基于力生长因子和镁合金的复合骨修复材料及其制备方法
【专利摘要】本发明基于力生长因子和镁合金的复合骨修复材料及其制备方法；在镁合金表面负载力生长因子。力生长因子为力生长因子24肽。镁合金基体去掉表面的氧化层带有一层稳定的正电荷；选择带不同电荷的电解质材料作为载体，将镁合金基体依次置于载体A-力生长因子-载体A-载体B中；其中载体A为含有羧基官能团的带负电聚电解质，载体B为含有胺基官能团的带正电聚电解质，并且载体A、载体B都具有生物相容性，在体内完全降解，通过静电作用，交替沉积在基体表面。本发明通过将力生长因子负载到镁合金表面，植入体内及时释放从而刺激成骨细胞的增长，来克服应力不足引起的问题。改性用的聚电解质溶液和力生长因子在体内都可完全降解，生物相容性好。
【专利说明】基于力生长因子和镁合金的复合骨修复材料及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料领域，特别涉及采用力生长因子对镁合金进行表面改性。
【背景技术】
[0002] 镁合金作为一种拥有巨大潜力的植入材料，重量轻、密度小，有高强度/重量比； 弹性模量（45GPa)更接近于正常骨组织，可避免应力遮挡效应对新生骨和塑性的影响；并 且能够在体内降解，可避免二次手术给患者带来痛苦，其降解产物镁离子是人体含量丰富 的阳离子，主要贮存于骨骼中，是多种酶的辅助因子，是核糖体的关键结构之一；镁离子还 能够刺激骨折端硬骨痂的生成、诱导成骨，促进骨折愈合，并刺激软骨生成。这些特性使镁 及其合金有可能成为理想的骨植入材料。然而镁合金降解速率过快等问题导致镁合金在植 入体内后受伤骨组织愈合之前就会完全降解，从而不能起到良好的支撑作用。而力生长因 子是一种能够促进成骨细胞增殖，修复损伤的活性因子，所以用力生长因子对镁合金进行 表面改性能够促进损伤骨组织的快速愈合。同时，力生长因子具有生物活性，必须选用载体 携带负载在镁合金表面，而载体又会在镁合金表面形成保护膜，从而能抑制镁合金的快速 降解。
[0003] 层层自组装（layer-by-layer assembly, LBL)技术是基于电解质阴阳离子说带正 负电荷的相互作用，将带相反电荷的聚电解质交替组装的超薄膜制备方法。该发明采用此 种技术实现对镁合金的表面改性过程。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对镁合金降解速率过快的问题，提供一种利用层层自组装技术 制备负载在镁合金表面力生长因子24肽（氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示）的方法，从而 使镁合金作为植入材料更好地发挥作用。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 本发明的力生长因子表面改性镁合金，是在镁合金表面负载力生长因子。
[0007] 所述力生长因子为力生长因子24肽。
[0008] 本发明的力生长因子表面改性镁合金制备方法，包括以下几步：
[0009] (1)改性之前镁合金需要使用砂纸打磨，去掉表面的氧化层。
[0010] (2)对镁合金进行预处理，一方面使使基体表面带上负电荷以便聚电解质和力生 长因子24肽的上载，另一方面会在基体表面覆盖一层抗腐蚀的保护膜。预处理方法可以选 择碱化处理和氟化处理。
[0011] (3)为使基体表面带有一层稳定的正电荷，将基体浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，由于 镁合金在液体环境中十分活泼，所以浸泡时间应小于10分钟。
[0012] (4)选择带不同电荷的电解质材料作为载体，将镁合金基体依次置于载体A-力生 长因子-载体A-载体B中。
[0013] 其中载体A为含有羧基官能团的带负电聚电解质（包括海藻酸钠，聚苯乙烯磺酸 钠等），载体B为含有胺基官能团的带正电聚电解质（包括壳聚糖，聚L赖氨酸溴化物等）， 并且载体A、B都具有生物相容性，在体内可以完全降解，通过静电作用，交替沉积在基体表 面。此上载过程重复进行m次，每进行1次算作一层，共负载m层力生长因子，力生长因子 的上载量和上载层数成正比。m优选为20-40。
[0014] 步骤（2)所述的预处理方法进一步优选为：将镁合金基体浸入60°C、4-6mol/L的 氢氧化钠溶液中2小时，然后用去离子水清洗，之后再在60°C下干燥。
[0015] 步骤（3)优选为将预处理后的镁合金基体置于3-6g/L的聚乙烯亚胺溶液中10分 钟，取出后用去离子水冲洗1分钟。
[0016] 步骤（4)具体步骤优选：本发明中用到的聚电解质溶液可以选择壳聚糖（CS)和海 藻酸钠（ALG)，其中壳聚糖为带正电的聚电解质溶液，海藻酸钠为带负电的电解质溶液。这 两种物质在体内可以完全降解，一部分被身体吸收，另一部分可以顺利排出体外。每完成一 次聚电解质溶液的上载，需要用去离子水冲洗1分钟，再进行下一次聚电解质的上载。同样 是由于镁合金在水中十分活泼，所以在冲洗干净的前提下，水洗时间越短越好。
[0017] 由于镁合金在聚电解质溶液中十分活泼，会发生电化学反应，所以上述聚电解质 溶液的上载需要借助匀胶机（型号可根据试样尺寸选择）进行。
[0018] (a)将完成步骤⑶的镁合金基体放置于匀胶机中，将2. 5g/L的壳聚糖溶液
[0019] 滴涂在基体上，水洗1分钟。
[0020] (b)将0· 36g/L的力生长因子滴涂在基体上，水洗1分钟。
[0021] (c)重复步骤（a)。
[0022] (d)将2g/L的壳聚糖滴涂在基体上，水洗1分钟。
[0023] (e)以上四个步骤重复进行m次。
[0024] 本发明方法中，根据常用的层层自组装方法，选择壳聚糖（CS)和海藻酸钠（ALG) 做电解质材料，两者结构如图1，他们分子链上分别含有正电基团（-NH3+)和负电基团 (-CO(T)。因为在聚乙烯亚胺（PEI)溶液中浸泡后，基体表面带正电荷，所以交替将海藻酸 钠（ALG)、力生长因子24肽、海藻酸钠（ALG)、壳聚糖（CS)通过静电作用，负载在镁合金基 体表面。
[0025] 本发明具有如下有益效果：
[0026] 同未改性的镁合金相比，能够刺激成骨细胞的增长，并且能够降低镁合金在体内 的降解速率。本发明的改性镁合金有望能克服骨组织修复或再生治疗过程中应力不足引起 的相关问题。镁合金作为骨科移植材料，弹性模量还是略高于正常骨组织，会产生一定的应 力遮挡效应，导致骨质疏松，骨折延迟愈合，甚至不愈合，通过将力生长因子负载到镁合金 表面，植入体内及时释放从而刺激成骨细胞的增长，来克服应力不足引起的问题。并且改性 后的镁合金生物相容性良好，改性用的聚电解质溶液和力生长因子在体内都可完全降解， 不会产生使身体产生排异反应的物质。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1壳聚糖（CS)和海藻酸钠（ALG)的结构式
[0028] A是壳聚糖的结构示意图，在水中会获得质子成为带正电的聚电解质。B是海藻酸 钠的结构示意图，在水溶液中会电离成带负电的聚电解质。
[0029] 图2力生长因子24肽改性镁合金涂层㈧和三种纯物质（壳聚糖、海藻酸钠、力 生长因子24肽）（B)的红外光谱图。
[0030] 图3力生长因子24肽改性镁合金表面的扫描电子显微镜图
[0031] A是负载20层力生长因子24肽改性镁合金的扫描电镜图。B是负载40层力生长 因子24肽改性镁合金的扫描电镜图。
[0032] 图4力生长因子24肽改性镁合金表面的原子力显微镜图，其中：
[0033] A是负载20层力生长因子24肽改性镁合金的原子力显微镜的平面图；
[0034] B是负载20层力生长因子24肽改性镁合金的原子力显微镜的三维图；
[0035] C是负载40层力生长因子24肽改性镁合金的原子力显微镜的平面图；
[0036] D是负载40层力生长因子24肽改性镁合金的原子力显微镜的三维图。
【具体实施方式】
[0037] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在本发明中使用的力 生长因子24肽购自无锡迈默拓普生物科技有限公司。
[0038] 实施例1基于力生长因子（壳聚糖、海藻酸钠做载体）改性镁合金材料的制备（m =20)。
[0039] 1、预先准备5mol/L氢氧化钠溶液，5g/L的聚乙烯亚胺溶液，2g/L的壳聚糖聚电解 质溶液，2. 5g/L的海藻酸钠电解质，0. 36g/L的力生长因子24肽溶液。由于购买的壳聚糖 难溶于水，易溶于醋酸溶液，所以先将3g/L的醋酸溶液稀释为1 %，再加入壳聚糖粉末，最 终配置为2g/L的壳聚糖聚电解质溶液。
[0040] 2、依次用400#、600#、1200#、1500#、2000#水磨砂纸对镁合金基体表面进行逐步 打磨，将打磨光滑后的基体用去离子水冲洗，随后放入无水乙醇中超声清洗10分钟，自然 风干。
[0041] 3、将清洗干净的基体放入60°C、5mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡2小时，取出后用 去离子水清洗，再置于60°C干燥箱中干燥。
[0042] 4、将镁合金基体置于配置好的聚乙烯亚胺溶液中10分钟，取出后用去离子水冲 洗，自然风干。
[0043] 5、将镁合金基体放置于匀胶机上，调节匀胶机转速为1000r/min，周期为lmin。 打开匀胶机，将一滴海藻酸钠（ALG)滴涂在基体上，匀胶机旋转1分钟后停止；再次打开匀 胶机，将一滴去离子水滴涂在基体上，起到冲洗的作用，同样匀胶机旋转1分钟后停止。之 后重复上述过程，需要把海藻酸钠（ALG)换成力生长因子24肽、海藻酸钠（ALG)、壳聚糖 (CS)。这样，就完成了一层力生长因子24肽的沉积。
[0044] 6、重复步骤5的方法20次，实现在镁合金基体表面负载20层力生长因子24肽的 制备。
[0045] 实施例2基于力生长因子（壳聚糖、海藻酸钠做载体）改性镁合金材料的制备（m =40)。
[0046] 1、预先准备5mol/L氢氧化钠溶液，5g/L的聚乙烯亚胺溶液，2g/L的壳聚糖聚电解 质溶液，2. 5g/L的海藻酸钠电解质，0. 36g/L的力生长因子24肽溶液。由于购买的壳聚糖 难溶于水，易溶于醋酸溶液，所以先将3g/L的醋酸溶液稀释为1 %，再加入壳聚糖粉末，最 终配置为2g/L的壳聚糖聚电解质溶液。
[0047] 2、依次用400#、600#、1200#、1500#、2000#水磨砂纸对镁合金基体表面进行逐步 打磨，将打磨光滑后的基体用去离子水冲洗，随后放入无水乙醇中超声清洗10分钟，自然 风干。
[0048] 3、将清洗干净的基体放入60°C、5mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡2小时，取出后用 去离子水清洗，再置于60°C干燥箱中干燥。
[0049] 4、将镁合金基体置于配置好的聚乙烯亚胺溶液中10分钟，取出后用去离子水冲 洗，自然风干。
[0050] 5、将镁合金基体放置于匀胶机上，调节匀胶机转速为1000r/min，周期为lmin。 打开匀胶机，将一滴海藻酸钠（ALG)滴涂在基体上，匀胶机旋转1分钟后停止；再次打开匀 胶机，将一滴去离子水滴涂在基体上，起到冲洗的作用，同样匀胶机旋转1分钟后停止。之 后重复上述过程，需要把海藻酸钠（ALG)换成力生长因子24肽、海藻酸钠（ALG)、壳聚糖 (CS)。这样，就完成了一层力生长因子24肽的沉积。
[0051] 6、重复步骤5的方法40次，实现在镁合金基体表面负载40层力生长因子24肽的 制备。
[0052] 实施例3基于力生长因子（聚L赖氨酸溴化物、聚苯乙烯磺酸钠做载体）改性镁 合金材料的制备（m = 20)。
[0053] 1、预先准备5mol/L氢氧化钠溶液，5g/L的聚乙烯亚胺溶液，2. 5g/L的聚L赖氨酸 溴化物聚电解质溶液，5g/L的聚苯乙烯磺酸钠电解质，0. 36g/L的力生长因子24肽溶液。
[0054] 2、依次用400#、600#、1200#、1500#、2000#水磨砂纸对镁合金基体表面进行逐步 打磨，将打磨光滑后的基体用去离子水冲洗，随后放入无水乙醇中超声清洗10分钟，自然 风干。
[0055] 3、将清洗干净的基体放入60°C、5mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡2小时，取出后用 去离子水清洗，再置于60°C干燥箱中干燥。
[0056] 4、将镁合金基体置于配置好的聚乙烯亚胺溶液中10分钟，取出后用去离子水冲 洗，自然风干。
[0057] 5、将镁合金基体放置于匀胶机上，调节匀胶机转速为1000r/min，周期为lmin。 打开匀胶机，将一滴聚苯乙烯磺酸钠（PSS)滴涂在基体上，匀胶机旋转1分钟后停止；再次 打开匀胶机，将一滴去离子水滴涂在基体上，起到冲洗的作用，同样匀胶机旋转1分钟后停 止。之后重复上述过程，需要把聚苯乙烯磺酸钠（PSS)换成力生长因子24肽、聚苯乙烯磺 酸钠（PSS)、聚L赖氨酸溴化物（PLL)。这样，就完成了一层力生长因子24肽的沉积。
[0058] 6、重复步骤5的方法20次，实现在镁合金基体表面负载20层力生长因子24肽的 制备。
[0059] 实施例4基于力生长因子改性镁合金材料的定性鉴定。
[0060] 将制备了 20层力生长因子24肽负载的镁合金表面的膜层挂下来进行红外光谱分 析（a)，与纯物质的壳聚糖（b)、海藻酸钠（c)、力生长因子（d)红外光谱图比较可以看出，如 图2所示，纯物质的力生长因子24肽中由于还有络氨酸，从而含有苯环，会在1453处产生 波峰；海藻酸钠是一种带负电的聚电解质，含有羧基，在1609、1418处产生非对称和对称的 伸缩振动吸收峰；壳聚糖是一种带稳定正电荷的聚电解质，含有伯胺，3443、1588处分别是 伯胺基的伸缩振动和变振动角吸收峰。在所刮下涂层的红外光谱图中，可以看到在1449处 产生波峰证明在涂层物质中含有苯环，而只有力生长因子24肽中是含有苯环的，所以可以 证明力生长因子24肽负载在了镁合金表面；而在1654和1590出产生的波峰是由于羧基和 氨基缩合为酰胺基引起的，从而证明海藻酸钠和壳聚糖也负载在了镁合金表面。
[0061] 将制备了 20和40层力生长因子24肽负载的镁合金置于扫描电子显微镜下进行 观察，结果如图3所示，可以看出负载20层力生长因子24肽的改性镁合金表面形成了较均 匀的聚电解质层，而在负载40层力生长因子24肽的改性镁合金表面聚电解质层更加光滑。
[0062] 将制备了 20层和40层力生长因子24肽负载的镁合金置于原子力显微镜下进行 观察，结果如图4所示。负载20层力生长因子24肽的改性镁合金表面粗糙度（RMS)值为 251，负载40层力生长因子24肽的改性镁合金表面RMS值为165,负载40层力生长因子24 肽的改性镁合金表面岛状物明显减少，表面更加光滑，从而生物相容性更加好。
【权利要求】
1. 一种力生长因子表面改性镁合金，其特征是在镁合金表面负载力生长因子。
2. 如权利要求1所述的合金，其特征是所述力生长因子为力生长因子24肽。
3. 权利要求1或2的力生长因子表面改性镁合金制备方法，其特征是包括以下几步： (1) 镁合金基体去掉表面的氧化层； (2) 将步骤（1)镁合金基体表面带有一层稳定的正电荷； (3) 选择带不同电荷的电解质材料作为载体，将镁合金基体依次置于载体A-力生长因 子-载体A-载体B中；其中载体A为含有羧基官能团的带负电聚电解质，载体B为含有胺 基官能团的带正电聚电解质，并且载体A、载体B都具有生物相容性，在体内完全降解，通过 静电作用，交替沉积在基体表面。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征是载体A-力生长因子-载体A-载体B为一层组 装，上载过程重复进行m次，负载m层力生长因子，力生长因子的上载量和上载层数成正比。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述m为20-40次。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤（1)所述的预处理方法为：将镁合金 基体浸入60°C、4-6mol/L的氢氧化钠溶液中2小时，然后用去离子水清洗，再在60°C下干 燥。
7. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤（2)将预处理后的镁合金基体置于 3_6g/L的聚乙烯亚胺溶液中10分钟，取出后用去离子水冲洗。
8. 如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤（3)电解质材料为壳聚糖（CS)和海藻 酸钠（ALG)，其中壳聚糖为带正电的聚电解质溶液，海藻酸钠为带负电的电解质溶液。
9. 力生长因子表面改性镁合金作为骨科植入材料的应用。
【文档编号】A61L27/04GK104225686SQ201410520287
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】高红, 赵津, 陈旭 申请人:天津大学