Cacna1e突变基因及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的方法，该方法为全基因组深度测序法或毛细管电泳测序法。本发明还提供了CACNA1E突变基因。进一步地，本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的试剂盒以及上述试剂盒在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。本发明还提供了上述突变基因和检测方法在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。通过全基因组测序及基于特异性PCR反应，在肺癌病人样本中发现了基因CACNA1E突变位点，通过检测其突变可为临床治疗、用药提供分子分型、治疗靶点等理论基础，为预防及治疗肿瘤提供新的思路。
【专利说明】CACNA1E突变基因及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤生物学领域，具体涉及一种CACNA1E突变基因的检测方法及其突 变基因。进一步地，涉及检测上述突变基因的试剂盒以及该试剂盒的应用。另外，本发明还 涉及检测方法、基因和/或试剂盒在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 癌基因是一类能诱发癌症的基因。癌症的发生往往与癌基因的异常表达及其活化 相关。在肿瘤组织样本中，与之相关的癌基因普遍高表达，同时这些癌基因突变后导致其活 性大大增强。以表皮生长因子受体（EGFR)为例，在肺癌肿瘤样本中，EGFR的高表达导致了 PI3K-AKT信号通路异常激活，从而导致了细胞异常增生。结合临床资料分析，EGFR突变导 致病人对药物（吉非替尼等）产生敏感性，如发生在EGFR第21号外显子（L858R)及第19 号外显子的突变使得病人对吉非替尼敏感。另一方面，在临床治疗过程中，病人逐渐产生耐 药性。进一步研究显示，这种耐药性的产生是由于EGFR第20号外显子发生突变（T790M) 而导致的。针对于此，在肺癌患者进行临床治疗前，对其EGFR突变筛查已成为临床及个性 化治疗的常规手段，并已取得较好的效果。由此可见，针对相关癌基因突变检测对于预防 及治疗癌症尤其是肺癌意义重大。但是由于EGFR等其他癌基因的突变在肺癌病人中只占 30% -50%，还有一大部分病人的发病机理并不清楚，因此，应用新技术发现癌基因并检测 其突变显得迫在眉睫。
[0003] 随着人类全基因组测序工作的完成以及测序技术的不断革新，全基因组测序已经 逐渐成为肿瘤基因组研究的有利武器。Ca 2+离子作为细胞内必不可少的第二信使参与了许 多重要的生理、生化过程。而钙离子通道蛋白在调节钙离子的过程中起着至关重要的作用。 近几年研究发现，肿瘤的发生、发展与钙相关蛋白有着密切的联系，例如，基因 CACNA2D1能 够维持肝癌细胞的肿瘤干细胞特点。
[0004] 基因 CACNA1E是钙离子通道蛋白的a IE亚基。它有3个转录本，这三个转录本编 码的蛋白分别由225U2270及2313个氨基酸组成。之前有报道，CACNA1E基因在肾母细胞 瘤中呈高拷贝状态，其mRNA及蛋白均高表达，且这种高表达与肾母细胞瘤的复发正相关。 但是，截止目前，基因 CACNA1E在其他肿瘤中表达情况并不清楚，其在肿瘤样本中的突变与 肿瘤的关系也并未报道。因此，研究CACNA1E在肿瘤中的表达与肿瘤的关系以及检测其突 变及突变与肿瘤的关系对发现新的癌基因、预防及治疗肿瘤意义重大。
【发明内容】
[0005] 发明人使用全基因组测序技术，对来自中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区的 14个病人的癌及癌旁组织进行了深度测序，数据分析发现，钙离子信号通路及钙离子通道 蛋白在这些病人体内发生了大量突变。在全基因组测序结果中，钙离子通道蛋白突变不仅 得到富集而且有着很高的突变频率，尤其是基因 CACNA1E。
[0006] 进一步地，发明人针对基因 CACNA1E的每一个外显子序列特点，设计每一个外显 子的特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR)，在164例病人标本以及5个细胞系（L78细胞 系、％D细胞系、Hela细胞系、NCI-H1975细胞系及XLA-07细胞系）中将CACNA1E的所有外 显子扩增出来，并通过毛细管电泳测序找出引起CACNA1E氨基酸改变的突变。结果发现，在 164例病人中共发现16例病人发生突变，其中在宣威/富源地区的79例病人中，有15例发 生突变，突变频率达到19% ;在广州及云南非宣威/富源地区的85例病人中只有1例病人 发生突变，突变频率为1. 2%。
[0007] 本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的方法，该方法为全基因组深度测序法 或毛细管电泳测序法。
[0008] 本发明还提供了 CACNA1E突变基因。
[0009] 本发明进一步提供了一种检测CACNA1E突变基因的试剂盒以及上述试剂盒在肺 癌的预防、检测和/或治疗中的应用。
[0010] 本发明还提供了上述突变基因和检测方法在肺癌的预防、检测和/或治疗中的应 用。
[0011] 根据本发明的一方面，本发明提供了一种检测CACNA1E突变基因的方法，所述方 法为全基因组深度测序法或毛细管电泳测序法。
[0012] 优选地，所述方法为毛细管电泳测序法，所述方法包括以下步骤：
[0013] 1)对CACNA1E基因的每个外显子设计特异性PCR引物，并进行PCR扩增；
[0014] 优选地，所述PCR产物大小控制在400-1200bp之间；
[0015] 优选地，所述PCR引物的序列如SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:92所示；
[0016] 2)PCR产物纯化后毛细管电泳测序检测，将得到的序列与UCSC网站中的CACNA1E 的基因序列（GRCh37/hgl9)比较，从而确定CACNA1E基因的突变位点；
[0017] 3)将得到的PCR产物按照正常的读码框进行翻译，以确定CACNA1E的突变位点。
[0018] 优选地，所述核苷酸突变位点至少具有以下的一种或多种：c. C356A、c. C507T、 C. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、 c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、 c. C5825A、c. G6037T、c. C6871A、c. C6862A、c. G6865T。进一步优选地，所述突变位点还位于 c. A6515G、c. C253A。
[0019] 再一方面，本发明提供了一种CACNA1E突变基因，其中所述CACNA1E突变基因的核 苷酸序列至少一个突变位点位于 c. C356A、c. C507T、c. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、 c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、 c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、c. C5825A、c. G6037T、c. C6871A、c. C6862A、 c. G6865T、c. A6515G、c.C253A。
[0020] 优选地，所述CACNA1E突变基因的编码蛋白质序列至少一个氨基酸突变位点位 于 P. P119H、P. L169F、P. H179N、P. R249L、P. A275S、P. G352W、P. E391D、P. D426Y、P. G546V、 P. R772L、p. E795D、p. S851I、p. R925S、p. L1013Q、p. K1327N、p. E1435K、p. W1665L、p. A1870S、 p. S1942Y、p. D2013Y、p. Ρ2291Τ、ρ· R2288S、p. G2289W。进一步优选地，所述突变位点还位于 P. Y2172C、p. L85I。
[0021] 本申请中所有的突变命名是基于国际上突变的命名原则，包含了三部分，突变前 氨基酸-突变的氨基酸位置-突变后氨基酸，如A275S，即突变导致了第275个氨基酸由突 变前的丙氨酸（A)变成了突变后的丝氨酸（S)，核苷酸突变同理。
[0022] 本发明还提供了一种检测CACNA1E突变基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增 CACNA1E突变位点的引物，优选地，所述试剂盒包括SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的引 物。
[0023] 优选地，所述试剂盒还包括常用的PCR组分，例如PCR扩增酶以及相应的缓冲液。
[0024] 需要说明的是，试剂盒中的引物可以根据已知的氨基酸序列设计，这是本领域的 常规技术手段。
[0025] 本发明提供的试剂盒的具体使用方法如下所示：
[0026] I) CACNA1E各外显子特异性PCR引物的设计：
[0027] 运用软件Primer5设计CACNA1E 48个外显子的特异性引物，共46对引物；设计引 物时，将产物大小控制在400-1200bp之间，并通过NCBI blast功能blast结果为单一性， 在本发明的一个优选的实施方案中，所述引物如表1所不。
[0028] 2) PCR产物扩增：
[0029] PCR反应体系为20 μ 1，模板DNA用量为10ng。
[0030] PCR程序为95°C，5分钟，95°C，30秒，60°C，45秒，72°C，1分钟，35个循环，最后 72 °C延伸10分钟。
[0031] 3)PCR产物进行毛细管电泳测序，将得到的序列与CACNA1E的基因序列比较，从而 判断是否存在突变位点。
[0032] 另外，也可以直接针对某个或某些突变位点设计引物，例如引物可以为SEQ ID NO: I-SEQ ID NO:92所示的序列中的一种或多种。
[0033] 由于上述试剂盒可以检测到CACNA1E基因的突变情况，而CACNA1E基因在肺癌病 人，尤其是中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区及细胞系中具有较高的突变率，因此该 试剂盒可以应用到肺癌的预防、检测和/或治疗中。
[0034] 同样地，本发明提供的CACNA1E突变基因和检测方法也可以应用到肺癌的预防、 检测和/或治疗中的应用。例如，由于本发明发现了在中国多环芳烃污染严重地区的肺癌 中基因 CACNA1E发生了突变，并通过一系列实验证实了基因 CACNA1E与肺癌发生相关，因此 基因 CACNA1E及其突变位点可以作为肺癌的治疗靶点。
[0035] 优选地，可以通过siRNA干扰技术，干扰掉CACNA1E，从而达到降低肿瘤的成瘤能 力或者抑制肿瘤生长的目的，用于治疗和/或预防肺癌。
[0036] 因此，本发明还提供了一种siRNA的组合，所述siRNA为用于干扰CACNA1E表达的 特异性siRNA。优选地，所述siRNA的序列为
[0037] SEQ ID N0:93 :5, -CCUCCGGCUUCUAAGAAUA-3, ；（CACNA1E 干扰 1)
[0038] SEQ ID N0:94 :5, -CGCCAUUUGAGUACAUGAU-3，。（CACNA1E 干扰 2)
[0039] 本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述siRNA序列。所述试剂盒中还 包括PCR扩增酶及相应缓冲液。
[0040] 本发明提供还提供了上述试剂盒的使用方法，优选地，所述方法为二次干扰法。
[0041] 在一个优选的实施方案中，所述二次干扰法是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0042] a.将受试者的细胞接种于6孔板，接种密度为IX IO5个细胞/孔，并使用培养基 培养；
[0043] 优选地，所述培养基为含10 % FBS的RPMI1640/DMEM培养基；
[0044] b. -天后，吸掉培养基，加入800 μ I Opti-MEM培养基；
[0045] c.将转染试剂 Hyperfect 2000 及 2. 5 μ I siRNA (20 μ Μ)加入到含 200 μ 1 Opti-MEM的RNase free的管子中，漩涡振荡混匀，室温静止10-15分钟；
[0046] d.将混和液加入到6孔板中，细胞培养箱中培养6小时左右；
[0047] e. 6小时后，用新鲜培养基代替转染液；
[0048] f.第三天重复步骤a-e。
[0049] 由于上述试剂盒可以干扰CACNA1E突变基因的表达，从而抑制细胞的增殖、克隆 形成、成瘤能力，并使细胞内的钙离子浓度以及细胞内磷酸化EGFR、ERK、AKT也随之下降， 因此该试剂盒可以应用到肺癌的预防、检测和/或治疗中。
[0050] 本发明为检测癌基因 CACNA1E突变提供了理论基础，设计了检测突变的特异性 引物。在此基础上，本发明通过全基因组测序及PCR、毛细管电泳测序等方法公开了基因 CACNA1E在肺癌病人尤其是中国多环芳烃污染严重的肺癌高发地区及细胞系中的突变情 况。除此之外，本发明通过干扰的方式初步揭示了癌基因 CACNA1E在肺癌发病中的作用。发 明人发现，在带CACNA1E突变的细胞中干扰CACNA1E后，细胞的增殖、克隆形成、成瘤能力皆 受到抑制，细胞内的钙离子浓度以及细胞内磷酸化EGFR、ERK、AKT也随之下降。
[0051] 本发明适用于检测癌基因 CACNA1E的突变，包括病人来源的肿瘤组织及细胞系。 通过检测其突变可为临床治疗、用药提供分子分型、治疗靶点等理论基础，为预防及治疗肿 瘤提供新的思路。
[0052] 通过全基因组测序及基于特异性PCR反应在肺癌病人样本中发现了基因 CACNA1E 突变位点，这些突变位点在肺癌预防、诊断及治疗过程中的作用。设计针对CACNA1E的特异 性小核酸RNA干扰序列（siRNA)，通过干扰的方式在CACNA1E突变以及野生型的细胞中将蛋 白CACNA1E干扰掉，检测细胞增殖，克隆形成能力、钙信号变化以及下游信号通路的变化。 结果显示，在CACNA1E突变的细胞中，干扰CACNA1E后能明显抑制细胞的增殖以及克隆形成 能力，并能导致细胞内钙离子浓度降低。同时，检测其下游信号通路发现，在带CACNA1E突 变的细胞中，干扰CACNA1E，磷酸化的EGFR、ERK、AKT都下调。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0054] 图1为肺癌病人样本及细胞系中CACNA1E蛋白突变的结构示意图；其中图A为肺 癌病人样本中CACNA1E蛋白突变的结构示意图；其中图B为肺癌细胞系（XLA-07)和Hela 细胞中CACNA1E蛋白突变的结构示意图；
[0055] 图2在基因 CACNA1E发生突变的Hela细胞及肺癌细胞XLA-07中，干扰CACNA1E 后细胞增殖、克隆形成及相关信号通路变化；其中，A为Hela及XLA-07细胞干扰CACNA1E 后，增殖能力受到抑制；B为Hela细胞干扰CACNA1E后克隆形成能力受到抑制；C为Hela及 XLA-07细胞干扰CACNA1E后，磷酸化EGFR、磷酸化AKT及磷酸化ERK下调；
[0056] 图3为基因 CACNA1E发生突变的Hela细胞及肺癌细胞XLA-07中，干扰CACNA1E 后细胞内钙离子浓度降低；其中，横坐标表示荧光强度，细胞内钙离子浓度越高，荧光越强； 纵坐标是发射荧光的细胞比例；如图中所示，对照组中的细胞荧光强度要高于CACNA1E干 扰后的细胞，即CACNA1E干扰后，细胞内钙离子浓度降低；
[0057] 图4为基因 CACNA1E发生突变的Hela细胞中，干扰CACNA1E后，细胞成瘤能力受 到抑制。其中，图A是在荷瘤的不同时间点测量肿瘤的体积，对照组中的瘤子体积明显大于 CACNA1E干扰后的瘤子体积；图B是处死老鼠后将瘤子剥离下来后的瘤子照片；图C是老鼠 处死时的荷瘤照片。
【具体实施方式】
[0058] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。
[0059] 除非特别指明，以下实施例中采用的Hela细胞系购自协和细胞库；XLA-07细胞系 购自中国科学院昆明动物所；L78细胞系购自中国科学院上海细胞库、％D细胞系购自中国 科学院上海细胞库、NCI-H1975细胞系购自ATCC ;
[0060] 除非特别指明，以下实施例中采用的裸鼠为Nude mouse，购自北京大学医学部。
[0061] 除非特别指明，以下实施例中所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法。
[0062] 除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商 购获得。
[0063] 实施例1CACNA1E引物设计
[0064] CACNA1E为R型电压门依赖性钙离子通道蛋白α亚基1E，属于细胞膜表面蛋白， 调控钙离子的细胞内入。同时还参与了多种钙离子依赖性的细胞生理生化反应，如肌肉收 缩、神经递质的传递、基因表达调控、细胞运动、细胞分裂以及细胞死亡等。该基因目前发现 有三个转录本，其最长的转录本为ΝΜ_001205293. 1，包含48个外显子，编码2313个氨基酸。 其蛋白结构包含了三个I〇n_trans结构域、一个Ca_chan_IQ结构域和一个PKD_Channel结 构域。登陆UCSC网站下载CACNA1E的基因序列，通过软件Primer 5设计CACNA1E每一个 外显子的特异性引物，将产物大小控制在400-1200bp之间，并通过NCBI blast功能blast 结果为单一性，具体的引物序列如表1所示。
[0065] 表I. CACNA1E外显子特异性引物序列
[0066]
【权利要求】
1. 一种CACNA1E突变基因，其中所述CACNA1E突变基因的至少一个突变位点位于 c. C356A、c. C507T、c. C535A、c. G746T、c. G823T、c.G1054T、c.G1173T、c.G1276T、c.G1637T、 c. G2315T、c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、 c. G5608T、c. C5825A、c. G6037T、c.C6871A、c.C6862A、c.G6865T、c. A6515G、c. C253A ; 优选地，所述突变位点还位于c. A6515G，其中所述CACNA1E突变基因为Hela细胞系中 的突变基因； 优选地，所述突变位点还位于c. C356A，其中所述CACNA1E突变基因为LXA-07细胞系中 的突变基因。
2. -种检测如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的方法，所述方法通过全基因组深 度测序法或毛细管电泳测序法确定突变基因。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述突变位点定位于Ion_trans结构域、PKD_ Channel结构域、Ca_chan_IQ结构域和/或其它他非功能区； 优选地，所述核苷酸突变位点至少具有以下的一种或多种：c. C356A、c. C507T、 c. C535A、c. G746T、c. G823T、c. G1054T、c. G1173T、c. G1276T、c. G1637T、c. G2315T、 c. G2385T、c. G2552T、c. C2773A、c. T3038A、c. G3981T、c. G4303A、c. G4994T、c. G5608T、 c. C5825A, c. G6037T, c. C6871A,c. C6862A,c.G6865T,c.A6515G,c.C253A ； 进一步优选地，所述突变位点还位于c. A6515G、c. C253A。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述方法通过毛细管电泳测序法确定突变基 因，包括以下步骤： 1) 对CACNA1E基因的每个外显子设计特异性PCR引物，并进行PCR扩增； 优选地，所述PCR产物大小控制在400-1200bp之间； 优选地，所述PCR引物的序列如SEQIDN0:1-SEQIDN0:92所示； 2. PCR产物纯化后毛细管电泳测序检测，将得到的序列与UCSC网站中的CACNA1E的基 因序列（GRCh37/hgl9)比较，从而确定CACNA1E基因的突变位点； 优选地，所述方法还包括将得到的PCR产物按照正常的读码框进行翻译，以确定 CACNA1E的突变位点。
5. -种用于检测如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的试剂盒，所述试剂盒包括用 于扩增CACNA1E突变位点的引物； 优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增酶、缓冲液、酶切不同突变位点的相应的限制性内 切酶； 优选地，所述PCR引物的序列选自SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的序列中的一种或 多种。
6. -种用于干扰如权利要求1所述的CACNA1E突变基因表达的siRNA的组合； 优选地，所述siRNA的序列为 SEQ ID N0:93 :5' -CCUCCGGCUUCUAAGAAUA-3' ；（CACNA1E 干扰 1) SEQ ID N0:94:5'-CGCCAUUUGAGUACAUGAU-3'（CACNA1E 干扰 2)。
7. -种用于干扰如权利要求1所述的CACNA1E突变基因表达的试剂盒，所述试剂盒包 括如权利要求6所述的siRNA序列； 优选地，所述试剂盒中还包括PCR扩增酶及相应缓冲液。
8. 如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，所述方法为二次干扰法； 优选地，所述二次干扰法是通过包括以下步骤的方法实现的： a. 将受试者的细胞接种于6孔板，，接种密度为1 X 105个细胞/孔，并使用培养基培养 优选地，所述培养基为含10% FBS的RPMI1640/DMEM培养基； b. -天后，吸掉培养基，加入800μ1 Opti-MEM培养基； c. 将转染试剂 Hyperfect 2000 及 2. 5 μ 1 siRNA(20 μ M)加入到含 200 μ 1 Opti-MEM 的RNase free的管子中，漩润振荡混勻，室温静止10-15分钟； d. 将混和液加入到6孔板中，细胞培养箱中培养6小时左右； e. 6小时后，用新鲜培养基代替转染液； f. 第二天重复步骤a_e。
9. 一组用于扩增如权利要求1所述的CACNA1E突变基因的引物和/或用于干扰如权利 要求1所述的CACNA1E突变基因的SiRNA在制备用于预防、检测和/或治疗肺癌的药物或 试剂盒中的用途； 优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增酶、缓冲液、酶切不同突变位点的相应的限制性内 切酶； 优选地，所述引物选自SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:92所示的序列中的一种或多种 优选地，所述siRNA为SEQ ID NO:93和/或94。
【文档编号】A61P35/00GK104293796SQ201410524704
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】周光飚, 吴黎川, 程昕 申请人:中国科学院动物研究所