针对人血管生成素-2的高亲和力人抗体的制作方法

针对人血管生成素-2的高亲和力人抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了结合血管生成素-2(Ang-2)的抗体及其使用方法。根据本发明的某些实施方案，所述抗体是结合人Ang-2的全人抗体。本发明的抗体特别用于治疗与一种或多种Ang-2生物学活性(包括血管生成)相关的病或疾病。
【专利说明】针对人血管生成素-2的高亲和力人抗体
[0001] 本申请为2010年7月27日提交的、发明名称为"针对人血管生成素-2的高亲和 力人抗体"的PCT申请PCT/US2010/043295的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的 日期为2012年3月28日，申请号为201080043266. 4。 发明领域
[0002] 本发明涉及特异性针对人血管生成素-2(angiopoietin_2) (Ang-2)的抗体，及其 抗原结合片段。
[0003] 背景
[0004] 血管生成是形成新血管的生物学过程。异常的血管生成与包括例如增殖性视网膜 病变、类风湿性关节炎和银屑病的若干疾病病症相关。另外，众所周知血管生成对肿瘤生 长和维持是关键的。血管生成素-2 (Ang-2)是Tie-2受体（Tie-2)的配体，并已显示在血 管生成中起作用。Ang-2在本领域中又被称为Tie-2配体（US 5, 643, 755 ;Yancopoulos等 人，2000, Nature407:242-248)。
[0005] 在 US 6, 166, 185 ;7, 521，053 ;7, 205, 275 ;2006/0018909 和 2006/0246071 中提及 结合Ang-2的抗体和其他肽抑制剂。在本领域中需要可用于治疗由血管生成导致的或恶化 的疾病和病症的新的Ang-2调节剂，包括Ang-2抗体。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明提供了结合人Ang-2的人抗体。鉴于多种证据和调查，本
【发明者】意识到需 要不结合或拮抗相关分子Ang-I的Ang-2抑制剂。例如，以前的研究已证明或提示Ang-I 在止血（见，例如 Li 等人，2001，Thrombosis and Haemostasis 85:191-374)和保护成 人维管结构免于血楽渗漏（见，例如Thurston等人，2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston等人，1999, Science 286:2511-2514)中的有益作用。因此，本
【发明者】意识到，在 某些抗血管生成的治疗状况下，保存Ang-I活性可能是有益的。因此，本发明提供了特异性 结合Ang-2但基本上不结合Ang-I的抗体。本发明也包括阻碍Ang-2和其受体Tie-2之间 的相互作用但基本上不阻碍Ang-I和Tie-2之间的相互作用的抗体。本发明的抗体在抑制 Ang-2的促血管生成活性和治疗由血管生成过程导致的或与其相关的疾病和病症中特别有 用。
[0008] 本发明的抗体可为全长的（例如，IgGl或IgG4抗体）或仅包含抗原结合部分（例 如，Fab, F(ab'）2或scFv片段），并可经修饰以影响功能，例如消除残留的效应功能。
[0009] 在一个实施方案中，本发明包含抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的 抗原结合片段包含具有选自 SEQ ID NO:2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114 ，118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262 ，266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 41 0, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 514,和 516 的氨基酸序列，或 与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列的重 链可变区（HCVR)。在一个实施方案中，抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ ID NO: 18, 42, 66, 162, 210, 266,和 434 的氨基酸序列的 HCVR。
[0010] 在一个实施方案中，本发明包含抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体 的抗原结合片段包含具有选自 SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 10 6, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250， 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404 ，408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500,和 504 的氨基酸序列，或与其 具有至少90 %、至少95%、至少98 %或至少99%序列同一性的基本相似的序列的轻链 可变区（LCVR)。在一个实施方案中，抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ ID NO:20, 44, 68, 164, 212, 274,和 442 的氨基酸序列的 LCVR。
[0011] 在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:2/10, 18/20， 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 11 8/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192 ，194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/ 274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 3 54/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/42 8, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500，和 502/504的HCVR和LCVR (HCVR/LCVR)氨基酸序列对。在一个实施方案中，抗体或其片段包含 选自氨基酸序列对SEQ ID N0:18/20, 42/44, 66/68, 162/164,210/212, 266/274,和434/442 的 HCVR 和 LCVR。
[0012] 在下一个方面，本发明提供了抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗 原结合片段包含具有选自 SEQ ID NO:8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 29 6, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488,和512的氨基酸序列，或与其具有至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列的重链⑶R3(HCDR3)结构域；和 选自 SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400 ，424, 448, 472,和496,或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性 的基本相似的序列的轻链CDR3 (LCDR3)结构域。
[0013] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含选自SEQ ID N0:8/16, 32/40, 5 6/64, 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 2 96/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472，和 488/496 的 HCDR3/IXDR3氨基酸序列对。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含选自SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 152/160, 200/208, 272/280,和 440/448 的 HCDR3/LCDR3 氨基酸序列 对。具有这些HCDR3/LCDR3对的抗Ang-2抗体的非限制性实例是分别名为H1H685, H1H690 ，H1H691, H1H696, H1H706, H1M724,和 H2M744 的抗体。
[0014] 在另外的实施方案中，本发明包含抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含具有 选自 SEQ ID NO:4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388， 412, 436, 460, 484,和508的氨基酸序列，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至 少99%序列同一性的基本相似的序列的HCDRl结构域；具有选自SEQ ID N0:6, 30, 54, 78， 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486，和 510 的 氨基酸序列，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相 似的序列的重链 CDR2(HCDR2)结构域；具有选自 SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 18 0, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468,和 492 的氨基酸序列，或与其具 有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列的IXDRl结构 域；和具有选自 SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 35 0, 374, 398, 422, 446, 470的氨基酸序列，或与其具有至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少 99%序列同一性的基本相似的序列的LCDR2结构域。
[0015] 本发明的某些非限制性代表性抗体和抗原结合片段分别包含选自⑴SEQ ID N0:4,6,8，12，14 和 16(e.g.，HlH685) ;(ii)SEQ ID N0:28,30,32,36,38 和40(6· g.，HlH690) ;(iii)SEQ ID N0:52,54,56,60,62 和 64(e.g.，HlH691) ;(iv)SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 和 160 (e.g.，HlH696); (V) SEQ ID NO: 196, 198, 200, 204, 206 和 208 (e.g.，HlH706) ;(vi)SEQ ID N0:268,270,272,276,278 和 280 (e. g.，HlM724);和（vii)SEQ ID N0:436,438,440,444,446 和 448(e.g.，H2M744)的 HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 和 LCDR3 结构域。
[0016] 在相关的实施方案中，本发明包含特异性结合Ang-2的抗体或抗体的抗原结合 片段，其中抗体或片段包含重链和轻链⑶R结构域（即⑶R1，⑶R2和⑶R3)，其被包含在 选自 SEQ ID NO:2/10, 18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/82,90 /92, 94/96, 98/106,114/116,118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166 /168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240 ，242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314 /322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394 ,402/404,406/408,410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474 /476, 478/480, 482/490, 498/500,和502/504的重链和轻链可变结构域序列中。在一个实 施方案中，抗体或其片段包含CDR序列，其被包含在选自氨基酸序列对SEQ ID NO :18/20,4 2/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274,和 434/442 的 HCVR 和 LCVR 中。
[0017] 在另一个方面，本发明提供了编码抗Ang-2抗体或其片段的核酸分子。本发明也 包括携带本发明的核酸的重组表达载体，和已引入这样的载体的宿主细胞，以及通过在允 许抗体产生的条件下培养宿主细胞，并回收产生的抗体从而生产抗体的方法。
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含由选自 SEQ ID NO: 1，17, 21，25, 41，45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121，137, 141，145, 161，1 65, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241，257, 261，265, 281，285, 289, 305, 309, 31 3, 329, 333, 337, 353, 357, 361，377, 381，385, 401，405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 47 3, 477, 481，497, 501，505, 513,和515的核酸序列，或与其具有至少90%、至少95%、至少 98%或至少99%同一性的基本相同的序列编码的HCVR。在一个实施方案中，抗体或其片段 包含由选自SEQ ID NO: 17, 41，65, 161，209, 265,和433的核酸序列编码的HCVR。
[0019] 在一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含由选自 SEQ ID N0:9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71，81，91，95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163， 167, 177, 187, 191，201，211，215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311，3 21，331，335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431，441，451，455, 465, 4 75, 479, 489, 499,和503的核酸序列，或与其具有至少90%、至少95 %、至少98 %或至少 99%同一'丨生的基本相同的序列编码的LCVR。在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选自 SEQ ID NO: 19, 43, 67, 163, 211，273,和 441 的核酸序列编码的 LCVR。
[0020] 在一个实施方案中，本发明提供了抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体 的抗原结合片段包含由选自 SEQ ID N0:7, 31，55, 79, 103, 127, 151，175, 199, 223, 247, 271 ，295, 319, 343, 367, 391，415, 439, 463, 487,和 511 的核苷酸序列，或与其具有至少 90%、 至少95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列编码的HCDR3结构域；和由选自 SEQ IDN0:15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471，和495的核苷酸序列，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同 一性的基本相同的序列编码的LCDR3结构域。在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选 自 SEQ ID NO: 7/15, 31/39, 55/63, 151/159, 199/207, 271/279,和 439/447 的核酸序列对编 码的HCDR3和IXDR3序列。
[0021] 在另外的实施方案中，抗体或其片段还包含：由选自SEQ ID N0:3, 27, 51，75, 99, 1 23, 147, 171，195, 219, 243, 267, 291，315, 339, 363, 387, 411，435, 459, 483,和 507 的核苷酸 序列，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列编 码的 HCDRl 结构域；由选自 SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101，125, 149, 173, 197, 221，245, 269, 2 93, 317, 341，365, 389, 413, 437, 461，485,和509的核苷酸序列，或与其具有至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列编码的HCDR2结构域；由选自SEQ ID NO: 11，35, 59, 83, 107, 131，155, 179, 203, 227, 251，275, 299, 323, 347, 371，395, 419, 443, 46 7,和491的核苷酸序列，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的 基本相同的序列编码的LCDRl结构域；和由选自SEQ ID NO: 13, 37, 61，85, 109, 133, 157, 18 1，205, 229, 253, 277, 301，325, 349, 373, 397, 421，445, 469,和 493 的核苷酸序列，或与其具 有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列编码的IXDR2结构 域。
[0022] 在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO: 17和19 ;SEQ ID N0:41 和43;SEQIDN0:65和67;SEQIDN0:161和163;SEQIDN0:209 和211;SEQIDN0:265 和273 ;或SEQ ID NO: 433和441的核酸序列编码的重链和轻链⑶R序列。
[0023] 本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗Ang-2抗体。在一些应用中，去除不理想 的糖基化位点的修饰可能是有用的。例如，本发明包括本文陈述的任意抗体的修饰形式， 其中修饰形式缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分，例如以提高抗体依赖的细胞毒性（ADCC) 功能（见Shield等人（2002) JBC 277:26733)。在其他应用中，可进行半乳糖基化的修饰以 修饰补体依赖的细胞毒性（CDC)。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了包含特异性结合Ang-2的重组人抗体或其片段的药 物组合物和可药用的载体或赋形剂。在相关的方面，本发明涉及由Ang-2抑制剂和第二种 治疗剂的组合的组合物。在一个实施方案中，Ang-2抑制剂是抗体或其片段。在一个实施方 案中，第二种治疗剂是与Ang-2抑制剂有利组合的任意试剂。可与Ang-2抑制剂有利组合 的代表性试剂包括，但不限于，任何抑制或减少血管生成的试剂，其他癌症治疗剂，抗炎剂， 细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，抗造血因子，非留体抗炎药物（NSAID)，抗病毒剂和抗生 素。
[0025] 在另一个方面，本发明提供了使用本发明的抗Ang-2抗体或抗体的抗原结合部分 抑制Ang-2活性的方法，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗 体的抗原结合片段的药物组合物。治疗的疾病是通过去除、抑制或减少Ang-2活性改善、减 轻、抑制或预防的任意疾病或病症。优选地，本发明的抗Ang-2抗体或抗体片段在治疗由血 管生成过程导致的、与其相关的或通过其持续的任意病或病症中有用。在本发明的某些实 施方案中，抗Ang-2抗体或其抗原结合部分在治疗癌症中有用。在癌症治疗的情况下，本发 明的抗Ang-2抗体或其抗原结合部分可单独施用或与其他抗癌治疗抗体、化学治疗剂和/ 或放射治疗组合施用。在本发明的其他实施方案中，抗Ang-2抗体或其抗原结合片段在治 疗一种多种眼部疾病，例如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等和/或一种或多种 炎症或传染性疾病中有用。
[0026] 在检阅了随后的详细描述后，其他实施方案将变得显而易见。
[0027] 附图简述
[0028] 图1是人Ang-2的最后88个C端氨基酸（SEQ ID NO: 518的残基409至496)与 人Ang-1(SEQ ID N0:531)的相应氨基酸序列的比对。用白色文本和黑色阴影指示hAng-1 和hAng-2之间有差异的残基。星号（*)指示通过晶体结构分析显示与人Tie-2相互作用 的 hAng-2 的氨基酸。见 Barton 等人，Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (2006)。三角形 (▲)指示在hAng-2和hAng-Ι之间有差异的与Tie-2相互作用的氨基酸的位置。
[0029] 图2(图A-C)描述了蛋白质印迹的结果，其说明Ang-2结合分子抑制或无法抑制 Ang-I诱导的Tie-2磷酸化的程度。
[0030] 图3是实施例13的Ang-2FD-mFC点突变结合实验的总结，其显示了相对检测的多 种抗体和肽抗体（peptibody)的野生型，导致解离T1/2减少超过5倍的氨基酸变化（用实 心圆?描述）。
[0031] 发明详述
[0032] 在描述本发明之前，应该理解，本发明并非局限于所描述的具体方法和实验条件， 因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案 的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。
[0033] 除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语将具有与本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的相同含义。如本文使用的，术语"约"当在有关特定陈述的数值时使用 时，指数值与陈述值可有不超过1%的改变。例如，如本文使用的，措辞"约100"包括99和 101和所有在中间的数值（例如99. 1，99. 2, 99. 3, 99. 4等）。
[0034] 尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之 实施或试验，但现将描述的是首选的方法和材料。
[0035] 定义
[0036] 如本文使用的，除非被指定为来自非人物种（例如"小鼠 Ang_2"，"猴Ang-2"等）， 术语"血管生成素-2"或"Ang-2"指人Ang-2或其生物活性片段（例如能够在体外或体内 诱导血管生成的Ang-2蛋白的片段）。人Ang-2由SEQ ID NO: 517中所示的核酸序列编码 并具有SEQ ID N0:518的氨基酸序列。小鼠和猴Ang-2蛋白的氨基酸序列可从NCBI蛋白 质序列数据库中分别以NP_031452和BAE89705. 1的登记号得到。
[0037] 除非被指定为来自非人物种（例如"小鼠 Ang-Γ'，"猴Ang-Γ'等），术语"血管生 成素-1"或"Ang-Ι"指人Ang-I或其生物活性片段。人Ang-I具有如在NCBI蛋白质序列 数据库中以登记号AAB50557陈述的氨基酸序列。除非被指定为来自非人物种（例如"小 鼠 Tie-2"，"猴Tie-2"等），术语"Tie-2"（在本领域中又称"TEK"）指人Tie-2或其生物 活性片段。人Tie-2具有如在NCBI蛋白质序列数据库中以登记号AAA61130陈述的氨基酸 序列。
[0038] 如本文使用的术语"抗体"意指由四条多肽链即两条重链（H)和两条轻链（L)以 二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子，以及其多聚体（例如IgM)。每条重链包含一个 重链可变区（本文简称HCVR或V h)和一个重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域，ChU 每条轻链包含一个轻链可变区（本文简称LCVR或VJ和一个轻链恒定区。轻 链恒定区包含一个结构域（Ql)。V1^P'区可进一步分成被称为互补决定区（CDR)的高变 区，其中散布着保守性更好的被称为框架区（FR)的区域。每个V 1^P'由三个CDR和四个 FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发 明的不同实施方案中，抗Ang-2抗体（或其抗原结合部分）的FR可与人种系序列相同，或 可为天然的或人工改造的。可基于2个或多个CDR的并排分析确定氨基酸共有序列。
[0039] 如本文使用的术语"抗体"也包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文使用的， 术语抗体的"抗原结合部分"、抗体的"抗原结合片段"等等包括特异性结合抗原从而形成 复合物的任意天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程的多肽或糖蛋白。可使用任意 合适的标准技术例如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定 结构域的DNA的重组基因工程技术从例如完整的抗体分子抗体得到抗原结合片段。这样的 DNA是已知的，和/或容易从例如商业来源、DNA文库（包括，例如噬菌体抗体文库）中得到， 或可被合成。可化学地或使用分子生物学技术测序和操纵DNA，例如将一个或多个可变和 /或恒定结构域排列为合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、加入或缺失氨 基酸等。
[0040] 抗原结合片段的非限制性实例包括：（i)Fab片段；（ii)F(ab'） 2片段；（iii)Fd片 段；（iv)Fv片段；(V)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和（vii)由模拟抗体的高变区 (例如分离的互补决定区（CDR))的氨基酸残基组成的最小识别单元。如本文使用的措 辞"抗原结合片段"也包含其他经改造的分子，例如双抗体、三链抗体、四链抗体和微抗体 (minibody)〇
[0041] 抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可为任意大 小或氨基酸组成，并将一般包含至少一个CDR，所述CDR邻近一个或多个框架序列或与一 个或多个框架序列处于同一个读框中。在具有与 '结构域相连的Vh结构域的抗原结合 片段中，％和八结构域可处于相对彼此任意合适的排列。例如，可变区可为二聚的并包含 Vh-Vh, Vh-'或 二聚体。可选地，抗体的抗原结合片段可包含单体的V h或 '结构域。
[0042] 在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价连 接的至少一个可变结构域。在本发明的抗体的抗原结合片段中可找到的可变和恒定结构 域的非限制性代表性构型包括：（i)V H-CHl ; (ii)VH-CH2 ; (iii)VH-CH3 ; (iv)VH-CHl-CH2 ; (V) Vh-Ch1-Ch2-Ch3 ； (vi)VH-CH2-CH3 ； (vii) Vh-Cl ； (viii) Vl-ChI ； (ix)VL-CH2 ； (x) VL-CH3 ； (xi) VL-CH1-CH2 ;(xii)VfCHl-CH2-CH3 ;(xiii)VfCH2-CH3 ;和（xiv)VfQ。在包括上面列出的任意 代表性构型的任意可变和恒定结构域的构型中，可变和恒定结构域可直接彼此连接或可通 过完整或部分的铰链或连接区连接。铰链区可由至少2个（例如5, 10, 15, 20, 40, 60或更 多个）氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中邻近的可变和/或恒定结构域之间的弹性的 或半弹性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含与彼此和/或与一个或多个 单体Vh或'结构域非共价连接（例如通过二硫键）的上面列出的任意可变和恒定结构域 构型的同源二聚体或异源二聚体（或其他多聚体）。
[0043] 如同完整的抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性的（例如双特异 性）。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少2个不同的可变结构域，其中每个可变 结构域能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。在本发明的抗体的抗原结合 片段的上下文中可使用本领域现有的常规技术改造任意的多特异性抗体形式（包括本文 公开的代表性双特异性抗体形式）。
[0044] 抗体的恒定区对抗体固定补体和介导细胞依赖的细胞毒性的能力是很重要的。因 此，可基于是否期望抗体介导细胞毒性选择抗体的同种型。
[0045] 本文所用的术语"人抗体"意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区 和恒定区的抗体。本发明之人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基 (例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变），例如 可在CDR中尤其是在CDR3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语"人抗体"并不 意在包括其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被嫁接到人构架序列上的抗体。
[0046] 如本文使用的，术语"重组人抗体"意在包括通过重组手段制备、表达、产生或 分离的所有人抗体，例如使用转染进宿主细胞（下文进一步描述）的重组表达载体表达 的抗体，从重组的组合人抗体文库（下文进一步描述）分离的抗体，从人免疫球蛋白基 因的转基因动物（例如小鼠）中分离的抗体（见例如Taylor等人（1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)或通过任意其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的 手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的 可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人抗体经历了体外突变（或，当使用 人Ig序列的转基因动物时，经历了体内体细胞突变），且因此重组抗体的V h和 '区的氨基 酸序列尽管源自人种系Vh和 '序列并与人种系Vh和 '序列相关，但可能不天然地存在于 体内的人抗体种系库中。
[0047] 人抗体可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子 包含约150-160kDa的稳定的四链构造，其中通过链间的重链二硫键将二聚体维持在一起。 在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，而形成由共价连接的轻和重链组成的约 75-80kDa的分子（半抗体）。这两种形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化后亦如此。
[0048] 第二种形式在多种完整IgG同种型中出现的频率取决于（但不限于）与抗体的铰 链区同种型相关的结构差异。在人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可将第二种形 式的出现显著降低（Angal等人（1993)Molecular Immunology 30:105)至通常使用人IgGl 铰链所观察到的水平。本发明包含在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，其 可理想地用于，例如在生产中提高期望的抗体形式的产量。
[0049] 本文所用的"分离抗体"意指基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体（例如 特异性结合人Ang-2或人Ang-2片段的分离抗体在实质上不含特异性结合人Ang-2之外抗 原的抗体）。术语"特异性结合"或类似术语指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条 件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过约IxKT 8M或更小的Kd表征。测定两个分子是 否特异性结合的方法是本领域熟知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振，等等。但是， 特异性结合人Ang-2的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的Ang-2分子可具有交叉反 应性。此外，分离抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
[0050] 如本文使用的，"中和"或"封闭"抗体意指其与Ang-2的结合将阻断Ang-2与其受 体（Tie-2)的相互作用和/或导致Ang-2的至少一种生物活性被抑制的抗体。通过Ang-2 中和/或阻断抗体引起的抑制不需要是完全的，只要其可使用合适的测定被检测出即可。 用于检测Ang-2抑制的代表性测定在本文别处描述。
[0051] 本文公开的全人抗Ang-2抗体与相应的种系序列相比，可在重和轻链可变结构域 的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过比较本文公开的 氨基酸序列和可由例如公开的抗体序列数据库获得的种系序列，可容易地确定这些突变。 本发明包括源自本文公开的任意氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中在一个或多个 框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被回复突变为相应的种系残基或相应的种系残 基的（天然或非天然的）保守氨基酸取代（这样的序列变化在本文中被称为"种系回复突 变"）。本领域普通技术人员从本文公开的重和轻链可变区序列开始，可容易地产生许多包 含一个或多个单独的种系回复突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中， 在V h和/或' 结构域内的所有框架和/或CDR残基被回复突变为种系序列。在其他实施方 案中，只有某些残基被回复突变为种系序列，例如只有在FRl的开始8个氨基酸内或在FR4 的最后8个氨基酸内找到的突变残基，或只有在CDR1，CDR2或CDR3内找到的突变残基。此 夕卜，本发明的抗体可包含在框架和/或⑶R区内的2种或多种种系回复突变的任意组合，即 其中某些单独的残基被回复突变为种系序列，而某些不同于种系序列的其他残基被保留。 一旦得到后，可容易地检测包含一种或多种种系回复突变的抗体和抗原结合片段的一种或 多种期望的性能，例如提高的结合特异性、增强的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动的 生物性能（看情形而定）、降低的免疫原性等等。本发明包含以此一般方式得到的抗体和抗 原结合片段。
[0052] 本发明也包括包含具有一个或多个保守取代的本文公开的任意HCVR，LCVR和/或 CDR氨基酸序列变体的抗Ang-2抗体。例如，本发明包括相对本文公开的任意HCVR，LCVR和 /或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少，8个或更少，6个或更少，4个或更少等的保守氨 基酸取代的HCVR，LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗Ang-2抗体。在一个实施方案中，抗体 包含具有8个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的HCVR。在另 一个实施方案中，抗体包含具有6个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO: 18的氨基 酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有4个或更少的保守氨基酸取代的具有 SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有2个或更少的保 守氨基酸取代的具有SEQ ID N0:18的氨基酸序列的HCVR。在一个实施方案中，抗体包含具 有8个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID N0:20的氨基酸序列的LCVR。在另一个实 施方案中，抗体包含具有6个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列 的LCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有4个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID N0:20的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有2个或更少的保守氨基 酸取代的具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCVR。
[0053] 如本文使用的术语"表面等离子共振"指通过例如使用BIAcore?系统（GE Healthcare, Piscataway, NJ的Biacore Life Sciences部门）检测生物传感器基质内的蛋 白质浓度的改变，允许分析实时相互作用的光学现象。
[0054] 本文所用的术语"KD"意指特定的抗体-抗原相互作用的平衡离解常数。
[0055] 术语"表位"指与被称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作 用的抗原决定簇。单个抗原可具有多于一个表位。因此，不同的抗体可结合抗原的不同区 域并可具有不同的生物学效应。表位可为构象的或线性的。构象表位通过来自线性多肽链 的不同片段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是通过多肽链中的邻近氨基酸残基产生的 表位。在某些情况下，表位可包括在抗原上的糖、磷酸基或磺酰基部分。
[0056] 术语"基本上同一性"或"基本上相同"当指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷 酸插入或删除与另一个核酸（或其互补链）最佳比对时，用下述任何著名的序列同一性算 法如FASTA、BLAST或GAP测量，在至少约95 %，更优选的至少约96 %、97 %、98 %或99 %的 核苷酸碱基中具有核苷酸序列同一'I"生。与参考核酸分子具有基本上同一'I"生的核酸分子可在 某些情况下编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
[0057] 当应用于多肽时，术语"基本上相似"指两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程 序的默认间隙权重达排列到最佳比对时，两者至少有95%的序列相同性，更优选地至少有 98%或99%的序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。 "保守的氨基酸取代"是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质（例如 电荷或疏水性）相似侧链（R基团）的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代 不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在 于某些保守取代的情况中，可将序列相似性程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校 正。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参阅例如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24:307-331。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘 氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧 链：天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、 精氨酸和组氨酸；和6)含硫侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及7)含硫侧链：半胱氨酸和 甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、 赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨 酰胺。或者，保守的取代是Gonnet等人（1992)Science 256:144345中所公开的？411250对 数似然矩阵（PAM2501og-likelihood matrix)中任何正值的变化。"中度保守的"取代是 PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。
[0058] 多肽的序列相似性（又称序列同一性）通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析 软件是用指定给各种取代（包括保守氨基酸取代）、缺失和其它修饰的相似性程度对相似 的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit的程序，可以默认参数使用这些 程序，以确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列 同一性，或者野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG 版本6. 1。还可以用GCG版本6. 1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。 FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重迭区域的 比对和序列同一性百分数（Pearson(2000)，出处同上）。当将本发明之序列与含有大量的 源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是BLAST计算机程序，尤其是 BLASTP 或 TBLASTN，使用默认参数。参阅如 Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215:403410 及（1997)Nucleic Acids Res. 25:3389402.
[0059] 人抗体的制备
[0060] 产生单克隆抗体，包括全人单克隆抗体的方法是本领域已知的。在本发明的上下 文中可使用任意这样的已知方法用于产生特异性结合人Ang-2和具有本文公开的任意代 表性抗Ang-2抗体的一种或多种抗原结合和/或功能特征的人抗体。
[0061] 使用VEL0CIMMUNE?技术或任意其他已知的用于产生单克隆抗体的方法，最初分 离了具有人可变区和小鼠恒定区的针对Ang-2的高亲和力嵌合抗体。在如下实施例章节 中，表征抗体和并选择理想的特征，包括亲和力、选择性、表位等。用期望的人恒定区替换小 鼠恒定区以产生本发明的全人抗体，例如野生型或修饰的IgGl或IgG4。尽管选择的恒定区 可根据特定用途而改变，高亲和力抗原结合和靶特异性特征驻留在可变区中。
[0062] 生物等价物
[0063] 本发明的抗Ang-2抗体和抗体片段包含具有与所述抗体不同的氨基酸序列，但保 留结合人Ang-2的能力的蛋白质。当与亲本序列比较时，这样的变体抗体和抗体片段包含 一个或多个氨基酸加入、缺失或取代，但展示与所述抗体基本上等价的生物学活性。类似 地，当与公开的序列比较时，本发明的抗Ang-2抗体的DNA编码序列包含一个或多个核苷酸 加入、缺失或取代，但编码与本发明的抗Ang-2抗体或抗体片段基本上生物等价的抗Ang-2 抗体或抗体片段。这样的变体氨基酸和DNA序列的实例已在上文讨论。
[0064] 如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替代物，当在相似实验条件下 无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差别， 则它们被认为是生物等效的。某些抗体如果它们的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们 将被认为是等效物或药物替代物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差别 是有意设计的并反映在标签上，这种差别对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的（例 如对于慢性用途），并被认为对于所研究的特定医药产品在医学上是无关重要的。
[0065] 在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和药效方面没有临床 意义上的差别，则它们是生物等效的。
[0066] 在一个实施方案中，如果一名患者可以在对照产品和生物产品之间转换一次或多 次而不良副作用的风险并未如预期那样增加，包括与无这种转换的连续治疗相比在免疫原 性方面无显著的临床变化或效率降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。
[0067] 在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的 作用机制起作用，且这类机制是众所周知的，则它们就是生物等效的。
[0068] 生物等效性可以体内和体外的方法演示。生物等效性的测量包括，例如，（a) -种 在人类或其它哺乳类动物体内的试验，其中血液、血浆、血清或其它生物体液中抗体或其代 谢物的浓度是作为时间的函数测定的；(b) -种体外试验，该试验已与人的体内试验生物 利用率数据建立相关联系并可根据人的体内试验生物利用率数据合理预测；（c) 一种人类 或其它哺乳类动物的体内试验，其中抗体（或其目标）适当的急性药理作用是作为时间的 函数测定的；以及（d) -种控制良好的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生 物利用率或生物等效性。
[0069] 本发明抗Ang-2抗体的生物等效变体可通过例如取代生物活性不需要的各种残 基或序列或删除生物活性不需要的端部或内部残基或序列而构建。例如，对于生物活性并 非必需的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复原时形成不必要或不正确 的分子内二硫化物桥。
[0070] 抗体的生物和治疗特性
[0071] 大体上，当通过与固定在固相上的或在溶液相中的抗原结合测量时，本发明的抗 体以小于IOOpM的K D，一般以小于50pM的KD，和在某些实施方案中，以小于40pM的Kd与人 Ang-2结合。
[0072] 另外，本发明的某些代表性抗Ang-2抗体可展示一种或多种以下特征：（1)结合 人Ang-2但不结合小鼠 Ang-2的能力；（2)结合人Ang-2和结合小鼠 Ang-2的能力；（3)结 合人Ang-2但不结合人Ang-I,-3或-4的能力；（4)结合人Ang-2但不结合小鼠 Ang-I,-3 或-4的能力；（5)结合人Ang-2和结合Ang-I, -3或-4的能力；（6)结合人Ang-2和结合 小鼠 Ang-1，-3或-4的能力；（7)阻断人Ang-2结合人Tie-2的能力；（8)阻断人Ang-2结 合小鼠 Tie-2的能力；（9)阻断小鼠 Ang-2结合人Tie-2的能力；（10)阻断小鼠 Ang-2结 合小鼠 Tie-2的能力；（11)阻断人Ang-I结合人Tie-2的能力；（12)阻断人Ang-I结合小 鼠 Tie-2的能力；（13)阻断小鼠 Ang-I结合人Tie-2的能力；（14)阻断小鼠 Ang-I结合小 鼠 Tie-2的能力；（15)抑制人Ang-2诱导的人Tie-2的磷酸化的能力；（16)抑制人Ang-2 诱导的小鼠 Tie-2的磷酸化的能力；（17)抑制小鼠 Ang-2诱导的人Tie-2的磷酸化的能 力；（18)抑制小鼠 Ang-2诱导的小鼠 Tie-2的磷酸化的能力；（19)抑制人Ang-I诱导的人 Tie-2的磷酸化的能力；(20)抑制人Ang-I诱导的小鼠 Tie-2的磷酸化的能力；（21)抑制 小鼠 Ang-I诱导的人Tie-2的磷酸化的能力；（22)抑制小鼠 Ang-I诱导的小鼠 Tie-2的磷 酸化的能力；（23)在一个实验模型中抑制体内血管生成的能力（例如通过在裸鼠皮下植入 包含MCF-7细胞的基质胶栓（Matrigel plug)诱导血管生成）；和/或（24)在小鼠异种移 植模型中抑制或减少肿瘤体积的能力。
[0073] 本发明也包括以高亲和力与包含Ang-2纤连蛋白样结构域但缺乏Ang_2N端卷 曲螺旋结构域的构建体（这样的构建体在本文中被称为"Ang-2FD"）结合的抗体。代表 性Ang-2FD构建体包括人Ang-2FD(SEQIDN0:519)，小鼠 Ang-2FD(SEQIDN0:520)和猴 Ang-2FD(SEQ ID N0:521)。人、小鼠和猴Ang-2FD构建体可为单体或二聚体。Ang-2FD构建 体也可包括其他非Ang-2氨基酸序列，例如与Ang-2FD分子连接的人或小鼠 Fc结构域。另 一种代表性Ang-2FD构建体在本文中被称为"hBA2"（或人"bow-Ang2"），其是通过人或小 鼠 Fc结构域彼此连接从而形成类似蝴蝶结的构型的人Ang-2纤连蛋白样结构域的四聚体。 hBA2 -般由2个Ang-2二聚体组成，其中每个Ang-2二聚体包含2个通过Fc结构域彼此连 接的Ang-2纤连蛋白样结构域。代表性hBA2成分包括名为hBA2-hIgGl(SEQ ID N0:522) 和hBA2-mIgG2a(SEQ ID N0:523)的多肽。出人意料地，发现本发明的某些抗Ang-2抗体以 比已知的Ang-2对照抗体高得多的亲和力结合Ang-2FD构建体（见本文陈述的实施例）。
[0074] 在抗Ang-2抗体结合人或小鼠二聚体Ang-2FD构建体的上下文中，高亲和力结合 指抗Ang-2抗体以小于300pM的K d结合人或小鼠二聚体Ang-2FD。例如，如在25°C下在表 面等离子共振测定中测量的，以高亲和力结合人或小鼠二聚体Ang-2FD的抗Ang-2抗体包 括以小于300pM、小于250pM、小于200pM、小于190pM、小于180pM、小于170pM、小于160pM、 小于150pM、小于140pM、小于130pM、小于120pM、小于ΙΙΟρΜ、小于ΙΟΟρΜ、小于90pM、小于 80pM、小于70pM、小于60pM或小于50pM的Kd结合人或小鼠二聚体Ang-2-FD的抗体。
[0075] 在抗Ang-2抗体结合猴二聚体Ang-2FD构建体的上下文中，高亲和力结合指抗 Ang-2抗体以小于500pM的Kd结合猴二聚体Ang-2FD。例如，如在25°C下在表面等离子共 振测定中测量的，以高亲和力结合猴二聚体Ang-2FD的抗Ang-2抗体包括以小于500pM、 小于450pM、小于400pM、小于350pM、小于300pM、小于250pM、小于200pM、小于190pM、小 于180pM、小于170pM、小于160pM、小于150pM、小于140pM、小于130pM、小于120pM、小于 ΙΙΟρΜ、小于ΙΟΟρΜ、小于90pM或小于80pM的Kd结合猴二聚体Ang-2-FD的抗体。
[0076] 在抗Ang-2抗体结合人单体Ang-2FD构建体的上下文中，高亲和力结合指抗Ang-2 抗体以小于40nM的Kd结合人单体Ang-2FD。例如，如在25°C下在表面等离子共振测定中 测量的，以高亲和力结合人单体Ang-2FD的抗Ang-2抗体包括以小于40nM、小于30nM、小于 25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小 于4nM、小于3nM、小于2nM、小于InM、小于0· 9nM、小于0· 8nM、小于0· 7nM或小于0· 6nM的 Kd结合人单体Ang-2-FD的抗体。
[0077] 在抗Ang-2抗体结合hBA2构建体的上下文中，高亲和力结合指抗Ang-2抗体以小 于80pM的Kd结合hBA2。例如，如在25°C下在表面等离子共振测定中测量的，以高亲和力 结合hBA2的抗Ang-2抗体包括以小于80pM、小于75pM、小于70pM、小于65pM、小于60pM、小 于55pM、小于50pM、小于45pM、小于40pM、小于35pM、小于30pM、小于25pM、小于20pM、小于 18pM、小于16pM、小于14pM或小于12pM的K d结合hBA2的抗体。
[0078] 本发明包括结合Ang-2但基本不结合Ang-I的抗体。如本文使用的，当在表面等 离子共振测定中检测与Ang-I的结合时，如果抗体展示大于约InM的K D，例如大于约5nM、大 于约10nM、大于约50nM、大于约ΙΟΟηΜ、大于约150nM、大于约200nM、大于约250nM、大于约 300nM、大于约350nM、大于约400nM、大于约450nM、大于约500nM或更高的K D，则抗体"基本 不结合Ang-Γ'，在所述测定中抗体被捕获在表面上，且全长野生型人Ang-I以约25nM的浓 度以约60 μ 1/分钟的流速在25°C下注射在捕获抗体表面上约3分钟。（见例如实施例4)。 另外，当在这样的测定或其等价测定中检测时，如果抗体不能展示与Ang-I的任何结合，则 抗体"基本不结合Ang-Γ'。
[0079] 本发明也包括阻断Ang-2结合Tie2但基本不阻断Ang-I结合Tie-2的抗体。如本 文使用的，如果当抗体与Ang-I抗原以约100 :1 (抗体：抗原）的比例预混合并允许在25°C 下孵育约60分钟，然后通过表面等离子共振在Tie-2覆盖的表面上检测平衡的混合物与 Tie-2的结合（5 μ 1/分钟进行5分钟，在25°C下），与Tie-2结合的Ang-I的量是在不相 关的对照分子的存在下的与Tie-2结合的Ang-I量的至少50%时，抗体"基本不阻断Ang-I 结合Tie-2"。（见，例如实施例6)。例如，如果在与抗体预孵育后与Tie-2结合的Ang-I 的量是在上述实验条件下与不相关的对照分子预孵育后与Tie-2结合的Ang-I的量至少约 50 %、至少约55 %、至少约60 %、至少约65 %、至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少 约85 %、至少约90 %、至少约95 %或约100 %，则认为抗体"基本不阻断Ang-I结合Tie-2"。
[0080] 另外，本发明包括阻断或实质减弱Ang-2的生物学活性（例如Ang-2介导的Tie-2 的磷酸化；Ang-2诱导的血管生成；等）但不阻断或实质减弱Ang-I的相应的生物学活性 (例如Ang-I介导的Tie-2的磷酸化；Ang-I诱导的血管生成；等）的抗体。用于测定抗体 是否满足一种或多种上面列出的特征的测定和试验将是本领域普通技术人员容易知道和 容易实践的，和/或可通过本公开充分确定。例如，下面详细描述的实验程序可用于测定给 定的抗体是否结合或不结合Ang-2和/或Ang-I ;阻断或不阻断Ang-2和/或Ang-I结合 Tie-2 ;抑制或不抑制Ang-2和/或Ang-I介导的Tie-2的磷酸化；等。
[0081] 表位作图和相关技术
[0082] 为筛选能与特定表位结合的抗体（例如能阻断IgE与其高亲和力受体结合的抗 体），可进行常规的交联-阻断分析，如"Antibodies", Harlow和Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)中所述。其它方法包括丙氨酸扫描突变体分析、肽印迹分析 (Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原 的表位切除、表位提取和化学修饰的方法（Tomer (2000)Protein Science9 :487-496)。
[0083] 术语"表位"是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可 由毗连的氨基酸形成，或者由通过蛋白质的三级折迭而并列在一起的非毗连氨基酸形成。 由毗连氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折迭形成的表位 在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以 独特空间构象出现的氨基酸。
[0084] 修饰辅助概况分析（Modification-Assisted Profiling, MAP)，也被称为基于抗原 结构的抗体谱分析（Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是一种根据每 种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的抗同一抗原的单克 隆抗体（mAb)进行分类的方法（美国专利2004/0101920号）。每一类均可反映与另一类所 代表的表位截然不同或部分重迭的独特表位。这种技术可以快速过滤遗传上相同的mAb，从 而可使鉴定工作集中在遗传上不同的mAb上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP有助于鉴定某 些罕见杂交瘤克隆，后者能产生具有所需特性的mAbs。MP可用来将本发明的抗Ang-2抗 体分类成结合不同表位的抗体组。
[0085] 抗Ang-2抗体可结合氨基端卷曲螺旋结构域内的表位或羧基端纤连蛋白样结构 域（"FD"）内的表位。在本发明的优选实施方案中，抗Ang-2抗体及其抗原结合片段结合 FD内的表位。
[0086] 已从晶体结构分析中确定了 Ang-2的FD内的与Tie-2相互作用的氨基酸。见 Barton 等人，Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (2006 年 5 月）。就阻断 Ang-2 结合 Tie-2 但基本不阻断Ang-I结合Tie-2的抗体（例如H1H685P，见下面的实施例5和6)而言，这 些抗体结合的表位可包含Ang-2的（a)与Tie-2相互作用和（b)与Ang-I中的相应氨基 酸不相同的一个或多个氨基酸。（见图1)。因此，这样的Ang-2优先抗体结合的表位可包 含hAng-2(SEQ ID N0:518)的一个或多个以下氨基酸：S-417 ;K-432 ;I-434 ;N-467 ;F-469 ; Y-475;或S-480。例如，本
【发明者】已发现，与Ang-2(SEQ ID N0:518)的氨基酸F-469，Y-475， 和S-480相互作用的抗体优先与Ang-2而不是Ang-I相互作用，且此优先的结合可具有治 疗益处。因此，本发明包括特异性结合人血管生成素-2(hAng-2)但基本不结合hAng-Ι的 抗Ang-2抗体，其中所述抗体结合包含氨基酸F-469, Y-475,和S-480的hAng-2 (SEQ ID N0:518)上的表位。类似地，本发明包括阻断hAng-2结合hTie-2但基本不阻断hAng-1 结合hTie-2的抗Ang-2抗体，其中所述抗体结合包含氨基酸F-469, Y-475,和S-480的 hAng-2 (SEQ ID NO: 518)上的表位。
[0087] 本发明包括与本文描述的任意特定的代表性抗体（例如H1H685, H1H690, H1H691， H1H696, H1H706, H1M724和/或H2M744)结合相同表位的抗Ang-2抗体。同样地，本发明也 包括与本文描述的任意特定的代表性抗体（例如H1H685, H1H690, H1H691，H1H696, H1H706， H1M724和/或H2M744)竞争结合Ang-2的抗Ang-2抗体。
[0088] 使用本领域内已知的常规方法，可以容易地确定一种抗体是否与本发明之对照抗 Ang-2抗体一样与同样的表位结合，或在结合过程中竞争。例如，为了确定一种试验抗体是 否与本发明之对照抗Ang-2抗体一样与同样的表位结合，让该对照抗体与Ang-2蛋白或肽 在饱和条件下结合。然后，评估试验抗体与该Ang-2分子结合的能力。如果该试验抗体在 与对照抗Ang-2抗体饱和结合之后能够与Ang-2结合，就可得出结论，该试验抗体和对照抗 Ang-2抗体与不同的表位结合。在另一方面，如果该试验抗体在与对照抗Ang-2抗体饱和结 合之后不能与Ang-2分子结合，那么该试验抗体就可与本发明之对照抗Ang-2抗体所结合 的同一表位结合。然后可进行其它常规实验（例如肽突变和结合分析）以确定是否观察到 的试验抗体的结合不足实际上是由于与对照抗体所结合的同一表位结合，或是否空间阻断 (或另一现象）是观察到的结合不足的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、表面等离子体共 振技术、流式细胞计量法或本领域内所具备的任何其它定量或定性的抗体结合分析。依照 本发明的某些实施方案，如果，例如，如在竞争结合测定中所测量的，1倍、5倍、10倍、20倍 或100倍过量的一种抗体抑制至少50%，但优选75%，90%或甚至99%的另一种抗体的结 合（见例如Junghans等人，Cancer Res. 199050 :1495-1502)，则两种抗体结合相同（或重 叠）的表位。可选地，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的几乎所有的氨基酸突变能降 低或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体 结合的仅部分氨基酸突变能降低或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有"重叠的 表位"。
[0089] 为了确定一种抗体是否与对照抗Ang-2抗体在结合过程中竞争，在两个方向实施 上述结合方法：在第一个方向，让对照抗体与Ang-2分子在饱和条件下结合，然后评估试验 抗体与该Ang-2分子的结合。在第二个方向，让试验抗体与Ang-2分子在饱和条件下结合， 然后评估对照抗体与该Ang-2分子的结合。如果在这两个方向只有第一个（饱和）抗体能 够与Ang-2分子结合，那就可以得出结论，该试验抗体与对照抗体在与Ang-2结合的过程中 竞争。如同本领域普通技术人员所能理解的，与对照抗体在结合过程中竞争的抗体未必与 对照抗体所结合的同一表位结合，但可与一个重叠或邻近的表位结合而在空间上阻断该对 照抗体。
[0090] 物种选择性和物种交叉反应性
[0091] 根据本发明的某些实施方案，抗Ang-2抗体结合人Ang-2但不结合来自其他物种 的Ang-2。可选地，本发明的抗Ang-2抗体在某些实施方案中结合人Ang-2并结合来自一种 或多种非人物种的Ang-2。例如，本发明的Ang-2抗体可结合人Ang-2,且可结合或不结合 (视情况而定）一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、 胳马它、称猴（cynomologous)、绒猴（marmoset)、恒河猴（rhesus)或黑猩猩Ang-2。
[0092] 免疫缀合物
[0093] 本发明包括一种与治疗基团（"免疫缀合物"）如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制 剂或放射性同位素等缀合的抗Ang-2单克隆抗体。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。 适宜于形成免疫缀合物的细胞毒素和化疗剂的例子是本领域内众所周知的。参阅如WO 05/103081。
[0094] 多特异性抗体
[0095] 本发明之抗体可以是单特异性的、双特异性的，或多特异性的。多特异性mAb可以 针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽的抗原结合域。参阅，如 Tutt等人（1991) J. Immunol. 147:60-69。本发明的抗Ang-2抗体或其部分可连接到另一个 功能分子，例如另一个肽或蛋白质上，或与之共同表达以形成多特异性分子。例如，一种抗 体或其片段可与一种或多种其它分子实体如另一种抗体或抗体片段实现功能性（例如以 化学偶联、基因融合、非共价键连接或其它方式）连接，以产生具有第二种结合特异性的双 特异性或多特异性抗体。
[0096] 可用于本发明的代表性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白（Ig)CH3 结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个Ig CH3结构域相互之间相差至少一 个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别降低了双 特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合， 第二个Ig CH3结构域含有一个降低或消除与蛋白A结合的突变，例如一个H95R修饰（按 照MGT表现序列编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含 一个Y96F修饰（按照MGT编号法；按照欧盟编号法则为Y436F)。可在第二个CH3域内找 到的其它修饰包括：在IgGl抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I (按照 MGT 编号法；按照欧盟编号法则为 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和 V422I);在 IgG2 抗体的情况下为N44S、K52N和V82I (按照MGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N 和 V422I);以及在 IgG4 抗体的情况下为 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (按照 MGT 编号法；按照欧盟编号法则为 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。 上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为是在本发明的范围之内。
[0097] 治疗配方和施用
[0098] 本发明提供了含有本发明之抗Ang-2抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本 发明之治疗组合物可还包含一种或多种可药用的载体、赋形剂以及其它加入配方中以提 供改善的转移、递送、耐受性等的试剂（在本文中统称为"可药用的载体或稀释剂"）。在 药剂化学师所熟知的处方集里可以找到大量的适宜配方：雷氏药学大全！Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 〇 这些配方包括，如粉 齐U、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂（阳离子或阴离子）的泡囊（如LIPOFECTIN )、DNA缀合物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡（各种分子量的聚 乙二醇）、半固体状凝胶以及含有聚乙二醇的半固体状混合物。还可参阅Powell等人 Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (非肠道用配方赋形剂概 论），PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
[0099] 抗体的剂量可根据待施用的受试者的年龄和体形大小、目标疾病、病症、施用途径 等因素而改变。一般根据体重或体表面积计算优选剂量。当本发明之抗体用于治疗在成年 患者中与Ang-2活性相关的病症和疾病时，通过静脉内施用本发明之抗体是有利的，通常 是按照约〇. 01至约20mg/kg体重，更优选的是按照约0. 02至7、约0. 03至约5,或约0. 05 至约3mg/kg体重的单一剂量。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调节。 用于施用Ang-2抗体的有效剂量和时间表可通过经验确定；例如可通过周期性评估监控患 者的进展，并相应地调节剂量。另外，可使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间缩放（例 如，Mordenti 等人，1991，Pharmaceut. Res. 8:1351)。
[0100] 各种递送系统是已知的并可用于施用本发明之药物组合物，例如封装于脂质体、 微粒、微胶囊中、能表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用（参阅例如Wu等人 (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、 皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可以任何方便的途径给药，例如，输注或快速注 射，经上皮或粘膜（例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等）吸收，并可与其它生物活性剂一起施 用。施用可以是全身性或局部性的。
[0101] 本发明之药物组合物可用标准的针头和针筒经皮下或静脉递送。此外，对于皮下 递送，一种笔型递送装置可方便地用于递送本发明之药物组合物。这种笔型递送装置可以 重复使用或一次性使用。可重复使用的笔型递送装置一般采用一种可更换的含药物组合物 的药筒。一旦药筒内所有药物组合物均已施用、药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用一 个含药物组合物的新药筒取代。然后该笔型递送装置可重复使用。在一次性使用的笔型递 送装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型递送装置有一个预先充满药物组 合物的贮液器。一旦该贮液器内药物组合物用完，整个装置则被丢弃。
[0102] 许多可重复使用的笔型和自动注射递送装置已用于本发明之药物组合物的皮 下给药。其例子包括但当然不限于AUTOPEN?(Owen Mumford, Inc.，Woodstock，英国）、 DISETR0NIC? 笔（Disetronic Medical Systems, Burghdorf，瑞士）、HUMAL0G MIX 75/25? 笔、HUMAL0G?笔、HUMALIN 70/30?笔（Eli Lilly and Co.，印第安纳州印第安纳波利 斯）、N0V0PEN?I、II 和 III 型（Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦）、N0V0PEN JUNI0R?(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦）、BD?笔（Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖）、0ΡΤΙΡΕΝ?、 0ΡΤΙΡΕΝ PRO?、0ΡΤΙΡΕΝ STARLET?，以及 0PTICLIK?(sanofi-aventis，德国法兰克福），此 处仅列举几个品牌。用于本发明之医药组合物皮下给药的一次性使用的笔型给药装置的 例子包括但当然不限于 S0L0STAR? 笔（sanofi-aventis)，FLEXPEN?(Novo Nordisk)，以及 KWIKPEN?(Eli Lilly)。
[0103] 用于治疗眼部疾病，可例如通过眼药水、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、 玻璃体内植入、眼球囊下（sub-Tenon)注射或眼球囊下植入施用本发明抗体和抗原结合片 段。
[0104] 该医药组合物也可以囊泡尤其是脂质体形式递送（参阅Langer(1990)Science 249:1527-1533 ;Treat 等人（1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer (脂质体用于传染病和癌症治疗），Lopez-Berestein和Fidler (编），Liss, New York, pp. 353-365 ；Lopez-Berestein, ibid. , pp. 317-327 ；一般参阅同上）。
[0105] 在某些情况下，该药物组合物可以一种控制性释放系统给药。在一个实施方 案中，可使用一个泵（参阅 Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.l4:201)。在另一 个实施方案中，可采用聚合物材料。在又一个实施方案中，可将一种控制释放系统置于 该组合物目标的附件，从而只需要全身性剂量的一部分（参阅例如，Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release(控制释放的医学应用），出处同上， vol. 2, ρρ· 115-138)。
[0106] 可注射制剂可包括静脉、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些可注射制 剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水介质或通 常用于注射的油性介质中，以此方式制备该可注射制剂。作为注射用的水介质有例如生理 盐水、含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇（如乙醇）、多元 醇（如丙二醇、聚乙二醇），非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HC0-50(氢化蓖麻 油的聚氧乙烯（50摩尔）加合物）]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合 使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。将如此制备的注射液优选地装入一种适当的安瓿 瓶中。
[0107] 有利地，上述口服或注射用药物组合物被制备成单位剂量的剂型，以适合一定剂 量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液（安瓿）、栓剂等。 单位剂量的上述抗体含量一般为每剂约5至约500mg ;尤其是注射剂型，优选的是上述抗体 含量为约5至约lOOmg，其它剂型中抗体含量为约10至约250mg。
[0108] 抗体的治疗用途
[0109] 本发明的抗体特别用于治疗、预防和/或改善与Ang-2活性相关的任意病或疾病， 包括与血管生成相关的病或疾病。本发明的抗体和抗原结合片段可用于治疗，例如在脑和 脑膜、□咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖系统、肌肉、骨、皮肤和附件、结缔组织、 脾、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝和泌尿道，和特别是感觉器官例如眼中出现的原发性和/ 或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本发明的抗体和抗原结合片段用于治疗一种或多种以 下癌症：肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、恶性胶质瘤（malignant gliomas)、骨肉瘤、 结直肠癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状 腺癌或黑色素瘤。
[0110] 本发明的抗体和抗原结合片段也可用于治疗一种或多种眼部疾病。可用本发明的 抗体和抗原结合片段治疗的代表性眼部疾病包括，例如老年性黄斑退化症、糖尿病视网膜 病变和与脉络膜新生血管性疾病、血管渗漏、视网膜水肿和炎症有关的其他眼部疾病。另 夕卜，本发明的抗Ang-2抗体也可作为青光眼手术的佐剂施用，以预防在青光眼手术后的早 期血管和淋巴管生成（hem-and Iymphangiogenesis)和巨噬细胞至结膜滤过性小泡的募 集，并改善临床效果。
[0111] 在本发明的其他实施方案中，抗体或抗原结合片段用于治疗高血压、糖尿病（包 括非胰岛素依赖性糖尿病）、银屑病、关节炎（包括类风湿性关节炎）、哮喘、脓毒症、肾病和 与损伤、中风或肿瘤相关的水肿。
[0112] Ang-2表达已显示与多种炎症和/或传染性疾病的严重度相关（见例 如 Siner 等人，2009，Shock 31:348-353 ;Yeo 等人，2008，卩1'〇。.恥七11。3(1.5(^· (USA) : 105:17097-17102)。相应地，本发明的抗Ang-2抗体可用于治疗、预防或改善一种或 多种炎症或传染性疾病。可通过施用本发明的抗Ang-2抗体治疗、预防或改善的代表性传 染性疾病包括，但不限于：痕疾（恶性痕原虫（Plasmodium falciparum)感染）、病毒性出 血热（例如登革热）、立克次氏体感染、中毒性休克综合症、脓毒症、丙型肝炎、杆状巴尔通 体（Bartonella bacilliformis)感染、利什曼病、分枝杆菌感染和埃-巴二氏病毒感染。
[0113] 组合治疗
[0114] 组合治疗可包括本发明的抗Ang-2抗体和例如另一种Ang-2拮抗剂（例如抗 Ang-2抗体、肽抗体或CovX-体如CVX-060 (见US 7, 521，425))。本发明的抗Ang-2抗体可 与另一种抗血管生成剂如，例如VEGF拮抗剂（例如VEGF陷阱，见例如US 7, 087, 411 (在本 文中又被称为"VEGF抑制性融合蛋白"）），抗VEGF抗体（例如贝伐单抗），VEGF受体的小 分子激酶抑制剂（例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼（pazopanib))，抗DLL4抗体（例如 在US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，如REGN421)等，或与表皮生长因子受体（EGFR) 的拮抗剂（例如抗EGFR抗体或EGFR活性的小分子抑制剂）一起施用。可有益地与本发明 的抗Ang-2抗体组合施用的其他试剂包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和 结合细胞因子如 IL-1，IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17 ,IL-18或其相应受体的抗体。本发明也包括治疗组合,其包含本文提及的任意抗Ang-2抗 体和VEGF，DLL4, EGFR或任意上述细胞因子中的一种或多种的抑制剂，其中所述抑制剂是 适体、反义分子、核酶、siRNA、肽抗体、纳米抗体或抗体片段（例如Fab片段；F(ab'） 2片段； Fd片段；Fv片段；scFv ;dAb片段；或其他改造的分子，如双抗体、三链抗体、四链抗体、微抗 体和最小识别单元）。本发明的抗Ang-2抗体也可与抗病毒剂、抗生素、镇痛药、皮质类固醇 和/或NSAID组合施用。本发明的抗Ang-2抗体也可作为治疗方案的一部分施用，所述治 疗方案也包括放射治疗和/或常规的化学治疗。当与一种或多种其他试剂组合时，本发明 的抗Ang-2抗体可在其他试剂的施用前施用，与其他试剂的施用同时施用（例如在同一制 剂中或在单独的制剂中），或在其他试剂的施用后施用。
[0115] 抗体的诊断用途
[0116] 本发明的抗Ang-2抗体也可用于检测和/或测量样品中的Ang-2，例如用于诊断用 途。例如，抗Ang-2抗体或其片段可用于诊断以Ang-2的异常表达（例如过表达、低表达、 缺乏表达等）为特征的病症或疾病。用于Ang-2的代表性诊断测定可包括，例如使从患者 处取得的样品接触本发明的抗Ang-2抗体，其中所述抗Ang-2抗体用可检测的标签或报告 分子标记。可选地，未标记的抗Ang-2抗体可与自身经过可检测标记的第二抗体组合用于 诊断应用。可检测的标签或报告分子可为放射性同位素，例如 3H, 14C，32P，35S,或125I;荧光 或化学发光基团如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或例如碱性磷酸酶、β_半乳糖苷酶、辣根过 氧化物酶或荧光素酶的酶。可用于检测或测量样品中的Ang-2的特定代表性测定包括酶联 免疫吸附测定（ELISA)、放射免疫测定（RIA)和荧光激活细胞分类术（FACS)。 实施例
[0117] 举出以下实施例是为了向本领域一般技术人员就如何利用本发明之方法和组合 物提供一个完整的披露和说明，并非是为了限制被
【发明者】视为其发明的范围。已作出许多 努力以确保所用数字（例如量、温度等）的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除 非另有说明，部分是以重量计的部分，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是指 大气压或接近大气压。
[0118] 实施例1.抗人Ang-2的人抗体的产生
[0119] 对包含编码人免疫球蛋白重链和K轻链可变区的DNA的VEL0GIMMUNE?小鼠 直接施用人Ang-2抗原和刺激免疫应答的佐剂。通过Ang-2特异性免疫测定监控抗体免疫 应答。当取得期望的免疫应答时收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以维持其活力和形 成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生Ang-2特异性抗体的细胞系。使用 此技术得到几种抗Ang-2嵌合抗体（S卩，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体）；以 此方式产生的代表性抗体定名如下：H1M724, H1M727, H1M728, H2M730, H1M732, H1M737, H2M7 42, H2M743, H2M744, H1M749, H2M750 和 H1M810。
[0120] 如在U. S. 2007/0280945A1中描述的，也可从未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细 胞中直接分离抗Ang-2抗体。使用此方法，得到几种全人抗Ang-2抗体（即具有人可变结 构域和人恒定结构域的抗体）；以此方式产生的代表性抗体定名如下：H1H685，H1H690，H1H 691，H1H693, H1H694, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706 和 H1H707。
[0121] 依照此实施例的方法产生的代表性抗Ang-2抗体的生物学性能在下面陈述的实 施例中详细描述。
[0122] 实施例2.可变区基因应用分析
[0123] 为了分析产生的抗体的结构，对编码抗体可变区的核酸进行了克隆和测序。从抗 体的核酸序列和预测的氨基酸序列出发，鉴定了每个抗体重链可变区（HCVR)和轻链可变 区（LCVR)的基因使用。
[0124] 表 1
[0125]
[0126]
【权利要求】
1. 药物组合物，其包含分离的抗体或抗原结合片段、和可药用载体或稀释剂，用于治疗 患有如下疾病的患者： (a) 与血管发生相关的癌症；或 (b) 与脉络膜新生血管相关的眼病； 其中抗体或抗原结合片段当在表面等离子共振测定中检测时特异性结合人血管生成 素-2(hAng-2)但不结合hAng-Ι，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID N0:18的 氨基酸序列的重链可变区（HCVR)的三个互补决定区（⑶R)，和含有SEQ ID NO:20的氨基 酸序列的轻链可变区（LCVR)的三个CDR。
2. 权利要求1的药物组合物，其中抗体或抗原结合片段包含：包含由SEQ ID N0:4的氨 基酸序列组成的重链⑶R-1，由SEQ ID N0:6的氨基酸序列组成的重链⑶R-2,和由SEQ ID N0:8的氨基酸序列组成的重链⑶R-3的重链可变区，和包含由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列 组成的轻链CDR-1，由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成的轻链CDR-2,和由SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列组成的轻链CDR-3的轻链可变区。
3. 权利要求1或2的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段结合hAng-2,即SEQ ID NO: 518上的表位，所述表位包含选自F-469, Y-475和S-480的至少一个氨基酸。
4. 权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段结合hAng-2上的 表位，所述表位包含氨基酸F-469, Y-475和S-480。
5. 权利要求1至4中任一项的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段以如表面等 离子共振测定中测量的小于约80pM的KD结合hAng-2。
6. 权利要求1的药物组合物，其还包含血管内皮生长因子（VEGF)拮抗剂。
7. 权利要求6的药物组合物，其中所述VEG F拮抗剂选自抗VEGF抗体、VEGF受体的小 分子激酶抑制剂和VEGF抑制性融合蛋白。
8. 分离的抗体或抗原结合片段，其用于制备用于治疗患有下述疾病的患者的药物： (a) 与血管发生相关的癌症；或 (b) 与脉络膜新生血管相关的眼病； 其中抗体或抗原结合片段当在表面等离子共振测定中检测时特异性结合人血管生成 素-2(hAng-2)但不结合hAng-Ι，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID N0:18的 氨基酸序列的重链可变区（HCVR)的三个互补决定区（⑶R)，和含有SEQ ID NO:20的氨基 酸序列的轻链可变区（LCVR)的三个CDR。
9. 权利要求8的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：包含由 SEQ ID N0:4的氨基酸序列组成的重链⑶R-1，由SEQ ID N0:6的氨基酸序列组成的重链 ⑶R-2,和由SEQ ID N0:8的氨基酸序列组成的重链⑶R-3的重链可变区，和包含由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列组成的轻链⑶R-1，由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成的轻链⑶R-2， 和由SEQ ID NO: 16的氨基酸序列组成的轻链⑶R-3的轻链可变区。
10. 权利要求8或9的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合 hAng-2,即SEQ ID N0:518上的表位，所述表位包含选自F-469, Y-475和S-480的至少一个 氨基酸。
11. 权利要求8-10任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片 段结合hAng-2上的表位，所述表位包含氨基酸F-469, Y-475和S-480。
12.权利要求8-11任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片 段以如表面等离子共振测定中测量的小于约80pM的KD结合hAng-2。
【文档编号】A61P27/02GK104258390SQ201410475186
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2010年7月27日 优先权日:2009年7月29日
【发明者】G·瑟斯顿, C·戴利 申请人:瑞泽恩制药公司