小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株、制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的制备方法及应用，本发明提供的细胞株不仅能在细胞培养条件下持续性传代，还具有潘氏细胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子。CCTCC C201419520141024
【专利说明】小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株、制备方法及其应用
[0001]发明所属领域:
本发明属于杂交瘤【技术领域】，具体地说，本发明涉及小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株、制备小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株的方法及小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株的应用。
技术背景
[0002]潘氏细胞是许多动物消化道的一种细胞，近年来的研究表明:该细胞具有分泌动物特异性防御素、溶菌酶以及消化道干细胞生长因子等等物质的能力，其所分泌的这些物质能杀灭病原微生物和调控消化道细胞分化，对维持消化道的健康起着极其重大的作用(陶凯忠，唐庆娟，郑萍.潘氏细胞研究进展，现代生物医学进展，2009，9 (4):794-800)。
[0003]目前，关于潘氏细胞的研究多采用组织学的方法，如免疫组化分析，分离培养潘氏细胞未见报道。用于实验研究的潘氏细胞系多为人或动物的癌变潘氏细胞，如T-84和Caco-2等(匡伟，赵国琦.几种特殊的肠上皮细胞系.中国畜牧杂志，2007，43(13):41-43)。这类细胞系是通过长期体外培养驯化得来，往往不具备正常潘氏细胞的分泌功能(纪华英，陈其奎，曾晖.小鼠小肠上皮细胞的体外原代培养，中国畜牧杂志，2010，16(9):1417-1419);而从组织中分离的潘氏细胞又无法长期培养，这使得潘氏细胞的研究和利用受到很大限制。
[0004]建立动物永生性细胞系通常采取传代细胞建系和癌变细胞建系的方法(薛庆善.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社，2001)。这两种方法需要较长的时间或特殊的癌变组织。机体中一些高度分化的终末细胞如淋巴细胞等体外永续性培养非常困难，而建立的癌变细胞系与正常细胞具有本质区别，在研究中有很多局限性(马玉龙，许梓荣，郭彤，等.鸡肠上皮细胞的分离及原代培养方法.中国兽医学报，2007，27 (I):74- 80.)。
[0005]发明技术内容:
本发明的目的是提供一种小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株，该细胞株不仅能在细胞培养条件下持续性传代，还具有潘氏细胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子。
[0006]本发明的再一个目的是提供一种制备小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的方法。
[0007]本发明的再一个目的是提供小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的应用。
[0008]本发明公开了一株新的杂交瘤细胞株，其特征在是:该细胞株由小鼠空肠的潘氏细胞与SP2/0细胞杂交融合而得，能在细胞培养条件下持续性传代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子，该细胞是小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2014195，保藏日期是2014年10月24日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，是中国专利局指定的保藏机构，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编 430072,网址:www.cctcc.0rg ,电话:027-68752319, Email: cctcciwhu.edu.cn。在本发明公开后，不以赢利为目的的研究者可依法向保藏中心索取本微生物菌种再现本发明。
[0009]本发明公开了小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株建立的方法，该方法包括如下步骤:
(1)小鼠空肠消化道内膜细胞消化分离:将小鼠空肠取下后，用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胶原酶的混合物进行消化，充分消化后用细胞培养液将消化离散的内膜细胞冲洗出来，配制成合适密度的细胞悬液；
(2)细胞融合:细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0等量混合，用PEG作融合剂，常规方法融合，在用Raw264.7细胞制作的饲养细胞层上接种融合细胞，用HAT作筛选培养基，获得消化道内膜细胞杂交瘤细胞群；
(3)杂交瘤细胞株的分离培养与筛选:用细吸管吸出不同的融合细胞克隆，分别培养于铺有Raw264.7饲养细胞层的培养孔中进行连续传代，平行样品进行荧光桃红染色，留下那些染色阳性的平行样品的细胞克隆继续培养，取平行样品进行CK-18抗体的潘氏细胞特异性抗原检测鉴定，选留具有潘氏细胞特异性抗原的融合细胞株作为潘氏细胞杂交瘤细胞株继续培养并保存，建成潘氏细胞杂交瘤细胞株。
[0010]在本发明中，PEG指聚乙二醇,英文名polyethylene glycol的简称，HAT是含有
H一Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T-Thymidine胸腺卩密唳核苷培养基的选择培养基。本发明中的潘氏细胞指小肠中的一类上皮细胞。
[0011]本发明还公开了新的潘氏细胞杂交瘤细胞株的应用。
[0012]本发明中的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，Raw264.7饲养细胞可通过可通过市售商业生物公司或菌种保藏机构获得，如中国典型培养物保藏中心保藏有该细胞，研究者可向该中心索取。
[0013]本发明的优点:于现有技术相比，本发明有如下优点:
小鼠潘氏融合GCLP细胞株不仅能在细胞培养条件下持续性传代，还具有潘氏细胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子。本发明提供的细胞株克服了离体状态下难研究了潘氏细胞的情况，为长期的持续研究提供了大量的样本数。
[0014]小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株为开发潘氏细胞分泌物的药物化功能以及由此开发出新型药物提供了生产资料基础。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是酶消化获得的小鼠空肠内膜细胞群荧光桃红染色图片图图2是盲杂交后获得的融合细胞克隆图
图3是经筛选获得的潘氏融合细胞株荧光桃红染色图片图图4是潘氏融合细胞株核型分析图
图5是潘氏融合细胞株潘氏细胞特异性抗原组织化学检测图A表示潘氏融合细胞B表示阴性细胞对照
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0018]实施例1小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株的建立 1.1主要溶液与器皿的准备
1.1.1含双抗的PBS溶液:在常规PBS溶液中加入青、链霉素，使其浓度分别达到200单位 /ml 和 200mg/ml。
[0019]1.1.20.5%胰蛋白酶消化液:用加有0.04EDTA的PBS溶液配制胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的终浓度为0.5%。
[0020]1.1.30.25%胰蛋白酶消化液:用加有0.02EDTA的PBS溶液配制胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的中浓度为0.25%。
[0021]1.1.4胶原蛋白酶+中性酶混合消化液:用无血清DMEM培养基分别配制胶原蛋白酶XI型及中性蛋白酶I浓缩液，其浓度分别为2000u/ml和0.lmg/ml，用前将二者等量混合后，作10倍稀释。
[0022]1.1.5DMEM完全培养基:向DMEM基础培养基中加入胎牛血清，使其终浓度达到15%。
[0023]1.1.6其他常规培养用溶液
1.1.7平端注射针头:16号注射针头尖端被锯平并打磨平滑，针管长度保持在2cm以上。
[0024]1.1.8绑扎用线绳:消毒好的细棉线 1.1.9动物实验用手术器械
1.1.10平皿、离心管、吸管等其他分离细胞用器皿。
[0025]1.1.11所有溶液经0.2um过滤除菌、所有器皿经高温高压灭菌处理。
[0026]1.1.12无菌水浴瓶:取10ml带翻口橡皮塞的盐水瓶，瓶塞上插入一根平端注射针头，瓶中装入盐水或PBS溶液，使液面离瓶口距离约2cm，装入耐高温高压的塑料袋中，扎紧袋口，放高压灭菌器中消毒，冷却后拿出顺便在瓶颈处扎紧塑料袋，用前预热至37°C。
[0027]1.2小鼠准备:选取28日龄昆明小鼠为取材动物，使用前饥饿24小时。
[0028]1.3饲养层细胞的准备:选取处于对数生长期的Raw264.7细胞，经10ug/ml工作浓度的丝裂霉素C处理3小时，消化吹散后用培养基调整细胞密度至15个/ml，接种于96孔板中，24小时后即可用于培养杂交瘤细胞。
[0029]1.4小鼠空肠内膜细胞消化分离:
1.4.1空肠取样:28日龄的昆明小鼠断颈处死，浸泡于75%酒精中消毒约5分钟，在无菌室超净工作台仰放于9cm以上规格的平皿内，破开腹壁，用眼科镊分离空肠，用手术剪从中部剪取约5厘米长的空肠，放入另一平皿中。
[0030]1.4.2冲洗:将平端注射针头装在50ml注射器上，吸取约50ml含双抗PBS溶液，注射针管从空肠的一端插入约0.5cm深，用眼科镊夹住插入部位，上移注射器，使空肠全部悬空，用力推注射器柱塞，使其中的PBS溶液快速通过空肠肠腔，将其中的内容物冲洗出来，然后将空肠放入另一无菌平皿中，注射针管经酒精棉球擦拭消毒后从空肠的另一端插入，重复上述过程反向冲洗空肠，如此重复3次以上，最后一次冲洗完成后，
1.4.3消化:将已预热至37°C的无菌水浴瓶，除去其外的塑料袋包装，取下插有平端注射针头的瓶塞，将针头插入空肠一端，用线绳绑紧在针头上，取一 5ml的注射器，吸取约2ml的胶原蛋白酶+中性酶混合消化液，连接针头，先轻推注射器柱塞，使其向肠管中注入约Iml的消化液冲洗肠管，用线绳结扎肠管的另一端，再继续推注射器柱塞，将剩下的消化液推入肠管中(肠管已充分充盈时停止推注，以免压力过大胀破肠管)，垂直上提瓶塞，将肠管慢慢从瓶口放入瓶中，塞紧瓶塞，连同其上的注射器一起放入37°C、5%C02培养箱中，消化约40分钟，取出水浴瓶，取一 1nl的注射器，吸取1mlDMEM完全培养基，换下瓶塞上的注射器，轻轻拔出瓶塞，轻轻垂直提出肠管，平移至一 1ml离心管管口上方，用眼科剪轻轻剪断肠管结扎端，用力推注射器柱塞，使其中培养基快速冲洗肠管，冲洗液收集于离心管中，此即为第一次消化细胞悬液，接着用0.5%的胰蛋白酶溶液重复上述消化过程，消化时间为15分钟，用第一次消化的细胞悬液冲洗消化后的肠管，获得二次消化细胞悬液，用吸管反复吹打细胞悬液，使其中的组织块充分分散为单个细胞，用200目的滤布将吹打后的细胞悬液过滤于另一 1ml离心管中，显微镜下计数其中的单个细胞。
[0031]1.4.3细胞收集及与瘤细胞杂交融合:取处于对数生长期的SP2/0细胞若干，轻轻吹散后于细胞计数板中计数细胞，并计算出悬液中的细胞密度，按照空肠内膜细胞总数:SP2/0细胞总数=1:1的比例将这两种细胞悬液混合，混合液装于一支大小适中的离心管中以1000转/分的转速离心5分钟，弃上清，并用无菌棉签尽量吸干离心管中的液体，留下管底的细胞沉积物。向细胞沉积物中缓慢加入细胞融合用PEG0.4ml，用时约I分钟，立即以1000转/分的转速离心5分钟，取出离心管后立即加入1mlDMEM完全培养基，再以1000转/分的转速离心5分钟，弃上清，留下管底细胞沉积物。
[0032]1.4.4杂交瘤细胞的培养:用杂交瘤细胞选择性培养基重悬管底的细胞沉积物调节细胞密度至14个/ml。将铺有Raw264.7饲养层细胞的96孔培养板吸去培养基，用杂交瘤细胞混悬液对该培养板进行重新铺板，放于37°C、5%C02培养箱中培养。
[0033]1.5杂交瘤细胞筛选
1.5.1杂交瘤细胞克隆的分离培养:当铺板后的细胞培养10天后，可以看见许多融合成功的细胞呈克隆化生长。用尖端被拉细并拉弯曲的巴氏吸管，在显微镜下将长出的所有杂交瘤细胞克隆分别单独吸出，培养至单个垫有Raw264.7饲养层细胞的96孔板中继续培养，每个克隆放入同一孔中，让其继续生长扩增。细胞长满培养孔后按1:2的比例传代，连续传3-5代后，脱离饲养层细胞继续传代，以后按常规杂交瘤细胞传代操作继续传代。
[0034]1.5.2杂交瘤细胞的鉴定与选留:当单个细胞克隆传代至2-4孔细胞时，对其中一孔进行荧光桃红染色，留下那些荧光桃红染色阳性的细胞克隆作为初筛选留克隆继续培养，并将它们分别分成2块培养板，其中一块细胞用于潘氏细胞特异性抗原免疫荧光检测，阳性细胞对应的另一块培养板的细胞克隆被选留继续培养，进一步对其传代48小时的培养液中的防御素、溶菌酶含量进行检测，将含量最高的细胞克隆作为最终杂交瘤细胞留下继续培养。
[0035]1.5.3杂交瘤细胞株细胞库的建立:按照常规杂交瘤细胞培养操作继续培养最终选留下的杂交瘤细胞，直至细胞增殖到足够数量，然后按照细胞库建立程序将该细胞液氮冻存，建成可永续性应用的细胞库。
[0036]实施例2 GCLP细胞的传代培养
与普通杂交瘤细胞培养操作完全一样，将保存的GCLP细胞解冻后进行不断的扩繁传代，每隔5代，对培养上清液取样检测小鼠潘氏细胞特异性防御素α 5的含量，只要其含量达到50ng/ml以上则视细胞培养正常，杂交瘤细胞未出现遗传变化，否则应检查培养过程与细胞染色体。连续培养10代后细胞的生长速度，细胞形态无变化，细胞上清液小鼠潘氏细胞特异性防御素α 5的含量始终在62-80ng/ml之间变动，证明该细胞遗传性能稳定，可以作为潘氏细胞在交流细胞株使用。
[0037]实施例3 GCLP细胞在预防初生仔猪腹泻病中的应用
3.1细胞准备:按照常规杂交瘤细胞培养的方法将GCLP细胞培养到所需细胞量，取上清液样测定其鼠β_防御素的含量，达到标准即为合格上清液，可以收集用于后续应用。
[0038]3.2上清液处理:细胞生长48小时后，轻轻收取上清液(因杂交瘤细胞贴壁不牢固，收上清液时振动过大，易使细胞大量悬浮于上清液中影响后续操作)，1800转/分以上的转速离心10分钟，取上清，0.22um滤膜过滤，滤液用作预防仔猪腹泻病的实施样品。
[0039]3.3试验猪的选择:在仔猪腹泻病流行猪场，选取同日出生的仔猪10窝，分为实验组和对照组，试验组猪在出生后第3日-第7日间，每日上午给每头仔猪灌喂处理后的GCLP细胞上清液10ml，对照组行常规饲养。观察统计2组仔猪的腹泻发病情况和死亡情况。按照上述方法，分别于2013年12月和2014年2月间在武汉某猪场试验，结果显示:实验组仔猪腹泻发生率和因腹泻而至的死亡率分别为3%和2%。而对照组仔猪腹泻发生率和死亡率则分别为87%和76%。试验期间，该猪场其他猪群的仔猪腹泻病发病率、死亡率与本试验的对照组基本相当，这说明本实验所使用的GCLP细胞培养上清液对初生仔猪腹泻病具有良好防控作用。
【权利要求】
1.一株杂交瘤细胞株，其特征在是:该细胞株由小鼠空肠的潘氏细胞与SP2/0细胞杂交融合而得，能在细胞培养条件下持续性传代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子，该细胞是小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2014195。
2.制备权利要求书I中所述的小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的方法，该方法包括如下步骤: (O小鼠空肠消化道内膜细胞消化分离:将小鼠空肠取下后，用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胶原酶的混合物进行消化，充分消化后用细胞培养液将消化离散的内膜细胞冲洗出来，配制成合适密度的细胞悬液； (2)细胞融合:细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0等量混合，用PEG作融合剂，常规方法融合，在用Raw264.7细胞制作的饲养细胞层上接种融合细胞，用HAT作筛选培养基，获得消化道内膜细胞杂交细胞株； (3)融合细胞株的分离培养与筛选:用细吸管吸出不同的融合细胞株克隆，分别培养于铺有Raw264.7细胞饲养细胞层的培养孔中进行连续传代，进行荧光桃红染色，留下那些染色阳性的细胞克隆继续培养，经CK-18抗体的潘氏细胞特异性抗原检测鉴定，选留具有潘氏细胞特异性抗原的融合细胞株株作为小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株继续培养并保存，建成小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株。
3.权利要求1中所述的小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株在抗菌药物生产中的应用。
【文档编号】A61P31/00GK104388391SQ201410578367
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】高其双, 程百炼, 卢顺, 曹庭球, 陈志华, 周刚, 彭霞, 周莉 申请人:武汉市工程科学技术研究院