其冲的是 高效疫苗的研制，这代表了当今国际水产业发展的前沿与趋势。
[0004] 然而从世界范围来看，鱼类诺卡氏菌疫苗的研发进程不甚理想，因为与其他鱼类 致病菌不同，研究发现蛳鱼诺卡氏菌的多种灭活疫苗基本不能提供免疫保护作用，这使得 灭活疫苗的开发路线丧失了可行性。减(弱）毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫 效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性）的 技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。为了打破鱼 类诺卡氏菌疫苗的研究困境，筛选弱毒株、研制高效安全的蛳鱼诺卡氏菌活疫苗应是行之 有效的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种蛳鱼诺卡氏菌诱变弱毒株、相关制剂及应用，具有显著的低 毒效果，同时能有效地保护鱼类免受诺卡氏菌病致病菌株或毒力株导致的蛳鱼诺卡氏菌的 侵害，免疫效果显著，具有非常好的诺卡氏菌病的防治效果。
[0006] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是： 一株獅鱼诺卡氏菌诱变弱毒株，命名为獅鱼诺卡氏菌NSX1 (/Vocart/ia serio/ae NSX1)，于2014年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 9437。
[0007] -种免疫组合物，包含上述蛳鱼诺卡氏菌弱毒株作为免疫原性组分。本发明免疫 组合物中，所述蛳鱼诺卡氏菌弱毒株的浓度为l〇 3_l〇9CFU/ml。本发明免疫组合物，还可包 含磷酸缓冲液。
[0008] 蛳鱼诺卡氏菌弱毒株可以用于制造抗鱼类诺卡氏菌病的药物。
[0009] 本发明的有益效果在于： 1. 本发明的蛳鱼诺卡菌株诱变弱毒株是经过紫外和化学试剂多重诱变，筛选后获得， 相对于野生毒株ZJ0503具有显著的低毒效果，同时能有效地保护鱼类免受诺卡氏菌病致 病菌株或毒力株导致的蛳鱼诺卡氏菌的侵害，免疫效果显著，具有非常好的诺卡氏菌病的 防治效果； 2. 本发明的蛳鱼诺卡菌株诱变弱毒株不携带任何抗生素抗性标记和其它标记，对环境 不存在传播抗生素抗性的潜在危险；无任何外源性基因片段，极大消除向环境传播大量毒 性病原体的可能性，具有技术上的环境和产品安全性，有实际的商业开发应用价值； 3. 本发明的蛳鱼诺卡菌株诱变弱毒株为活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应 用前景。
【具体实施方式】
[0010] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。
[0011] 本发明实施方式之一提供了一种蛳鱼诺卡氏菌诱变弱毒株。具体地说，从患诺 卡氏菌病的卵形鲳鰺中分离获得了一株蛳鱼诺卡氏菌ZJ0503，以蛳鱼诺卡氏菌野生菌株 ZJ0503为基础，经过紫外和化学多重诱变，筛选得到了一株颜色与ZJ0503不同（ZJ0503菌 落呈淡黄色，而该菌株颜色为黄色）且在斑马鱼模型上具有显著减毒效果的天然弱毒株，将 其命名为蛳鱼诺卡氏菌NSX1 OVocart/ia seriohe NSX1，后文简称"NSX1"），于2014年7 月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，菌种保藏号为 CGMCC No. 9437。其特点是，它是蛳鱼诺卡氏菌野生毒株的诱变弱毒株，因此该弱毒株不携 带任何外源性基因片段。
[0012] 本发明的蛳鱼诺卡氏菌诱变弱毒株可按照蛳鱼诺卡氏菌常规培养方法进行培养。 例如，培养基可选用BHI培养基和蛳鱼诺卡氏菌改良培养基(夏立群等，蛳鱼诺卡氏菌培养 条件及培养基的优化，南方水产科学，2013,9(3) : 51-56)，于25-28°C固体或液体培养。本 发明实施例之一选用了蛳鱼诺卡氏菌改良培养基。
[0013] 本发明的另一实施方式提供了一种免疫组合物，其中包含本发明的蛳鱼诺卡氏菌 诱变弱毒株NSX1作为免疫原性组分。本发明的免疫组合物还可以包含各种适宜的载体和 免疫佐剂。所述载体例如无菌磷酸缓冲液和生理盐水。本发明实施例之一采用无菌磷酸缓 冲液作为载体。所述免疫组合物的pH以生理pH、尤其是目标鱼类的体内生理pH为宜，例如 pH 6-8 和 pH 7-7. 2。
[0014] 本发明免疫组合物的形式之一是即用组合物，其中作为免疫原性组分的本发明弱 毒株NSX1的浓度可以采用常规技术手段试验确定，也可参照本领域实践经验来试验确定。 例如，本发明的免疫组合物中，所述蛳鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1浓度的数量级为103-109cfu/ 1111，例如103、104、105、106、10 7、108或1(^^"1111，或者以上所述任意两两构成的区间，例如 103-10 8CFU/ml。本发明实施例之一的注射剂型中，所述蛳鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1浓度的数 量级为 l〇4_l〇9CFU/ml。
[0015] 本发明的另一实施方式提供了一种防治鱼类诺卡氏菌病的方法，采用本发明的蛳 鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1来免疫鱼类。可以将本发明的弱毒株NSX1作为疫苗使用，也可以将 其和合适的免疫组合物配置使用。水产养殖业常规免疫方式均适用于本发明，例如注射、浸 泡和口服。适宜的使用浓度为 l〇3_l〇9CFU/ml，或者 ΙΟ3、ΙΟ4、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、10 8 或 109CFU/ml，或 者以上所述任意两两构成的区间，例如l〇3_l〇8CFU/ml。或者，免疫剂量可以是10 2-109CFU/ 尾，或者102、103、10 4、105、106、107、108或io 9cfu/尾，或者以上所述任意两两构成的区间， 例如102-108CFU/尾，10 3-109CFU/尾等。又或者，免疫剂量可以是102-109CFU/g(体重）， 或者10 2、103、104、105、106、10 7、108或109CFU/g，或者以上所述任意两两构成的区间，例如 Kf-KfCFU/gaoLKfCFU/g等。例如，注射免疫时，弱毒株亦即疫苗株剂量的数量级可以是 104CFU/g (体重）。
[0016] 本发明用下列实施例来进一步说明。
[0017] 实施例1弱毒活疫苗的制备 (一）蛳鱼诺卡氏菌诱变弱毒株的诱变、筛选和鉴定 1、蛳鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503菌悬液的制备 2005年03月本实验室从广东省湛江港和阳江闸坡海水网箱养殖场的患结节病卵形鲳 鰺中分离所得一株蛳鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503 (黄郁葱等，卵形鲳鰺结节病病原的分离 与鉴定，广东海洋大学学报，2008，28(4): 49-53)。将保存于-80°C冰箱的蛳鱼诺卡氏菌 ZJ0503菌种划线于BHI固体培养基上，于28°C恒温倒置培养7d，挑取单菌落于无菌磷酸缓 冲液中，混匀制成菌悬液。
[0018] 2、紫外诱变 分别吸取〇. lml ZJ0503菌悬液涂布到含有0. 39ΓΟ. 5%氯化锂（LiCl，是一种诱变剂)的 蛳鱼诺卡氏菌改良固体培养基平板上。涂布接种后的平板在30W紫外灯、照射距离65cm的 无菌条件下分别紫外诱变lmin、2min、5min、lOmin、15min和30min，每个照射时间设置3个 平行样品。将经紫外线诱变后的所有平板置于28°C培养24-48h。同时将接种后未经紫外 线诱变的平板在相同条件下培养，作为对照。培养后，统计各皿菌落数和菌落形态突变菌落 数，计算不同剂量紫外诱变处理的菌落致死率和菌落形态突变率。计算公式如下：
【权利要求】
1. 一株蛳鱼诺卡氏菌诱变弱毒株，其特征在于：命名为蛳鱼诺卡氏菌NSX1，其菌种保 藏号为CGMCC NO. 9437,保藏日期2014年7月10日。
2. -种免疫组合物，其特征在于：蛳鱼诺卡氏菌NSX1弱毒株作为免疫原性组分。
3. 根据权利要求2所述的一种免疫组合物，其特征在于，所述蛳鱼诺卡氏菌NSX1弱毒 株的浓度为l〇3_l〇 9CFU/ml。
4. 蛳鱼诺卡氏菌NSX1弱毒株的应用，其特征在于：用于制造抗鱼类诺卡氏菌病的药 物。
【文档编号】A61P31/04GK104232535SQ201410440154
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】夏立群, 陈建林, 鲁义善, 简纪常, 蔡佳, 张红莲 申请人:广东海洋大学