同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白的制作方法

同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及同时阻断HER2和VEGFR信号通路的重组融合蛋白。具体而言，本发明涉及包含表皮生长因子受体2靶向抗体和血管内皮生长因子中和结构域的融合蛋白、编码该融合蛋白的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞以及含有该融合蛋白的药物组合物。本发明的融合蛋白能够同时作用于HER2和VEGF两条信号通路并发挥一定的协同作用，提高了抗肿瘤疗效。
【专利说明】同时阻断HER2和VEGFR信号通路的重组融合蛋白

【技术领域】
[0001] 本发明涉及同时阻断HER2和VEGFR信号通路的重组融合蛋白。具体而言，本发明 涉及包含表皮生长因子受体2靶向抗体和血管内皮生长因子中和结构域的重组融合蛋白。

【背景技术】
[0002] -直以来乳腺癌都是一种致命性疾病，从首次发现转移到累积生存率为50%时所 对应的生存时间仅为 17 至 20 个月（Piccart M. Anticancer Drugs, 7:5-7, 1996)。有一些 激素、细胞毒素或者生物制剂在乳腺癌的保守治疗中表现出一定的作用，但是目前并没有 一致认可的标准治疗方案（Bernard Marty C,等，Oncologist, 9:617-632, 2004)。
[0003] 在上世纪80年代，Denis Slamon首次在189个原发性乳腺癌病例中发现 HER2(人表皮生长因子受体2)基因在30%的病例中都过度表达，并表明HER2与总存 活率及复发时间密切相关（Salman DJ，等，Science, 235:177-182,1985)。目前的研究 表明，大约25?30%的乳腺癌病人中的册1?2都是过表达的〇^^^11丨 〇11?，等3111·】 Cancer, 34:791-808, 1998)，并且其与肿瘤的恶性生长程度相关（Wright C,等，Cancer Res,49:2087-2090, 1989)〇
[0004] 曲妥珠单抗（Trastuzumab)是一个抗HER2胞外区的人源化单克隆抗体（Carter P，等，PNAS，89 (10) : 4285-4289, 1992)，然而其在临床应用中的抗肿瘤效果往往没有临床 前实验那么好（Slamon DJ,等，N Engl J Med, 344:783-792, 2001)。
[0005] 血管新生是乳腺癌进展和转移的关键因素，严重影响治疗的预后（Folkman J， 等，Nat Rev Drug Discov, 6:273-286, 2007 ;Kumar S,等，Cancer Res, 59:856-861, 1999)。 VEGF是肿瘤血管新生过程中最重要的调控因素 （Ferrara N,等，似〖]^(1，9:669 -676, 2003 ;Tischer E,等，J. Biol. Chem·，266:11947 - 11954, 1991)。VEGF 作为促血管生 成因子，能增大血管的通透性，刺激内皮细胞的增殖、迁移，促进肿瘤血管新生，参与肿瘤的 生长、侵袭和转移。VEGF在多种人类肿瘤中都被发现有增强的表达，且其增强的表达与肿 瘤组织内血管的新生数量有直接的关系，这些肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、非小细胞性肺 癌、卵巢癌等$〇11〇1^11，了^』叩1.了.]^(1.，333:1757 - 1763，1995;6&8口&1^1116.丄(：1111· Oncol.，13:765 - 782, 1995.)。
[0006] 近期的研究发现，HER2和VEGF可能存在关联（Klos KS，等，Cancer Res, 66:2028_2037,2006 ;Yen L，等，Oncogene, 19:3460-3469,2000 ;Laughner E， 等，Mol Cell Biol,21:3995-4004,2001 ;Loureiro RM,等，Biochem Biophys Res Commun，326:455-465, 2005)。实验室研究表明抑制HER2能通过下调PI3K的活性继而下 调 VEGF 的水平（Wen XF,等，Oncogene, 25:6986-6996, 2006)。在临床乳腺癌患者中，VEGF 的水平与HER2的表达也呈正相关，而且高的VEGF水平往往预示着高的恶性程度和差的 临床治疗预期（Yang W,等，Cancer, 94:2855-2861，2002 ;Konecny GE,等，Clin Cancer Res,10:1706-1716, 2004.)。
[0007] 同时抑制HER2和VEGF可能会具有更好的抗肿瘤疗效。一些文献报道的动物实验 数据初步支持了这一策略。据报道，在接种BT-474肿瘤细胞造成的异种移植乳腺癌动物模 型中（Kodack D,等，Proc Natl Acad Sci, 109:E3119-3127, 2012)，联合应用曲妥珠单抗 和VEGF-Trap显示了较强的抗肿瘤作用，显示出了比曲妥珠单抗或者VEGF-Trap单独治疗 更强的抗肿瘤效果。另据报道，在接种BT-474肿瘤细胞造成的异种移植乳腺癌脑转移动物 模型中（Le XF，等，Cell Cycle，7:3747-3758, 2008)，联合应用曲妥珠单抗和抗VEGFR抗体 显示了比单独治疗更强的抗肿瘤转移作用。在一项2期临床实验中，联合应用曲妥珠单抗、 贝伐单抗和化药，在治疗HER2阳性的转移性乳腺癌上显示了一定疗效和一定前景（Martin M，等，Oncologist, 17:469-475, 2012)。
[0008] 本领域仍然需要将阻断HER2和VEGFR两种信号通路的功能片段融合起来使用，以 同时抑制HER2和VEGF，从而满足更好的抗肿瘤疗效的需求。


【发明内容】

[0009] 因此，本发明提供了同时阻断HER2和VEGFR两种信号通路的融合蛋白。
[0010] 因此，本发明的第一方面涉及一种融合蛋白，其包含一个表皮生长因子受体2靶 向抗体、一个血管内皮生长因子中和结构域。
[0011] 在一个实施方案中，所示融合蛋白还包含一条连接片段，VEGF中和结构域通过连 接片段连接到HER2靶向抗体的恒定区。
[0012] 在一个实施方案中，所述VEGF中和结构域包含人血管内皮生长因子受体l(Fltl) 第二免疫球蛋白样区和人血管内皮生长因子受体2 (Flkl)第三免疫球蛋白样区。
[0013] 在一个实施方案中，所述HER2靶向抗体是IgG，由两条重链和两条轻链组成。
[0014] 在一个实施方案中，所述连接片段由多个甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝 氨酸多肽链组成，在进一步的实施方案中，所述连接片段由Ser(Gly4Ser)3多肽链组成。
[0015] 在一个实施方案中，所述HER2靶向抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示， 或者是SEQ ID N0 :1序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基 酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或者是与SEQ ID N0:1序列具有至少 70%同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%,94%,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3%,99. 4%,99. 5 %,99. 6 % 同一性，HER2靶向抗体的重链、连接片段和VEGF中和结构域的氨基酸序列如SEQ ID N0 :3 所示，或者是SEQ ID NO :3序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或者是与SEQIDN0 :3序列具 有至少70%同一性并具有同等功能的氨基酸序列，如至少约75%、80%、85%、90%、91%、 92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4 %,99. 5 %, 99. 6%、99· 7%、99· 8% 同一性。
[0016] 在另一根实施方案中，本发明涉及一种蛋白，其包含在一个实施方案中下述氨基 酸序列：
[0017] a)如SEQ ID N0 :1所示的序列，或者是SEQ ID N0 :1所示的序列经替换、缺失、 添加一个或多个氨基酸形成的具有HER2靶向抗体的轻链功能的氨基酸序列，如2、3、4、5、 10、15、20、30、50个氨基酸残基，或者是与SEQIDN0:1所示的序列具有至少70%同一性并 具有HER2靶向抗体的轻链功能的氨基酸序列如至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93 %,94%,95%,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4% ,99. 5%,99. 6 % 同一'I"生，；和
[0018] b)如SEQ ID N0 :3所示的序列，或者是SEQ ID N0 :3所示的序列经替换、缺失、添 加一个或多个氨基酸形成的具有HER2靶向抗体的重链、连接片段和VEGF中和结构域功能 的氨基酸序列，如2、3、4、5、10、15、20、30、50个氨基酸残基，或者是与SEQIDN0 :3所示的 序列具有至少70%同一性并具有HER2靶向抗体的重链、连接片段和VEGF中和结构域功能 的氨基酸序列，，如至少约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99· 1%、99· 2%、99· 3%、99· 4%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8% 同一性
[0019] 其中，由a)和b)形成的蛋白具有同时阻断HER2和VEGFR信号通路的活性。
[0020] 本发明的第二方面涉及一种根据第一方面所述的融合蛋白的编码多核苷酸。
[0021] 在一个实施方案中，所述抗HER2轻链的核苷酸编码序列如SEQ ID N0 :2所示，所 述抗HER2重链-VEGFR1D2-VEGFR2D3的核苷酸编码序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0022] 本发明的第三方面涉及一种包含有效连接其中的如第二方面所述的多核苷酸的 重组载体。
[0023] 本发明的第四方面涉及一种转化或转染有如第三方面所述的重组载体的宿主细 胞。
[0024] 本发明的第五方面涉及一种生产多肽的方法，其包括在适宜的多肽表达条件下培 养第四方面所述的宿主细胞，并从细胞培养基中分离、纯化表达的多肽。
[0025] 本发明的第六方面涉及一种药物组合物，其包含如第一方面所述的融合多肽和药 学上可接受的载体。
[0026] 本发明的第七方面涉及一种治疗肿瘤疾病的方法，包含给予治疗有效剂量的如第 一方面所述的融合蛋白或如第五方面所述的药物组合物。
[0027] 本发明的第八方面涉及一种根据第一方面所述的融合蛋白或如第五方面所述的 药物组合物，其用于治疗肿瘤疾病。
[0028] 本发明的第九方面涉及一种根据第一方面所述的融合蛋白或如第五方面所述的 药物组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。
[0029] 本发明的实验结果表明，本发明的利用哺乳动物密码子偏好性优化后的融合蛋白 表达量高、稳定性强，能实现比组成该融合蛋白的单个功能单元所能实现的抗肿瘤效果更 强的抗肿瘤效果，即，实现了两个功能单元治疗效果的部分叠加效果。本领域技术人员知 晓，几个不同作用机理的药物联合使用或融合使用可能会出现拮抗、无关、累加或协同等不 同的效果，两种或更多种药物联合使用或融合使用到底呈现何种相互作用只能通过具体的 实验研究、付出大量劳动的情况下才能确定。虽然现有技术中存在组合使用抗HER2抗体和 抗VEGFR抗体治疗肿瘤的报道，但由于人类机体的复杂性，将单独的两种抗体成分组合使 用所获得的技术效果并不必然表明也能被两种抗体的活性单元的融合蛋白所获得。本发明 的融合蛋白为抗肿瘤治疗提供了一种治疗效果更佳优异的候选药物。同时，本发明的融合 蛋白与使用单功能的蛋白组合（例如抗HER2抗体和抗VEGF抗体）情况相比，本发明可降 低生产成本，简化研发和申报过程，节省研发时间，避免两种组分组合使用时可能存在的不 利的相互作用（如某种组分的存在可能导致另一种组分的药代动力学性质发生改变），并 减少临床给药体积和频率，提高（医生和患者的）顺从性，在肿瘤疾病的治疗上具有巨大的 应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0030] 图1. X0GC2-抗HER2-VEGFR1D2-VEGFR2D3表达载体的构建。重组双功能融合蛋白 表达载体不意图。
[0031] 图2.重组双功能融合蛋白的纯化流程。
[0032] 图3.重组双功能融合蛋白与HER2的结合。ELISA方法检测重组双功能融合蛋白 与HER2的结合。
[0033] 图4.重组双功能融合蛋白与VEGF的结合。ELISA方法检测重组双功能融合蛋白 与VEGF的结合。
[0034] 图5.重组双功能融合蛋白体外肿瘤生长抑制活性。重组双功能融合蛋白在体外 抑制BT-474、SK-BR-3和NCI-N87肿瘤细胞（A-C)的生长。
[0035] 图6.重组双功能融合蛋白的血管内皮细胞迁移抑制活性。重组双功能融合蛋白 抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的迁移。
[0036] 图7.重组双功能融合蛋白的药代动力学。为重组双功能融合蛋白分别在 5. 2nmol/kg和15. 5nmol/kg剂量下在小鼠体内的药时曲线。
[0037] 图8.本发明的重组双功能融合蛋白的结构示意图。

【具体实施方式】
[0038] 本发明的一个目的在于提供一种同时阻断HER2和VEGFR信号通路的双功能融合 蛋白，具体而言，本发明提供一种融合多肽，其包含一个表皮生长因子受体2(HER2)靶向 抗体、一个血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域。阻断HER2信号通路的功能片段与阻 断VEGFR信号通路的功能片段有效连接，保持其各自的空间结构并发挥其各自的生理活 性。所述阻断HER2信号通路的功能片段与阻断VEGFR信号通路的功能片段可以在不影响 其各自功能的情况下直接融合在一起，也可以在所述两条功能片段之间或末端加入其它序 列，如连接肽或有利于促进所述两条功能片段发挥其各自活性、或有利于引起其它生物学 效应，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用和补体依赖的细胞毒性性作用、或有利于提高 融合蛋白药代动力学性质、或有利于生产和纯化的其他序列如抗体的Fc片段。在一个实 施方式中，所述阻断VEGFR信号通路的功能片段是血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域 或其功能片段，本发明所用的术语"VEGF中和结构域或其功能片段"是指血管内皮生长因 子（vascular endothelial growth factor，VEFG)的中和结构域或其功能片段。术语"功 能片段"是指VEGF中和结构域发挥其功能如生理功能的部分。在一个实施方案中，所述阻 断HER2信号通路的功能片段是中和HER2活性的功能片段，在本发明中，术语"中和HER2 活性的功能片段"是指通过与HER2结合而失活或部分失活HER2生理功能的任何蛋白分 子。在进一步的实施方案中，所述中和HER2活性的功能片段是表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)革巴向抗体或其功能片段，在本发明中，术语 "HER2靶向抗体或其功能片段"是指靶向HER2的抗体或其功能片段，"靶向HER2的抗体"是 抗HER2的单克隆抗体，术语"功能片段"是指抗HER2抗体发挥其功能如生理功能的部分， 如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段（scFv)、Fab片段或F(ab'）2片段。在更进一 步的实施方案中，"靶向HER2的抗体"是完整的抗HER2单克隆抗体。在一个实施方案中， 表皮生长因子受体2 (HER2)靶向抗体与血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域有效连接，保 持其各自的空间结构并发挥其各自的生理活性。所述表皮生长因子受体2 (HER2)靶向抗体 与血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域可以在不影响其各自功能的情况下直接融合在一 起，也可以在其间加入其它间隔序列，如连接片段。
[0039] 本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述融合蛋白时所用限定语为"包含"， 但其并不意味着可以在所述融合蛋白序列中任意加入与其功能不相关的其他序列。在制备 复杂组成的融合蛋白时，为了保证融合蛋白各个组成成分的空间结构、生物活性，以及为了 将所述各种组分适当的融合在一起，或为了增强所述融合蛋白的抗水解能力，本领域技术 人员在制备所述融合蛋白时，会根据需要在各个组分之间或所述融合蛋白的两端加入一个 或多个额外的氨基酸残基，因此，如果用封闭式的表述来限定所述双功能融合蛋白将不能 真实地覆盖这些情形。
[0040] 在一个优选的实施方案中，本发明的融合蛋白包含一个表皮生长因子受体 2(HER2)靶向抗体、一个血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域和一个连接片段，VEGF中和 结构域通过连接片段连接到HER2靶向抗体的恒定区。所述表皮生长因子受体2 (HER2)靶 向抗体和血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域的氨基酸序列不是唯一的，其可以为任何 已知的表皮生长因子受体2 (HER2)靶向抗体和血管内皮生长因子（VEGF)中和结构域的氨 基酸序列。所述连接片段的氨基酸序列长度为1-25个氨基酸，在进一步的实施方案中，所 述连接肽的氨基酸序列长度为16个氨基酸。在一个实施方案中，所述连接片段由多个甘氨 酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸多肽链组成。在进一步的实施方案中，所述连接片 段由Ser(Gly4S er)3多肽链组成。本发明所用的连接片段并无特殊限制，只要其起到间隔 融合蛋白的两个组分，使各个组分能正确形成其各自的空间结构、发挥其生物活性即可。
[0041] 在一个实施方案中，所述VEGF中和结构域能够结合哺乳动物VEGF。
[0042] 在一个优选的实施方案中，所述VEGF中和结构域包含人血管内皮生长因子受体 l(Fltl)第二免疫球蛋白样区和人血管内皮生长因子受体2 (Flkl)第三免疫球蛋白样区。
[0043] 在一个实施方案中，所述HER2靶向抗体特异地结合哺乳动物HER2。
[0044] 在一个实施方案中，所述HER2靶向抗体是IgG，由两条重链和两条轻链组成。
[0045] 在一个特别优选的实施方案中，HER2靶向抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID N0 :1 所示，HER2靶向抗体的重链、连接片段和VEGF中和结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所 示，或如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :3所示的序列经替换、缺失、添加一个或多个氨基酸形 成的具有同等功能的氨基酸序列，如一个或几个氨基酸残基，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、 20、30、40、50个氨基酸残基，或与如SEQIDN0:1和SEQIDN0:3所示的序列具有至少70% 同一性并具有同等功能的氨基酸序列也包括在本发明的范围之内，例如具有至少80%、 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%, 99. 7%或99. 8%同一性并具有同等功能的氨基酸序列。例如，所述氨基酸序列中的一个或 多个氨基酸残基可以进行保守氨基酸的替换，如一个或几个氨基酸残基，如1、2、3、4、5、6、 8、9、10、15、20、30、40、50个氨基酸残基。氨基酸的保守氨基酸是本领域公知的。
[0046] 本发明使用的术语"同一性"具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知 测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时 具有阻断HER2和VEGFR的活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方 法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。
[0047] 在一个实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸，其包含编码如上所述的融合多肽 的核苷酸序列。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述核苷酸序列 中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、 15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。
[0048] 本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述编码基因时所用限定语为"包括"， 但其并不意味着可以在所述编码基因两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技 术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在所述编码基因的两端添加合适的限制性内 切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来 限定所述编码基因将不能真实地覆盖这些情形。
[0049] 本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中 的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、 15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。在一个实施方案中，本发明涉 及一种重组载体，其包含有效连接其中的如上所述的多核苷酸。所述重组载体为重组表达 载体，可以是原核表达载体也可以是真核表达载体，但优选真核表达载体，更优选用于哺乳 动物真核表达的重组表达载体。
[0050] 本发明所用的术语"有效连接"是指这样的连接方式，其中所述编码基因置于载体 的适当位置，使得所述编码基因正确地、顺利地复制、转录或表达。
[0051] 在一个实施方案中，本发明涉及一种宿主细胞，其转化或转染有如上所述的重组 载体，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。
[0052] 在一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞包含CH0细胞、HEK293细胞、NS0细胞 和SP 2/0细胞。
[0053] 在一个实施方案中，本发明涉及一种生产多肽的方法，其包括在适宜的多肽表达 条件下培养上述宿主细胞，并从细胞培养基中分离、纯化表达的多肽。在一个实施方案中， 所述纯化后的多肽的纯度为大于50 %，在进一步的实施方案中，大于60 %、65 %、70 %、 75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %、99· 5 %、99· 6 %、99· 7 %、99· 8 % 或 99. 9%。
[0054] 在一个实施方案中，所述真核表达载体为X0GC。
[0055] 在一个实施方案中，所述宿主细胞为HEK293-T和CH0。在一个实施方案中，本发明 涉及一种药物组合物，其包含如上所述的融合多肽和一种药学上可接受的载体。所述融合 蛋白可以是所述药物组合物的唯一活性成分，也可以是所述药物组合物活性成分之一，其 他活性成分为可以与所述融合蛋白组合使用的其他治疗剂。
[0056] 在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含单次给药的剂型、局部给药 的剂型和全身给药剂型。
[0057] 在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗肿瘤疾病的方法，包含给予治疗有效剂 量的如上所述的融合蛋白或药物组合物。在一个实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌、 胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、肾 癌和胰腺癌等，在进一步的实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌和胃癌。
[0058] 在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的融合蛋白或药物组合物，其用于治疗 肿瘤疾病。在一个实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结 直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌等，在进一步的实施 方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌和胃癌。
[0059] 在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤疾病的 药物中的用途。在一个实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺 癌、结直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌等，在进一步 的实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌和胃癌。
[0060] 本发明所用的术语"治疗有效量"是指在给药时，可以在受试者体内发挥药理作用 的剂量。"治疗有效量"可以由本领域技术人员根据患者的情况如年龄、体重、疾病状态等容 易地确定。
[0061] 本领域技术人员知晓，虽然本发明上述内容中列出了本发明所述的双功能融合蛋 白所能预防、治疗或改善的病状，但本发明的双功能融合蛋白所能处理的病状并不仅限于 上述列出的具体病状，任何可以通过同时阻断HER2和VEGFR两条信号通路而获得预防、治 疗或改善益处的病状都包括在本发明的保护范围之内。
[0062] 根据本发明的上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明的抗HER2-VEGFR 双功能融合蛋白与使用单功能的蛋白组合（例如抗HER2抗体和抗VEGF抗体）情况相比， 本发明可降低生产成本，简化研发和申报过程，节省研发时间，避免两种组分组合使用时可 能存在的不利的相互作用（如某种组分的存在可能导致另一种组分的药代动力学性质发 生改变），并减少临床给药体积和频率，提商（医生和患者的）顺从性。另外，体外实验表 明，本发明的抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白较抗HER2和VEGFR-Fc但功能蛋白组合应用表 现相似或更好的抗肿瘤活性。
[0063] 本发明的融合蛋白与现有技术如W02009088805中公开的Here印tin-VI14(靶 向Her2和VEGF)相比，它们的抗VEGF序列（其为MRD(模式识别结构域）序列）与本 发明中的阻断VEGF信号的序列是完全不同类型的序列，差异很大；与现有技术中公开的 aflibercept相比，aflibercept仅构成了本发明融合蛋白结构中的一个部分，本发明实施 例9的数据表明，本发明的融合蛋白比af 1 ibercept (BH1002)具有更好的抗肿瘤疗效；与现 有技术如W02012169822中公开的融合蛋白相比，本发明实施例4的数据证明本发明的融合 蛋白比W02012169822中公开的融合蛋白具有更好的稳定性。这些数据表明本发明所获得 的融合蛋白优于现有技术公开的具有类似功能的融合蛋白，成功地将阻断HER2和VEGFR两 种信号通路的功能片段融合起来，以更有利的形式同时抑制了 HER2和VEGF两种信号通路， 达到了更好的抗肿瘤效果。
[0064] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。 [0065] 下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均 可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准 抗体。
[0066] 实施例
[0067] 实施例1抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白表达载体的构建
[0068] 1.抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的氨基酸序列和相应的核酸序列
[0069] 抗HER2轻链的氨基酸序列（该序列来源于W01992022653)如SEQ ID N0 :1所示， 相应的根据哺乳动物细胞密码子偏好性优化的核苷酸编码序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0070] 抗 HER2 重链-VEGFR1D2-VEGFR2D3 (由抗 HER2 抗体重链、一个 Ser (Gly4Ser) 3 连 接序列、VEGFR1的D2结构域和VEGFR2的D3结构域连接组成的氨基酸序列，其中抗HER2 重链序列来源于W01992022653, VEGFR1D2-VEGFR2D3序列来源于US7070959)的氨基酸序 列如SEQ ID N0 :3所示，相应的根据哺乳动物细胞密码子偏好性优化的核苷酸编码序列如 SEQ ID N0 :4所示。其中，1-19位为信号肽序列，20-469位为抗HER2的重链序列，470-485 位为连接肽S (G4S) 3序列，486-690位为VEGFR1D2-VEGFR2D3序列。
[0071] 最终的抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的结构示意图如图8所示。
[0072] 2.表达载体的制备
[0073] 表达载体X0GC2在本公司的哺乳动物细胞表达载体X0GC(美国专利申请 US20100120089)基础上改造获得。具体地，以X0GC质粒为模板，使用ATAACGCGTTGACATTGAT TATTGACTAG(SEQ ID N0:5)和 ATAAGATCTGGGTCTCCCTATAGTGAGT(SEQ ID N0:6)为引物扩增 CMV 启动子，使用 ATAAGATCTTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC(SEQ ID N0:7)和 ATAACGCGTCTCAGAAGC CATAGAGCCCA(SEQ ID N0:8)为引物扩增BGH终止子。本申请中所有PCR反应均使用NEB公 司的Phusion超保真DNA聚合酶（F-530L)。扩增CMV启动子和BGH终止子的反应条件为： 94°C 2分钟；94°C 30秒，55°C 45秒，72°C 45秒，共35个循环；72°C 5分钟。将扩增得到的 序列经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将基因片段用NEB公司的Bglll (R0144L) 酶切，酶切反应体系为：1〇Χ缓冲液32μ l，BglII0. 5μ 1，基因片段3μ 1，H20 14. 5μ 1。酶 切体系于37°C条件下反应3小时。将酶切产物用NEB公司的T4DNA连接酶（M0202V)连接 (下同），反应体系为：1〇Χ连接酶缓冲液2μ 1，连接酶0. 5μ 1，CMV启动子3μ 1，BGH终止 子3μ 1，H20 11. 5μ 1。连接于室温反应12小时。获得一个CMV启动子-BGH终止子表达框， 在中间掺入有Bglll酶切位点。用NEB公司的Mlul (R0198V)酶切CMV启动子-BGH终止子 表达框和X0GC载体，酶切反应体系为：10X缓冲液32μ 1，Mlul 0. 5μ 1，基因片段或X0GC 载体3 μ 1，Η20 14. 5 μ 1。酶切体系于37°C条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系 为：1〇Χ连接酶缓冲液2μ 1，连接酶0. 5μ 1，CMV启动子-BGH终止子表达框5μ 1，X0GC载 体1 μ 1，H20 11. 5 μ 1。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5 α。获得 两个表达框串联的X0GC2表达载体。X0GC2载体的两个表达框用于分别表达抗HER2轻链和 抗 HER2 重链-VEGFR1D2-VEGFR2D3。
[0074] 3.抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白表达载体的构建
[0075] 抗HER2-VEGFR1D2-VEGFR2D3表达载体如图1所示。以带有抗HER2轻链编码序列 的PUC57-抗HER2LC(南京金斯瑞生物科技有限公司合成抗HER2轻链基因，该基因包含在 PUC57载体，序列如SEQ ID Ν0:2所示）为模板，通过常规PCR扩增抗HER2轻链的编码序 列。所用上游引物带有Hindlll酶切位点，序列为：CACAAGCTTGCCACCATGGGTTGGTCCTGCATTA TCCT(SEQ ID NO :9)。下游引物带有 EcoRI 酶切位点，序列为：CCGGAATTCTCAGCATTCGCCACGA TTGAAG(SEQ ID NO :10)。反应条件为：94°C 2 分钟；94°C 30 秒，55°C 45 秒，72°C 1 分钟，共 35个循环；72°C 5分钟。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与 真核表达载体X0GC用NEB公司的Hindlll (R0104L)和EcoRI (R0101L)酶切，酶切反应体系 为：10XEcoRI 缓冲液 2yl，HindIII 0.5yl，EcoRI 0·5μ1，基因片段或 XOGC 载体 3μ1， Η20 14μ1。酶切体系于37°C条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10Χ连接 酶缓冲液2μ1，连接酶0. 5μ1，基因片段5yl，X0GC载体1μ1，Η20 11.5μ1。连接于室温 反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5 α。PCR筛选阳性质粒X0GC-抗HER2LC并进 行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
[0076] 以带有抗 HER2 重链-VEGFR1D2-VEGFR2D3 编码序列的 pUC57-抗 HER2 重链-VEGFR1D2-VEGFR2D3 (南京金斯瑞生物科技有限公司合成抗HER2重 链-VEGFR1D2-VEGFR2D3基因，该基因包含在pUC57载体，序列如SEQ ID N0 :4所示）为模 板，通过常规PCR扩增抗HER2重链-VEGFR1D2-VEGFR2D3的编码序列。所用上游引物带有 Bglll 酶切位点，序列为：GAAGATCTGCCACCATGGGGTGGTCCTGTATCATC(SEQ ID N0:11)。下游 引物带有 Bglll 酶切位点，序列为：GAAGATCTTCACTTTTCGTGGACCCTCAC(SEQ ID N0:12)。反 应条件为：94°C 2分钟；94°C 30秒，55 °C 45秒，72 °C 2分钟，共35个循环；72 °C 5分钟。
[0077] 将扩增得到的序列经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与构建成 功的带有抗HER2轻链的X0GC-抗HER2LC质粒用NEB公司的Bglll (R0144L)酶切，酶切反 应体系为：1〇Χ缓冲液32μ 1，Bglll 0· 5μ 1，基因片段或X0GC-抗HER2LC质粒3μ 1，H20 14. 5 μ 1。酶切体系于37°C条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10X连接酶 缓冲液 2 μ 1，连接酶 0. 5 μ 1，抗 HER2 重链-VEGFR1D2-VEGFR2D35 μ 1，X0GC-抗 HER2LC 质粒 1μ 1，Η2011. 5μ 1。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5a。PCR筛选 阳性质粒X0GC2-抗HER2-VEGFR1D2-VEGFR2D3并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
[0078] 将阳性DH5 a /X0GC2-抗HER2-VEGFR1D2-VEGFR2D3接种至 1L LB/Amp 液体培养基， LB/Amp液体培养基组成为1 %蛋白胨（BD公司）、0. 5%酵母提取物（BD公司）、1 % NaCl (国 药集团化学试剂有限公司），于37°C、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天按照Qiagen质 粒提取试剂盒（EndoFree Plasmid Giga Kits)操作说明提取质粒用于293T细胞的转染。
[0079] 实施例2重组抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的表达
[0080] 1. HEK293-T细胞工厂的准备
[0081] 将生长状态良好，活力（活细胞比率，也可以写成"活率")95%以上的HEK293-T细 胞以1. 8X 107个接种量接种于十层细胞工厂（NUNC公司），用含10%胎牛血清（购自Gibco 公司）的DMEM培养基（购自Corning公司）培养，细胞工厂反复颠倒混匀后置于37°C、5% C02培养箱内培养48小时，细胞贴壁完全，密度达到80%，即可用于瞬时转染。
[0082] 2.细胞瞬时转染和细胞培养上清液的收集
[0083] 将 X0GC2-抗 HER2-VEGFR1D2-VEGFR2D3 质粒用 0· 22 μ m 滤膜过滤后，吸取 1330 μ g 质粒，加入到66ml无血清DMEM培养基。吸取2660 μ g转染试剂PEI (购自Sigma公司）加 入到等体积的DMEM培养基，混匀，将获得的PEI混合液倒入含有质粒的DMEM中，混匀。室 温静置15分钟。将含有质粒与PEI的混合物加入到1. 3升的无血清DMEM培养基内，充分 混匀后缓慢加入细胞工厂内。将细胞工厂置于37°〇、5%0)2培养箱内培养。4小时后，力口 入266ml Cell Boost 5(购自Thermo Fisher公司），混勻后继续培养6天，7000rpm条件 下离心20分钟收集上清液用于目的蛋白的纯化。上清液进行ELISA浓度测定，表达水平为 9. lmg/L〇
[0084] 实施例3重组抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的纯化
[0085] 重组双功能融合蛋白的纯化流程如图2所示。
[0086] 1.细胞表达发酵液的预处理
[0087] 将收获的细胞培养上清液7000rpm离心20min去除沉淀。细胞发酵液上清液经 0. 2μπι滤膜过滤后，10K膜包超滤浓缩并置换成20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠 ，pH 7.4。 在应用层析柱纯化之前以〇. 2 μ m滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤的操作在4°C下进行。
[0088] 2. rProtein A亲和色谱纯化
[0089] 采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统（GE Healthcare)以及亲和色谱柱 rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I. D.，15ml，GE Healthcare)于 4°C下进行纯化。 首先以流动相A即20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH7. 4溶液平衡色谱柱，在基线稳定 后将预处理后的细胞发酵液上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行 冲洗，然后以不同缓冲液进行洗脱。首先以流动相B1冲洗5个柱体积；接着以流动相B2冲 洗5个柱体积；然后以流动相B3洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；最后以流动 相B4冲洗5个柱体积。以上洗脱步骤流速都为5ml/min。流动相B1为在流动相A中添加 〇. 5M精氨酸而成；流动相B2为20mM NaAc，pH4. 5 ;流动相B3为100mM柠檬酸，pH3. 0 ;流动 相B4为100mM柠檬酸，pH 2. 2。收集标示的洗脱峰并通过滴加1M NaAc将pH调整至5. 0。
[0090] 3.蛋白的离子交换色谱纯化
[0091] 采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统（GE Healthcare)以及强阴离子交换色 谱柱HiTrap Q Sepharose FF(5ml，GE Healthcare)于4°C下进行纯化。首先以流动相A即 20mM NaAc (pH 5.0)溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将上一步实验中收集并调整pH后的洗 脱液进行上样，流速为5ml/min，收集流穿峰即为目的蛋白峰。上样完毕后应用100%流动 相B进行等度洗脱，流速为5ml/min。流动相B为在流动相A中添加1M氯化钠而成。收集 流穿峰，并用孔径为10K的超滤管浓缩，用于凝胶排阻层析色谱的纯化。
[0092] 4.蛋白的凝胶排阻层析色谱纯化
[0093] 采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统（GE Healthcare)以及凝胶排阻色谱填 料Superdex? 200 (105ml，16/60, GE Healthcare)于4°C下进行纯化。上样体积小于色谱 柱体积的1 %，流动相为PBS，流速为lml/min。收集标示组分，用10K的超滤管浓缩，在超净 工作台用0. 2μπι滤膜无菌过滤，然后用紫外分光光度计（280nm)进行定量，并用SEC-HPLC 进行纯度分析。结果表明该重组抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的纯度为至少99. 9%。
[0094] 实施例4抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的稳定性研究
[0095] 重复冻融实验操作如下：将lmg/mL所述抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白分装于3 个小管中，每管不少于20 μ g (即每次分析用量），置于-80°C冰箱3小时以上。取出后，常 温融化。对相应小管依次进行第2次、第3次重复冻融。取20 μ g样品进行高效排阻液相 色谱（SEC-HPLC)分离。
[0096] 不同温度实验操作如下：将充分密封的样品（lmg/mL)放置于4°C (±2°C )、 25°C (±2°C )和40°C恒温箱（BINDER KBF240)，在相应时间点（基线（第0天）、第2天、 第7天、第14天、第28天）取20 μ g样品进行SEC-HPLC分离。
[0097] 上述 SEC-HPLC 条件如下：（1)排阻色谱柱：TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience)，5 μ m，7. 8mmX 30cm ; (2)流动相：5mM PBS, 150mM NaCl，pH 6· 7 ; (3)流 速：0. 6mL/min ; (4)紫外检测波长：280nm ; (5)采集时间：30min。所用仪器是Agilent 1200Infinity色谱仪，利用Agilent ChemStation记录图谱并计算剩余单体的比例。
[0098] 结果表明，冻融试验（未冻融、冻融1次、冻融2次和冻融3次后，剩余单体比例均 为100. 0% )和40°C试验条件（基线、第2天、第7天、第14天后的剩余单体比例为100. 0%， 第28天后的比例是99. 3% )均不会引起所述抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白多聚体的形 成，故认为所述抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白具备很好的稳定性。
[0099] 本实施例还构建了 W02012169822中公开的sc4D5-VEGF-trap(Fc) 1融合蛋白，然 后比较了它与本发明的抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白的稳定性。本发明的结果表明，在 40°C实验条件下， Sc4D5-VEGF-trap(Fc) 1融合蛋白在处理后第0天、第2天、第7天、第14 天和第28天完整蛋白所占相对比例分别为100%、99. 9%、74. 6%、71. 0%和65. 5%。因此 本发明所述的抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白比sc4D5-VEGF-trap (Fc) 1融合蛋白具有更好 的稳定性。
[0100] 实施例5结合亲和力测定
[0101] 1. HER2结合亲和力测定
[0102] HER2结合亲和力测定实验用于测定抗HER2-VEGFR双功能融合蛋白（BH1007)与其 抗原HER2的结合能力。简要的说，人HER2蛋白包被于ELISA板上。为了防止非特异性结 合，封闭该板。然后加入样品孵育，洗涤该板。与HER2结合的样品，再与加入的辣根过氧化 物酶标记的抗人IgG抗体结合。最后使用比色底物TMB进行显色。
[0103] 该方法具体实施过程如下。用pH = 9. 6的碳酸盐缓冲溶液包被人重组HER2蛋 白（Sino Biological,货号：10004-H08H)于96孔高吸附酶标板上，HER2浓度为lyg/mL， 100以1^每孔，包被在41：过夜进行。？851'(518111 &，货号：？-3563)洗涤该板5次。用含1% BSA的PBST封闭该板，300 μ L每孔，将板子置于25°C孵育至少1小时。PBST洗涤该板5次。 加入稀释在含1 % BSA的PBST里的特定浓度的BH1007或者对照，100 μ L每孔，将板子置于 25°C孵育1小时。PBST洗涤该板5次。然后加入1:3000稀释在含1% BSA的PBST里的辣 根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（Abeam，货号：Ab7153)，100 μ L每孔，将板子置于25°C 孵育1小时。PBST洗涤该板5次。加入比色底物TMB(BD OptEIA，货号：555214)，100yL 每孔，室温显色10分钟。加入1M H2S04,100 μ L每孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处 的吸光度。
[0104] 结果如图3所示，BH1007具有与其抗原HER2结合的高亲和力，略弱于BH0901 (赫 赛汀（Here 印 tin))。而 BH1002(VEGFR1D2-VEGFR2D3-Fc)不与 HER2 结合。
[0105] 2. VEGF结合亲和力测定
[0106] VEGF结合亲和力测定实验用于测定重组融合蛋白BH1007与其配体VEGF的结合 能力。简要的说，人VEGF165蛋白包被于ELISA板上。为了防止非特异性结合，封闭该板。 然后加入样品孵育，洗涤该板。与VEGF结合的样品再与加入的辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG抗体结合。最后使用比色底物TMB进行显色。
[0107] 该方法具体实施过程如下。用pH = 9. 6的碳酸盐缓冲溶液包被人重组VEGF165蛋 白（Sino Biological,货号：11066-HNAB)于96孔高吸附酶标板上，VEGF165浓度为lyg/ 11^，10(^1^每孔，包被在41：过夜进行。？851'(518111 &，货号：？-3563)洗涤该板5次。用含 1 % BSA的PBST封闭该板，300 μ L每孔，将板子置于25°C孵育至少1小时。PBST洗涤该板 5次。加入稀释在含1 % BSA的PBST里的特定浓度的BH1007或者对照，100 μ L每孔，将板 子置于25°C孵育1小时。PBST洗涤该板5次。然后加入1:3000稀释在含1% BSA的PBST 里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（Abeam，货号：Ab7153)，100 μ L每孔，将板子置 于25°C孵育1小时。PBST洗涤该板5次。加入比色底物TMB(BDOptEIA，货号：555214)， 100 μ L每孔，室温显色10分钟。加入1M H2S04,100 μ L每孔，终止显色。在酶标仪上读取 450nm处的吸光度。
[0108] 结果如图4所示，BH1007具有与其配体VEGF结合的高亲和力，略弱于 BH1002(VEGFR1D2-VEGFR2D3-FC)。
[0109] 实施例6肿瘤细胞生长抑制活性实验
[0110] 人乳腺癌细胞株BT-474、SK-BR-3和人胃癌细胞株NC1-N87均从ATCC获得。所有 细胞均在添加有10%的胎牛血清（Gibco,货号：10099)的RPMI-1640培养基（Gibco,货 号：22400)中培养。置于37°C、5% C02的细胞孵箱中，每周传代两次。
[0111] 生长抑制活性检测方法具体实施过程如下。将BT-474细胞、SK-BR-3细胞和 NC1-N87细胞重悬在完全培养基中，接种到96孔细胞培养板内，100 μ L每孔，每孔分别 3000、5000、10000个细胞。细胞在孵箱中过夜生长使贴壁。然后，吸出细胞上清，加入含1 % 胎牛血清的培养基，培养基中含或者不含待测样品ΒΗ1007或者对照。继续在孵箱中培养72 小时。然后活细胞通过 MTS(CellTiter96Aqueous One Solution，Promega,货号：G358B) 法测定。在孵育终点，向细胞培养板的每个孔中加入20yL CellTiter96Aque〇uS One Solution。细胞培养板在孵箱中孵育2-3个小时，然后在酶标仪上读取490nm处的吸光度。 实验均重复三次。
[0112] 结果如图5所示，BH1007具有显著抑制BT-474细胞、SK-BR-3细胞和NC1-N87细 胞生长的活性（A-C)，其抗恶性细胞增殖活性强于或者类似于BH0901 (赫赛汀）、BH0901 (赫 赛汀）+BH1002 (VEGFR1D2-VEGFR2D3-FC)。
[0113] 实施例7血管内皮细胞迁移抑制活性实验
[0114] 人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从PromoCell (货号：C-12203)获得。HUVEC细胞 在其专用培养基EGM-2(PromoCell，货号：C-22011)中培养，培养基中含血清以及多种血管 内皮生长因子；此培养基的基础培养基为EBM-2,不含血清和血管内皮生长因子。细胞置于 37°C、5% C02的细胞孵箱中，每周传代两次。
[0115] HUVEC的迁移抑制活性的检测采用了改进的Boyden chamber迁移测定法，具体说 是采用了 24孔Transwell系统（Corning,货号：3422)。该方法是一种经典的细胞迁移检 测方法。在上室中接种细胞悬液，在下室中放置含有迁移诱导剂的培养基，上下室由一层有 一定孔径大小的膜隔开。此方法可以快速的检测细胞对迁移诱导剂或者迁移抑制剂的反 应，检测到迁移的净细胞数。
[0116] 迁移抑制活性检测方法具体实施过程如下。空白EBM-2过夜饥饿HUVEC细胞。然 后，用EBM-2重悬HUVEC，接种此细胞悬液于Transwell上室中，100yL每孔，每孔10 5细 胞，上室含有或者不含BH10待测样品。将含有0.2%胎牛血清和10ng/mL人重组VEGF165 蛋白（Sino Biological,货号：11066-HNAB)的EBM-2培养基或者空白EMB-2培养基加入 Transwell下室中，600 μ L每孔。然后将24孔Transwell系统放入37°C、5% C02的细胞孵 箱中孵育4个小时使得细胞迁移。孵育完成后，用4%的多聚甲醛在室温下固定细胞15分 钟，然后用〇. 5%的结晶紫在室温下染色细胞30分钟。用双蒸水漂洗Transwell，去掉其浮 色。Transwell膜上表面的细胞随即被棉签擦掉，膜下表面的细胞在显微镜下观测，选取近 孔中央的4个视野（X 100放大）计数迁移的细胞。统计采用One-way ANOVA。
[0117] 结果如图6所示，未处理组中的HUVEC细胞在血清和VEGF的刺激下，大量的迁 移到Transwe 11膜下表面。BH1007处理HUVEC细胞则可以抑制这种迁移，而且随着浓 度的增加，这种抑制作用也显著增强，显示出了浓度依赖性。此种抑制具有统计学意义。 BH1007的抗血管内皮细胞迁移活性跟BH1002 (VEGFR1D2-VEGFR2D3-Fc)、BH0901 (赫赛 汀）+BH1002(VEGFRlD2-VEGFR2D3_Fc)类似。
[0118] 实施例8小鼠体内的药代动力学研究
[0119] 本实施例检测了 BH1007在小鼠体内的药代动力学情况。
[0120] 实验材料选用雌性BALB/c小鼠，8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。 小鼠适应环境一周后，随机分为2组，分别按lmg/kg、3mg/kg的剂量给予BH1007,静脉注 射，单次给药。在〇点，给药后5分钟、15分钟、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、72 小时、96小时、120小时、144小时、192小时、240小时眼眶采血（每只小鼠的采血点都为2 次），不予抗凝，室温放置血样30分钟，待凝血后，3000rpm离心5分钟，得到的血清样品冷 冻于-80°C保存，待测。
[0121] ELISA测定血清中BH1007的浓度。简要的说，用pH = 9. 6的碳酸盐缓冲溶液包 被人重组HER2蛋白于高吸附酶标板上，PBST洗涤。为了防止非特异性结合，用含5%脱脂 奶粉的PBST封闭该板，PBST洗涤。然后加入用含10%混合小鼠血清、1% BSA的PBST稀释 的待测血清样品孵育，251：，1小时，？851'洗涤该板。加入稀释于含5(%脱脂奶粉的？851'中 的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，25°C，1小时，PBST洗涤该板。最后使用比色底物 TMB进行显色，室温显色10分钟。加入1M H2S04，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸 光度。
[0122] 结果如图 7 所示，BH1007 在 5. 2nmol/kg(lmg/kg)、15· 5nmol/kg(3mg/kg)剂量下 的半衰期T1/2分别为48. 98小时、65. 65小时；药时曲线下面积AUC分别为2916. 64nM. hr、 5406. 41nM. hr ;达峰时间Tmax均为5分钟；达峰浓度Cmax分别为45. 36nM、199. 70nM ;表观 分布容积 Vd 分别为(λ 13L/kg、0. 27L/Kg ;清除率 CL 分别为(λ 0018L/hr/kg、0. 0029L/hr/ kg ;平均驻留时间MRT分别为111. 22小时、101. 37小时。
[0123] 实施例9小鼠体内抗肿瘤药效学研究
[0124] 实验材料选用雌性N0D/SCID小鼠，8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限 公司。小鼠适应环境一周后，右侧背部皮下埋入0. 36毫克60天持续释放17 β -雌二 醇药片（Innovative research of America,货号：SE121)，1天后，将悬于磷酸盐缓冲 液PBS中的lxlO7人乳腺癌细胞BT474与基质胶（BD biosciences，货号：354234)以 1:1比例混合（体积比），然后注入小鼠右侧乳腺脂肪垫。每2-3天用游标卡尺测量肿瘤 的生长情况。肿瘤体积以如下公式计算：肿瘤体积=l/2x长X宽X宽。当肿瘤体积达 至IJ 100至200立方毫米时将小鼠随机分组。分别接受磷酸盐缓冲液（对照组）、赫塞汀、 BH1002 (VEGFR1D2-VEGFR2D3-FC)、赫塞汀联合 BH1002 (VEGFR1D2-VEGFR2D3-FC)和 BH1007 静脉注射给药。每周给2次，连续给4周。每2-3天观察肿瘤生长，测量肿瘤体积。结果显 示BH1007表现出比赫塞汀，BH1002和赫塞汀联合BH1002更好的抗肿瘤疗效。
【权利要求】
1. 一种蛋白，其包含下述氨基酸序列： a) 如SEQ ID NO :1所示的序列，或者是SEQ ID NO :1所示的序列经替换、缺失、添加一 个或多个氨基酸形成的具有HER2靶向抗体的轻链功能的氨基酸序列，或者是与SEQ ID NO: 1所示的序列具有至少70%同一性并具有HER2靶向抗体的轻链功能的氨基酸序列；和 b) 如SEQ ID N0:3所示的序列，或者是SEQ ID N0:3所示的序列经替换、缺失、添加一 个或多个氨基酸形成的具有HER2靶向抗体的重链、连接片段和VEGF中和结构域功能的氨 基酸序列，或者是与SEQ ID NO :3所示的序列具有至少70%同一性并具有HER2靶向抗体 的重链、连接片段和VEGF中和结构域功能的氨基酸序列， 其中，由a)和b)形成的蛋白具有同时阻断HER2和VEGFR信号通路的活性。
2. -种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的蛋白。
3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于a)的核苷酸编码序列如SEQ ID NO: 2所示，b)的核苷酸编码序列如SEQ ID NO :4所示。
4. 一种重组载体，其包含有效连接其中的如权利要求2或3所述的多核苷酸。
5. -种宿主细胞，其转化或转染有如权利要求4所述的重组载体。
6. -种生产多肽的方法，其包括在适宜的多肽表达条件下培养权利要求5所述的宿主 细胞，并从细胞培养基中分离、纯化表达的多肽。
7. -种药物组合物，其包含如权利要求1所述的蛋白和药学上可接受的载体。
8. -种根据权利要求1所述的蛋白或如权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗 肿瘤疾病的药物中的用途。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的蛋白或药物组合物用于制备治疗一 种或多种下述疾病的药物：乳腺癌、胃癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、前 列腺癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌。
10. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的蛋白或药物组合物用于制备治疗 乳腺癌和/或胃癌的药物。
【文档编号】A61P35/00GK104193828SQ201410460595
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】刘家望, 张笑岩, 杨亚平, 李莹, 陈国强, 张磊, 车美英 申请人:北京韩美药品有限公司