一种具有抗衰老功效的干细胞注射液及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗衰老功效的干细胞注射液及其制备方法。干细胞注射液含有：1×106~1×108个/ml的骨髓多潜能干细胞、维生素C（50~200）mg/ml、2%的人血白蛋白和生理盐水。本发明注射液含有骨髓多潜能干细胞，来源广泛，易于扩增，制备体系易于控制，可直接用于静脉注射。本发明可以快速地修复和替换受损的细胞和组织，所用干细胞具有扩增和定向分化的独特功能；以及迅速分泌细胞因子、生长因子和组织因子，改善机体血液循环，增强代谢功能，提高人体免疫力，从而达到抗衰老的目的。
【专利说明】一种具有抗衰老功效的干细胞注射液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种具有抗衰老功效的骨髓多潜能干细胞注射液及其制备方法。
【背景技术】
[0002]衰老是指随着时间的推移，所有个体都将发生的器官和功能衰退的渐进过程。人体是由具有不同功能的组织和器官构成，而不同的组织和器官又由多种不同的细胞组成。细胞更新换代和发育分化是生命发生、发展的关键因素。抗衰老最根本的途径是修复细胞、改善细胞代谢、激活潜在的人体干细胞的功能；及时对受损细胞、衰老细胞进行有效更新，使受损细胞得到修复，潜在的干细胞得到激活，生理功能才能由病态和亚健康状态完全恢复正常，人体才能保持健康和年轻。
[0003]干细胞是人体内具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是同种的起源细胞，是形成人体内各种组织、器官的原始细胞。随着年龄的增长，体内细胞的数量和质量也在逐渐下降，无法按照机体的需求新生出年轻健康细胞，并替换组织中衰老病变的细胞，导致人的衰老和疾病发生。所以增加、修复和替换体内的干细胞和提高细胞的活性，是抑制衰老、预防各种疾病和延长生命的关键。
[0004]骨髓多潜能干细胞是存在于骨髓中的干细胞，具有高度自我更新的增殖和分化能力，在一定条件下可分化为造血干细胞、心肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等，修复和替换受损细胞，增强代谢功能；具有修复造血微环境，促进造血干细胞分化，分泌多种造血生长因子支持造血，改善贫血，促进外周血液循环，使四肢温暖、面色红润；而且骨髓多潜能干细胞取材广泛，易于分离和体外扩增；由于它具有免疫调节作用和较低的免疫原性，因此不仅促进细胞的免疫功能，又不会引起同种异体免疫排斥反应，这些优势使它成为组织工程再生医学最理想的种子细胞。
[0005]目前最常用的抗衰老方法仅是针对抗衰老护肤，如羊胎素注射、肉毒素注射、激素使用、护肤精华素的使用等手段，都仅是局部的作用，而不是全身性的，不能预防和控制器官的衰老。而我们的方法，即骨髓多潜能干细胞注射液，通过输注骨髓多潜能干细胞，不仅可以增加体内干细胞数量，而且可以激活处于休眠状态的干细胞，参与受到过氧化和代谢累积损伤的组织和器官的修复，干预自由基应激损伤使其恢复正常功能。骨髓多潜能干细胞分泌的因子也具有多重作用，分泌营养因子促进损伤组织内细胞增殖分化，恢复组织器官生理功能；分泌可溶性因子和直接接触调节免疫细胞增殖，降低机体的炎性反应；从而发挥抗衰老的作用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种骨髓多潜能干细胞注射液，该注射液的骨髓多潜能干细胞可分化为多种细胞，分泌多种细胞因子，免疫原性低，可发挥抗衰老的作用，弥补现代抗衰老手段的不足。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述骨髓多潜能干细胞注射液的制备方法，该方法采用自体或异体骨髓，经分离、培养、传代，获得干细胞制品，制备过程简单，重现性好。
[0008]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种具有抗衰老功效的干细胞注射液，包括以下组分:
(1)含量为IX 16^l X 18个/ml的骨髓多潜能干细胞；
(2)2%的人血白蛋白；
(3)维生素C (50?200) mg/ml ；
(4)生理盐水。
[0009]进一步的，所述的骨髓多潜能干细胞来源于自体或异体骨髓。
[0010]进一步的，所述的骨髓多潜能干细胞活力保持在95%以上。
[0011]一种具有抗衰老功效的干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤:
(1)制备骨髓多潜能干细胞:无菌抽取骨髓血，分离细胞，制成细胞悬液，计数调整细胞密度，接种至培养皿中，接种浓度为I X 15个/ml，完全贴壁后再换液，去除血细胞及其它未贴壁成分。每两天换液一次，细胞生长达到80%-90%’加入胰酶消化，并继续传代培养；
(2)将2%的人血白蛋白和维生素C(50^200) mg/ml混入生理盐水，取步骤(I)制备的骨髓多潜能干细胞重悬于上述溶液中，制成单细胞悬液，并使骨髓多潜能干细胞的浓度为
IX 16?I X 18 个/ml。
[0012]本发明的优点在于:
(I)本发明干细胞注射液，来源广泛、制备体系易于控制。
[0013](2)本发明的干细胞注射液选择骨髓多潜能干细胞移植，具有很大的应用优势，可改善机体衰老状态；骨髓多潜能干细胞注射入机体后，可进一步分化为造血干细胞、心肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等，修复和替换受损细胞，增强代谢功能；具有修复造血微环境，促进造血干细胞分化，分泌多种造血生长因子支持造血，改善贫血，促进外周血液循环，使四肢温暖、面色红润；分泌很多细胞生长因子及干细胞激活因子，促进机体功能的恢复，从而达到抗衰老的目的。
[0014](3)本发明干细胞注射液成分明确，可直接用于临床，安全可靠。其中:
(a)人血白蛋白为临床常用注射液，具有增加循环血容量、维持血浆胶体渗透压的作用；组织蛋白和血浆蛋白可互相转化，在氮代谢障碍时，白蛋白可作为氮源为组织提供营养，利于细胞的新陈代谢；白蛋白能结合阴离子也能结合阳离子，可以输送不同的物质，也可以将有毒物质输送到解毒器官。
[0015](b)维生素C具有多重作用:维生素C是体内一种重要的辅酶和抗氧化剂，具有可逆的氧化还原作用，参与细胞内呼吸链作用，维持组织细胞及器官的正常能量代谢，从而有利于细胞的完整存活和增殖发育；细胞间质的关键成分是胶原蛋白，维生素C参与胶原蛋白合成，有助于人体创伤的愈合；增强血管壁的强度，当体内含量不足，微血管脆性增强容易破裂，引起疼痛和关节胀痛；维生素C略带酸性，作为微量营养素被摄入体内，经体内溶解、消化，预防动脉硬化，使沉积的粥样斑块溶解；可以保护其他抗氧化剂；阻断亚硝酸盐形成强致癌物，有助于防止癌细胞的扩散；维生素C的抗氧化作用可以抵御自由基对细胞的伤害，防止细胞的变异；维生素C参与人体酶代谢，使双硫键(-S-S)还原为-SH，从而提高相关酶的活性，发挥抗氧化作用和保证细胞的完整性，保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢；维生素C可增强中性粒细胞的趋化性和变形能力，提高杀菌能力，并且维生素C还参与免疫球蛋白的合成，进而提高机体的免疫力。
[0016](C)生理盐水可以保持细胞的渗透压，利于细胞的存活；该注射液组分为临床常用电解质溶液，可方便临床输注。
[0017]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例，配合附图详细说明。
[0018]【专利附图】
【附图说明】:
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是衰老模型大鼠输注人骨髓多潜能干细胞注射液实验流程图；
图2是骨髓多潜能干细胞注射液对大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响效果图；
图3是骨髓多潜能干细胞注射液对大鼠血清中丙二醛(MDA)含量的影响图；
图4是骨髓多潜能干细胞注射液对胸腺指数和脾脏指数的影响图；
图5是骨髓多潜能干细胞注射液对胸腺中IL-2、IL-10含量的影响图；
图6是骨髓多潜能干细胞注射液对脾脏中IL-2、IL-10含量的影响图。
[0019]【具体实施方式】:
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0020]实施例1:人骨髓多潜能干细胞的制备
无菌条件下抽取骨髓血20ml，肝素抗凝，与无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)按1:2比例稀释，吹打混匀；在50ml离心管中加入1ml Ficoll Paque液后，缓慢加入稀释后的骨髓血40ml。1500r/min离心1min ;吸取分界面的白色絮状单核细胞层,用PBS洗漆2次，1500r/min离心lOmin。收集细胞制成细胞悬液，计数调整细胞密度，用DMEM/F12培养基混匀，接种至培养皿中，接种浓度为I X 15个/ml。于37°C、5%C02培养箱中培养72h，先镜下观察，完全贴壁后再换液，去除血细胞及其他未贴壁成分。每两天换液一次，细胞生长达到80%-90%，加入胰酶消化，传代培养。
[0021]取生长良好的第三代细胞进行流式细胞仪检测:收集第三代细胞，1500rpm离心1min,弃上清，加PBS溶液重悬，吸取100 μ L细胞悬液(约3 X 10 5个细胞)加入EP管内，按量分别加入检测抗体；避光孵育30min，每样品管加入2ml PBS洗一次，1500rpm离心5min ；弃上清，每样品管加300 μ L PBS溶液重悬，进行流式检测。
[0022]结果表明，培养的细胞经流式细胞仪检测，阴性对照:0.07% ;阳性表达:⑶44为98.47%, CD90 为 99.84%, CD105 为 99.1% ;阴性表达:CD34 为 2.81%、CD45 为 0.01%。
[0023]实施例2:骨髓多潜能干细胞注射液的制备该注射液是按以下成分配比而成:
(1)含量为IX 106^1 X 108个/ml的骨髓多潜能干细胞；
(2)2%的人血白蛋白；
(3)维生素C (50?200) mg/ml ；
(4)生理盐水。
[0024]上述制备的干细胞注射液细胞保持为单细胞悬液,细胞活力保持在95%以上。
[0025]实施例3:动物实验-对衰老模型大鼠输注人骨髓多潜能干细胞注射液
本发明的骨髓多潜能干细胞注射液能显著改善大鼠的衰老状态，抗衰老指标测定包括超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量、胸腺指数、脾脏指数、胸腺和脾脏中IL-2、IL-10的含量，具体实施方案如下。
[0026]1.衰老模型建立
清洁级6-8周龄SD大鼠30只，随机分10只为正常组，其余20只大鼠建立衰老模型。正常组的10只大鼠皮下注射生理盐水，每日一次，连续8周；其他20只大鼠进行致衰老注射，每日一次，皮下注射D-半乳糖400mg/kg，连续注射8周，流程图如图1所示。
[0027]2.实验动物分组
20只致衰老的大鼠随机分为衰老模型组和治疗组，每组10只。剩余10只为正常组。
[0028]3.骨髓多潜能干细胞注射液输注
衰老模型制备成功后，治疗组的10只大鼠，在尾静脉注射0.5ml多潜能干细胞注射液，含I X 104个细胞，每周一次，连续4周。同时，正常组、衰老模型组大鼠尾静脉注射0.5ml生理盐水，每周一次，连续4周。
[0029]4.抗衰老检测指标的确定
目前应用于抗衰老评定的指标主要有抗氧化类物质和免疫功能的检测。细胞代谢产生的自由基，在衰老中起到重要作用。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase, S0D)是体内自由基防御体系中最重要的酶类抗氧化剂，它可直接清除超氧阴离子自由基，阻断自由基连锁反应，保护组织免受超氧阴离子自由基的损伤。SOD活力的高低间接反应机体抗氧化的能力，即反应机体抗衰老能力。氧自由基通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用引起细胞损伤，而且能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因此，检测丙二醛的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，主要参与细胞免疫；脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，但B淋巴细胞比例较大，与体液免疫关系更为密切。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，IL-2活性水平直接反应T细胞的功能。IL-10是一种多能性的免疫调节因子，通过抑制其它细胞产生细胞因子和破坏Thl/Th2淋巴细胞的平衡来行使免疫抑制效应。因此，本发明的抗衰老检测指标定为超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量、胸腺指数、脾脏指数、胸腺和脾脏中IL-2、IL-10的含量。
[0030]5.抗衰老检测指标的检测
治疗4周后，取所有的三组的30只大鼠血清，测定各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量；
(I)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定用黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒说明进行。
[0031]SOD测定原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，测其吸光度。当被测样品中含有SOD时，对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。
[0032](2)丙二醛(MDA)含量测定用硫代巴比妥酸比色法。
[0033]MDA测定原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，根据测定的OD值计算MDA的含量。
[0034](3)称重法测定大鼠胸腺指数和脾脏指数。
[0035]动物称重后，水合氯醛麻醉处死。无菌解剖取胸腺和脾脏，无菌生理盐水洗去血迹，剪去脂肪及筋膜组织，用滤纸吸干，称重，计算各组大鼠的胸腺指数及脾脏指数的改变，单位mg/g体重:
胸腺指数=胸腺重量(mg) /大鼠体重(g)
脾脏指数=脾脏重量(mg) /大鼠体重(g)
(4)ELISA法检测胸腺和脾脏中细胞因子IL-2、IL-10的含量。
[0036]使用双抗体夹心ELISA法测定大鼠胸腺及脾脏中细胞因子的含量，取组织匀浆液，以3000rpm离心lOmin，取上清，如不立即检测，放入_80°C保存。操作按试剂盒说明书要求进行。
[0037]6.检测结果:
(I)骨髓多潜能干细胞注射液对大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响结果如图2所示:与正常组比较，衰老模型组血清中SOD活性显著降低(P < 0.05)，治疗组与衰老模型组相比，血清中SOD活性显著升高(P < 0.05)。
[0038](2)骨髓多潜能干细胞注射液对大鼠血清中丙二醛(MDA)含量的影响结果如图3所示:与正常组比较，衰老模型组血清中MDA含量显著升高(P < 0.05);治疗组与衰老模型组相比，血清MDA含量显著降低(P <0.05)。
[0039](3)骨髓多潜能干细胞注射液对胸腺指数和脾脏指数的影响如图4所示:衰老模型组的胸腺指数显著低于正常组(P < 0.05);治疗组的胸腺指数显著高于衰老模型组(P< 0.05)。与正常组比，衰老模型组脾脏指数显著降低(P < 0.05);而与衰老模型组相比，治疗组能提闻大鼠脾脏指数。
[0040](4)骨髓多潜能干细胞注射液对胸腺和脾脏中IL-2、IL-1O含量的影响结果如图5和图6所示:治疗组与衰老模型组比较，胸腺和脾脏中IL-2含量显著升高(P < 0.05)，胸腺和脾脏中IL-1O含量显著降低(P < 0.05)。
[0041]综上所述及检测结果显示，骨髓多潜能干细胞注射液能显著改善大鼠的衰老状态。
[0042]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种具有抗衰老功效的干细胞注射液，其特征在于，它包括以下成分: (1)含量为IX 16^l X 18个/ml的骨髓多潜能干细胞； (2)2%的人血白蛋白； (3)维生素C (50?200) mg/ml ； (4)生理盐水。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗衰老功效的干细胞注射液，其特征在于，所述骨髓多潜能干细胞来源于自体或异体骨髓。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗衰老功效的干细胞注射液，其特征在于，所述骨髓多潜能干细胞活力保持在95%以上。
4.一种具有抗衰老功效的干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤: (1)制备骨髓多潜能干细胞:无菌抽取骨髓血，分离细胞，制成细胞悬液，计数调整细胞密度，接种至培养皿中，接种浓度为I X 15个/ml，完全贴壁后再换液，去除血细胞及其它未贴壁成分；每两天换液一次，细胞生长达到80%-90%，加入胰酶消化，并继续传代培养； (2)将2%的人血白蛋白和维生素C(50^200) mg/ml混入生理盐水，取步骤(I)制备的骨髓多潜能干细胞重悬于上述溶液中，制成单细胞悬液，并使骨髓多潜能干细胞的浓度为I X 16?I X 18 个/ml。
【文档编号】A61P39/06GK104224839SQ201410516797
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】周萱 申请人:奥思达干细胞有限公司