一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料及其制备方法，本发明取任一哺乳动物四肢骨骨膜，摘除骨性碎片，无菌PBS漂洗3次，然后在浓度为5%的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，在摇床200rpm震荡1小时；接着在浓度为5%的含TritonX-100的PBS缓冲液，加入混合抗菌液，在摇床250rpm震荡48小时；再在浓度为10%的含SDS的PBS缓冲液，加入混合抗菌液，在摇床250rpm震荡48小时；最后在浓度为1.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入混合抗菌液，在摇床250rpm震荡12小时；本发明取材广、可批量生产、得到的骨膜材料安全性高。
【专利说明】一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料极其制备方法。
【背景技术】
[0002]骨不愈合、延迟愈合和骨缺损等是临床上常见的骨科疑难疾病，这不仅困绕的许多外科医生，更给患者带来巨大健康威胁和沉重的经济负担。而目作为前临床上针对上述疾病的治疗手段，再次修复手术、自体骨移植、关节置换等传统治疗方法均存在着诸多问题。例如，自体骨移植存在取材困难，手术创伤大等一系列问题。
[0003]骨膜除了富有血管、神经，有营养和感觉作用，更具有造骨细胞的功能，参与骨的增粗生长，对骨的生长(长长，长粗)和增生(断裂愈合)有重要作用。近年来越来越多的研究将骨膜移植用于治疗骨缺损和骨不愈合取得了较好的成果。然而骨膜移植存在供体不足、供区结构功能损害及免疫排斥反应等问题使其难以广泛开展。
[0004]再生医学和组织工程技术的出现使为治愈骨不愈合、延迟愈合和骨缺损等疾病带来了全新的思路。骨组织工程领域中，模拟骨膜微结构的人工仿生骨膜越来越受到人们的关注。例如，Ryu YM等人利用三维胶原支架诱导骨膜来源的细胞向成骨分化。此外，ZhaoL等人也利用组织工程技术采用小肠粘膜下层组织来培养简从质干细胞尝试构建人工骨膜从而修复骨缺损。但是由于天然骨膜具有复杂的三维结构和许多目前尚未明确的具体组成成分使得效果总是不尽如人意。例如，人工材料由于生物力学、生物相容性、材料性质等问题使其运用受到很大限制。因此找到真正符合正常骨膜生物学和力学性质的材料，从而治愈骨不愈合、延迟愈合和骨缺损等疾病是一个亟待解决医学难题。
[0005]细胞外基质(ECM)含有正常组织或器官细胞所需的各种生化因子，并且具有天然宏观及超微三维的立体结构。ECM可调节生物物理刺激、生物化学及分子信号等一系列组织或器官发育及修复所需的各种因素，从而实现组织或器官的恢复和再生。因此ECM作为一个新型的天然生物材料正被广泛的运用于心脏瓣膜、气管、肌肉、肌腱、软骨等一系列组织或器官的修复及再生。去细胞的真皮基质甚至已用于临床(商品名AlloDerm)。而目前尚无关于天然来源的骨膜脱细胞材料制备的报道。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术的不足，提供一种可适宜骨膜细胞和各类型干细胞生长、具有成骨诱导作用、可治疗骨不愈合、延迟愈合和骨缺损等疾病的骨膜脱细胞材料的制备方法。
[0007]—种天然组织来源的脱细胞骨膜材料及其制备方法，具体包括以下步骤:
(1)取任一哺乳动物四肢骨骨膜，摘除骨性碎片，无菌PBS漂洗3次，每次漂洗20分钟，去除血液、残余肌肉组织和脂肪组织；再用去离子水冲洗4小时；
(2)在浓度为5%的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，恒温45°C摇床200rpm震荡I小时；用去离子水冲洗4小时；
(3)在浓度为5%的含TritonX-100的PBS缓冲液，加入10KIU/ml, 10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5:1，恒温45°C摇床250rpm震荡48小时；再用去离子水冲洗4小时,所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成,青霉素和链霉素的体积比为1:1 ；
(4)在浓度为10%的含SDS的PBS缓冲液，加入10KIU/ml,10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5:1，恒温45°C摇床250rpm震荡48小时；用去离子水冲洗4小时，所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1:1 ;
(5)在浓度为1.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5:1，37°C摇床250rpm震荡12小时；用去离子水冲洗4小时后得到全椎间盘脱细胞支架，所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1:1。
[0008]本发明的主要优点如下:
(1)脱细胞技术在去除异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常骨膜成分和结构；
(2)本发明材料不仅可以用于种植各种干细胞(胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞(MSCs)、脂肪间充质干细胞等)和椎间盘细胞以实现正常椎间盘重构，为病人订制具有个体化、可供移植的全椎间盘，还可以将其研磨制成粉末，将正常椎间盘所含有的生化因子溶解用于治疗退变的椎间盘；
(3)本发明所采用的骨膜是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性，且原材料来源广泛，可批量生产；
(4)采用脱细胞技术获得的骨膜材料不含细胞等抗原物质，可使受体的免疫排斥反应降到最低限度，同时可不含细菌病毒等有害成分生物安全性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是本发明的骨膜脱细胞材料大体外观图；
图2是骨膜脱细胞材料横切面的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图；
图3是骨膜脱细胞材料纵切面的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图；
图4是骨膜脱细胞材料横切面的阿尔新蓝染色保留大量糖胺聚糖成分图；
图5是骨膜脱细胞材料纵切面的阿尔新蓝染色保留大量糖胺聚糖成分图；
图6是是骨膜脱细胞材料胶原蛋白含量定量检测图；
图7是骨膜脱细胞材料DNA定量检测几乎不含有DNA成分图；
图8是骨膜脱细胞材料横切面扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图；
图9是骨膜脱细胞材料纵切面扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图；
图10是CCK-8检测不同支架浸提液浓度下骨髓间充质干细胞的增值情况图；
图11 Live/Dead细胞染色骨髓间充质干细胞在骨膜脱细胞材料支架上的生长情况图。
[0010]下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0011]具体实施方案一 1、制备骨膜脱细胞基质
(I)取材:取健康家猪(雌雄不限)四肢长骨的骨膜，摘除骨性碎片，无菌PBS充分漂洗去除血液和其他杂质，骨膜长约6cm,宽约3cm,厚度约5mm。
[0012](2)脱细胞步骤如下:
步骤一:在200ml浓度为5%的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，恒温45°C摇床250rpm震荡4小时；再用去离子水冲洗4小时；
步骤二:在500ml浓度为5%的含Triton X-100的PBS缓冲液，加入10ml青霉素和链霉素(10KIU/ml，10g/ml)混合抗菌液，恒温45°C摇床250rpm震荡48小时；用去离子水冲洗4小时；
步骤三:在100ml浓度为10%的含SDS的PBS缓冲液，加入200ml青霉素和链霉素(10KIU/ml, 10g/ml)混合抗菌液，恒温45°C摇床250rpm震荡48小时；用去离子水冲洗4小时；
步骤四:用250ml浓度为1.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入50ml青霉素和链霉素(10KIU/ml，10g/ml)混合抗菌液，37°C摇床250rpm震荡12小时后，用去离子水冲洗4小时得到全椎间盘脱细胞支架，如图1所示；
(3)骨膜脱细胞支架的组织学评价
图2和图3是本发明骨膜脱细胞支架(横切面和从切面)HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留图，保留大量胶原纤维成分；图4和图5是本发明骨膜脱细胞支架(横切面和从切面)阿尔新蓝染色放大100倍保留大量糖胺聚糖成分图。图6是本发明骨膜脱细胞材料胶原蛋白含量定量检测图，材料胶原蛋白含量与正常组织比较无明显减少。
[0013](4)骨膜脱细胞支架的抗原成分定量检测
图7是本发明骨膜脱细胞支架DNA定量检测几乎不含有DNA成分图。
[0014](5)骨膜脱细胞支架的超微立体结构观察
图8和图9是本发明全椎间盘脱细胞支架(横切面和从切面)扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图。
[0015](6)骨膜脱细胞支架的生物相容性评价
图10是本发明骨膜脱细胞支架CCK-8检测不同支架浸提液浓度下骨髓间充质干细胞的增值情况图。图11是本发明骨膜脱细胞支架Live/Dead细胞染色骨髓间充质干细胞在全椎间盘脱细胞支架上100倍的生长情况图。
【权利要求】
1.一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料及其制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: (1)取任一哺乳动物四肢骨骨膜，摘除骨性碎片，无菌PBS漂洗3次，每次漂洗20分钟，去除血液、残余肌肉组织和脂肪组织；再用去离子水冲洗4小时； (2)在浓度为5%的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，恒温45°C摇床200rpm震荡1小时；用去离子水冲洗4小时； (3)在浓度为5%的含TritonX-100的PBS缓冲液，加入10KIU/ml, 10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5:1，恒温45°C摇床250rpm震荡48小时；再用去离子水冲洗4小时,所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成,青霉素和链霉素的体积比为1:1 ； (4)在浓度为10%的含SDS的PBS缓冲液，加入10KIU/ml,10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5:1，恒温45°C摇床250rpm震荡48小时；用去离子水冲洗4小时，所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1:1 ; (5)在浓度为1.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5:1，37°C摇床250rpm震荡12小时；用去离子水冲洗4小时后得到全椎间盘脱细胞支架，所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1:1。
【文档编号】A61L27/36GK104307045SQ201410539114
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】林贤丰, 陈凯, 范顺武 申请人:林贤丰