余甘子多糖的制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种余甘子多糖的制备方法，其制备步骤包括余甘子多糖的提取分离和余甘子粗多糖的脱色工艺研究，其特征在于余甘子粗多糖采用不溶性壳聚糖为脱色剂脱色精制，它解决了传统脱色精制中或脱色率低或多糖含量低的缺点，采用该方法制备的余甘子多糖，对肝癌细胞株HepG2细胞的抑制率和食管癌细胞株EC109的抑制率均强于5-氟尿嘧啶（5-FU）。
【专利说明】余甘子多糖的制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及余甘子多糖的制备和应用，尤其涉及一种具有抗消化道肿瘤活性的潮 汕余甘子多糖的制备和应用。
【背景技术】
[0002] 余甘子Phyllanthus emblica L.又名山油柑、油甘子、余甘果等，为大戟科叶下珠 属植物余甘子的成熟果实。余甘子是潮汕地区的优良种质资源之一，余甘子不仅具有丰富 的营养价值，而且具有抗炎抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等多种生物活性。目前研究表明，余甘 子的主要活性成分为：多糖类物质,黄酮类化合物,抗坏血酸，SOD酶和多酚类化合物，其生 物学功能是多种有效成分协同作用的结果。其中，余甘子多糖(粗多糖)具有清除自由基、抗 氧化和抗肿瘤等作用，引起了各国学者的兴趣。
[0003] 在多糖的提取、分离、纯化以及结构研究中，脱色是一个重要环节。目前，脱色主 要采用双氧水法和活性炭吸附法，用活性炭脱色的脱色率最低，多糖的含量最高；过氧化氢 的脱色率较活性炭的好，但多糖含量较低。目前缺乏一种快速、简单、高效的脱色方法，既保 证高的脱色率的同时，确保有高的多糖保留率。
[0004] 同时对余甘子多糖的抗消化道肿瘤活性的研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种余甘子多糖的制备方法，特别是粗余甘子多糖的脱色精 制方法，它解决了传统脱色精制中或脱色率低或多糖含量低的缺点。
[0006]本发明是通过以下技术步骤实现的，它是以余甘子为原料，按照以下步骤进行制 备： (1) 余甘子去核，用50?80°C热水浸泡10?60 min，然后打浆，将浆液加热回流1? 5h后，热提液趁热过滤； (2) 将所得滤液浓缩至原体积20?30%，用95%食用酒精调至溶液乙醇含量为70? 85%，静置8?15hr，过滤，沉淀依次用适量80%乙醇、无水乙醇洗1?3遍； (3) 沉淀经过滤、冷冻干燥得余甘子粗多糖。
[0007] (4)以水为溶剂，将余甘子粗多糖配成0? 2?0? 8 mg/ml溶液，用柠檬酸调节pH 至3.0?4.0,按每100 ml溶液加入2.0?2.5 g不溶性壳聚糖，于水浴中使温度在40 ?50 °C，搅拌45?60 min脱色，过滤除去残渔。
[0008] (5)将所得滤液浓缩至原体积20?30%，静置12-24hr，过滤，沉淀经冷冻干燥得 余甘子多糖。
[0009] 本发明技术步骤（1)中余甘子与热水的比值为1:5?1:10。
[0010] 本发明技术步骤（2)中滤液浓缩可采用常压浓缩，也可采用减压浓缩。
[0011] 本发明技术步骤（2)中过滤可采用离心过滤。
[0012] 本发明技术步骤（2)或步骤（5)中冷冻温度为-4 °C?-20 °C。
[0013] 本发明技术步骤（4)中最好将PH调为3. 0?4. 0。
[0014] 本发明技术步骤（4)中搅拌脱色温度为40 °C?50°C。
[0015] 本发明技术步骤（4)中搅拌脱色时间为45min?60min。
[0016] 本发明脱色率和多糖保留率的测定方法如下： 1.脱色率测定方法 配制0.5 mg /ml余甘子多糖样品溶液，对余甘子粗多糖溶液进行了可见光400?600 nm扫描，确定其吸收光谱。余甘子粗多糖溶液无最大吸收峰，由余甘子多糖溶液脱色前为 橙黄色，根据互补色原理可知，溶液主要吸收蓝色波段（446?464nm)可见光，故选择450 nm为检测波长。
[0017]取适量的脱色前后待测液在450 nm处测定吸光度，并按下式（1)计算脱色率： 脱色率（％) =(A脱色前一A脱色后）/ A脱色前X 100%。
[0018] 注：A为吸光度。
[0019] 2.多糖保留率测定方法 配制0.5 mg /ml余甘子多糖样品溶液，取脱色前后待测液各2. 00 ml，加质量分数 为6%的重蒸苯酚1.0 ml及浓硫酸5.0 ml,迅速摇勻后，静置10 min,沸水水浴加热 15min，冷却至室温，于490 nm波长处测吸收度A值，以标准曲线计算多糖溶液中的葡萄糖 含量和多糖保留率。
[0020] 多糖保留率（％) = CXD/W 式中：W为余甘子多糖质量（mg) ; C为多糖溶液中的葡萄糖质量浓度（mg /ml); D为多糖的稀释倍数。
[0021] 本发明对抗肿瘤活性具有很好的抑制作用。 实施例
[0022] 将H印G2，EC109细胞株消化制成5 X 10-4个/L的细胞悬液，每孔100 ii L的 量接种于96孔培养板中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液置37 °C、5% C02细胞培 养箱中培养24h，按照实验分组要求培养后，每孔加入20iiL MTT (5mg/mL)溶液，在 37 °C继续孵育4 h后吸出上清液，每孔加入150 ii L DMS0，用平板摇床摇匀，用酶标 仪在490 nm波长处检测每孔的吸光度（A值）。以5-氟尿嘧啶（5-FU)为对比，对肝癌细 胞株H印G2细胞的抑制率和食管癌细胞株EC109的抑制率结果分别见表1和表2。其对肝 癌细胞株H印G2细胞和食管癌细胞株EC109的抑制率均强于5-FU。
[0023] 表1对肝癌细胞株HepG2细胞的抑制率
【权利要求】
1. 一种余甘子多糖的制备方法，其步骤包括： (1) 余甘子去核，用50?80°C热水浸泡10?60 min，然后打浆，将浆液加热回流1? 5h后，热提液趁热过滤； (2) 将所得滤液浓缩至原体积20?30%，用95%食用酒精调至溶液乙醇含量为70? 85%，静置8?15hr，过滤，沉淀依次用适量80%乙醇、无水乙醇洗1?3遍，沉淀 经冷冻干燥得余甘子粗多糖； (3) 将余甘子粗多糖配成0.2?0.8mg/ml水溶液，用柠檬酸调节PH至3.0?4.0， 脱色温度控制在40?50 °C，经45?60 min，溶液加人壳聚糖2.0?2.5 g进行脱 色； (4) 将所得滤液浓缩、沉淀、过滤，经冷冻干燥得余甘子多糖， 其特征在于：步骤（3)中的脱色工艺是先将余甘子粗多糖配成0.2?0.8mg/ml水溶 液，用柠檬酸调节PH至3?4,脱色温度控制在40?50 °C，经45?60 min，溶液加 入壳聚糖2. 0?2. 5 g进行脱色。
2. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（1)中余甘子与热水的比值为1:5? 1:10。
3. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（2)中滤液浓缩可采用冷冻干燥，也可 米用减压浓缩干燥。
4. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（2)中过滤可采用离心过滤。
5. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（2)和步骤（4)中冷冻温度 为-4V ?-20V。
6. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：余甘子粗多糖溶液脱色前最好将PH调为 3. 0 ?4. 0〇
7. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：余甘子粗多糖溶液搅拌脱色温度为40? 50。。。
8. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：余甘子粗多糖溶液搅拌脱色时间为45? 60 min〇
9. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：每100 ml余甘子粗多糖溶液加入的壳聚 糖量为2.0?2.5 g。
10. 按照权利要求1所述方法，其特征在于：所制备的余甘子粗多糖溶液对消化道肿 瘤细胞株Η印G2, EC109的具有抑制活性，比5-FU强。
【文档编号】A61P35/00GK104262504SQ201410574230
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】李春泉, 陈一村, 陈潮升, 陈秀英 申请人:广东汇群中药饮片有限公司