慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体编码基因slc10a1的新突变蛋白、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种乙肝病毒和丁肝病毒肝细胞受体的编码基因 SLC10A1 的突变株、突变蛋白及其在乙肝病毒和丁肝病毒感染及相关肝衰竭中的预防或治疗上的应用。 SLC10A1 基因的突变蛋白是在SLC10A1蛋白的氨基酸序列的第267位由丝氨酸突变为苯丙氨酸。根据该突变蛋白及其编码基因，可以建立基于 SLC10A1 基因及其突变体的诊断试剂盒。而且由于这一变异阻碍乙肝病毒或丁肝病毒进入肝细胞，故有产生预防及治疗乙肝或丁肝的相应新药物的应用前景，本研究也提示 SLC10A1 基因的其它突变也可能有预防和治疗乙肝和丁肝的应用前景。
【专利说明】慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体编码基因SLC10A1的 新突变蛋白、编码基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程以及医学【技术领域】，具体涉及到一种慢性乙型和丁型肝炎病 毒肝细胞受体编码基因51^7似7的新突变蛋白、编码基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 慢性乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV)感染而引起的以肝脏损害为主要表 现的传染性疾病，是关系到我国乃至全球公共卫生的重大疾病。乙肝病毒通过乙肝病毒肝 细胞受体进入肝细胞从而引发感染，因此该受体发生变异会干扰乙肝病毒与其发生结合， 从而阻止乙肝病毒进入肝细胞。而且丁肝病毒和乙肝病毒共用同一肝细胞受体，因此慢性 乙型肝炎病毒肝细胞受体变异也有阻止丁肝病毒进入肝细胞的作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体编码基因5ZC7似2的 突变株及其突变蛋白在乙肝、丁肝及相关肝衰竭的预防和治疗上的应用。
[0004]本发明要求保护的内容是以慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因 5ZC7似7的突变基因及其编码的突变蛋白作为研究基础，在乙型病毒性肝炎及丁型病毒性 肝炎及其相关肝衰竭的预防和治疗的应用中产生的任何新药物和新方法 一种慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5167似7的突变蛋白，是在慢性 乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似7蛋白的氨基酸序列的第267位由丝氨 酸突变为苯丙氨酸，本发明中用P.Ser267Phe表示。所述慢性乙型及丁型肝炎病毒肝细胞 受体的编码基因5ZC7似i的突变蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0005] 上述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的突变蛋白的编 码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0006]慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的突变蛋白在制备慢 性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
[0007]慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的突变蛋白的编码基 因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
[0008] 由慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的突变蛋白及突变 蛋白的编码基因制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂方案如下所示： 一种慢性乙型或丁型病毒性肝炎检测试剂盒，由以下成分组成：引物（引物核苷酸序列 如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示)，PCR反应液，PCR产物纯化盒和测序反应液。所述PCR 反应液为溶解了TagDNA聚合酶、dNTPs、镁离子(如MgCl2)、PCR反应缓冲液(如lOXTaq Buffer)。以上试剂均可直接购买相应商品，如（10mM)dNTPs购自上海生工生物工程技术 服务有限公司；TagDNA聚合酶及其配套的lOXTaq1?1^€61'、]\%(]12购自？61'11161^38公司。 各试剂的用量及浓度均为本领域常规值，如lu/yLTagDNA聚合酶1yL、2mmol/L的dNTP (即浓度均为 2mmol/L的4 种dNTP的混合物)3iiL、25mmol/LMgCl23iiUlOXTaqBuffer(内含（順4)2504)31^、灭菌(1(11120 17111。
[0009] 所述PCR产物纯化盒为纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell; 所述纯化PCR产物的溶液为：lu/iiL奸碱性磷酸酶（SAP,可购于Fermentas公 司）0.61^、2〇11/111^外切酶（￡1〇1，可购于？61'11161^38公司）0.15111^和灭菌(1(11120 1. 25-1. 75yL，或按上述比例配制的其他体积的混合液。纯化PCR产物的溶液优选 2~2, 5uL〇
[0010] 所述测序反应液为BigDye(购自ABI公司）和5XSequencebuffer(购自ABI 公司）的混合液，BigDye和5XSequencebuffer的体积比优选为1:2,如liiLBigDye与 2iiL5XSeqUenCebuffer混合。上述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，优选的引物核苷酸 序列如SEQIDN0:3和SEQID勵:4所示，引物浓度都为3.211111〇1/1。
[0011] 本发明是通过对"相对极端性状的"99例慢性乙肝患者及90例未注射过乙肝疫 苗正常对照进行全外显子组测序，通过生物信息学分析及进一步的数据筛选找到最有可能 的候选基因；然后在对所找到的候选基因进行大样本量的病例-对照(其中慢性乙肝患者 1899例，未注射乙肝疫苗正常对照1828例)相关关系研究中证实慢性乙型肝炎病毒肝细胞 受体的编码基因51^7似7的突变p.Ser267Phe及其编码的突变蛋白有抵抗慢性乙型病毒性 肝炎及肝衰竭的作用。同时，我们对突变蛋白的的结构分析也证实这一突变干扰乙肝病毒 与其肝细胞受体的结合，从而有阻止乙肝病毒进入肝细胞的作用。
[0012] 本发明的人5ZC7似2基因核苷酸全长序列(包含突变位点)通常是用聚合酶链式反 应（PCR)进行。对于PCR扩增法，可根据5ZC7似7基因的核苷酸序列，进行引物设计，并以 所检测的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作为模板，扩增目的序列。最后通过测序反应检 测及确定相关基因的突变。
[0013] 与现有研究相比，本发明具有以下有益效果： 本发明首次在临床病例中证实51^7似7变异株及其编码的突变蛋白有抵抗慢性乙型 病毒性肝炎及相关肝衰竭的作用。由于这一变异妨碍乙肝病毒进入肝细胞，故有产生预防 及治疗乙肝的相应新药物新方法的应用前景，且由于乙肝病毒及丁肝病毒共用同一肝细 胞受体，故这一发现同样也适用于丁肝病毒感染的预防及治疗药物及其它疗法的开发及应 用。本研究也提示51^7似7基因的其它突变也可能有预防和治疗乙肝和丁肝的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为5ZC7似2基因的部分测序结果，其中上部为5ZC7似7野生型的测序结果，中 部为5ZC7似7p.Ser267Phe杂合性突变的测序结果，下部为5ZC7似7p.Ser267Phe纯合性突 变的测序结果；箭头所示为突变位点。
[0015] 图2为5ZC7似7p.Ser267Phe突变型蛋白整体的结构模拟图。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试 齐U、方法和设备。
[0017] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0018] 实施例1 一、病例收集：来自中山大学附属第三医院传染科的1899例慢性乙型肝炎患者和来自 中山大学附属第二医院的1828例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者， 在取得上述患者、自愿者及家属知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中备用。用Qiagen 公司生产的QIAamp DNABlood Mini Kits(试剂盒)从抗凝外周血中提取DNA(具体提取步 骤参考产品说明书)，TE溶解，-80°C保存备用。
[0019] 二、5ZC7似2基因的突变检测： 5ZC7似7基因的mRNA序列来自Genbank(NM_003049)。Genomic DNA序列来自UCSC数 据库（http: //genome, ucsc. edu/)和Ensembl数据库（http: //asia. ensembl. org/index. html)。
[0020] 检测步骤如下所示： 1、PCR扩增： ?〇?反应体积为301^:10父丁&9 811打61<内含（順4)2504)3111，25111111〇1/1]\%(：123111，2臟〇1/1(1阶13混合物3111，3.211111〇1/1上、下游引物各1111，111/1111&9〇嫩聚合酶 1 U L，实施例1提取的DNA模板1 y L，灭菌ddH20补足体积至30 y L。
[0021] PCR反应条件：95°C预变性3min;95°C30s，引物特异性退火温度lmin，72°C 45s，36个循环；最后72°C延伸10min。
[0022] 检测5ZC7似2基因突变位点的上游引物P1和下游引物P2序列为： P1 :5' - CCATCTGCTGCGAAACTC -3'； P2 :5' -GGGCTACCTGGTTCTTAGTGA -3'； 2、 测序反应方案： ①预反应：反应体积共3iiL:lu/iiL虾碱性磷酸酶（SAP)0.6iiL、20u/iiL外切酶 (￡叉〇1)0.1(?61'11161^38公司）、？0?产物0.5-1.〇11]^、灭菌(1(11120补足体积至311]^。反应 混合物在PCR仪上反应，37°C温浴15min，85°C15min灭活酶。反应完毕后反应混合物直 接作为测序反应的模板用。
[0023] ②测序反应：用ABI公司的96孔板，在GeneAmp9700PCR仪上进行。反应体积 共 10iiL:3iiL的预反应产物、2iiL的 5XSequencebuffer(ABI公司）、liiL的BigDye (八81公司）、11^的引物（3.211111〇1/1)，31^的灭菌(1(11120。反应条件 ：981：2111111;961： 10s，50°C5s，60°C4min，30 个循环；最后 4°C保存。
[0024] ③测序纯化：直接在96孔板上进行。
[0025]a)测序反应完毕后，配无水乙醇6mL+3mol/L醋酸钠（pH5. 2) 240 iiL混合溶液 (即无水乙醇：醋酸钠体积比=25:1)，每个样品中加入50 iiL混合溶液。用锡箔纸封闭，并 振荡混匀。
[0026]b)将测序产物放于_20°C避光静置20min以上。
[0027]c) 2CTC，3700rpm离心 30min。
[0028]d)倒去上清液，倒扣在四层吸水纸上，360rpm离心10s。
[0029] e)配75%乙醇(无水乙醇7.5mL+ddH20 2.5mL混合溶液的比例)，每个样品中加 入90yL混合溶液。用锡箔纸封闭，并振荡混匀。
[0030]f)将测序产物放于-20°c避光静置20min以上。
[0031]g) 2CTC，3700rpm离心 30min。
[0032] h)倒去上清液，倒扣在四层吸水纸上，360rpm离心10s。
[0033] i)室温通风处，避光晾干，30min以上。
[0034]j)每个样品中加ddH2010iiL，用锡箔纸封闭，振荡后离心。
[0035]k)待测样品放于4°C避光静置1.5h以上，以充分溶解，上ABI3730测序仪进行 测序。
[0036] 三、测序结果分析：用ABI序列分析软件进行分析：发明人对自中山大学附属第 三医院传染科的1899例慢性乙型肝炎患者和来自中山大学附属第二医院的1828例未注射 乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者进行51^7似7基因的突变检测。
[0037] 结果如下：突变位点：5ZC7似2基因氨基酸序列的第267位由丝氨酸突变为苯丙氨 酸，也可表示为p.Ser267Phe，突变后的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。其中有149例患 者和348例正常对照存在杂合性突变。5例患者和26例正常对照存在纯合性突变，在1899 例病例和1828例对照研究中，其风险等位基因的个数分别是159个和400个，优势比值（0R 值）为0. 36,P值为5. 7X1(T23。多基因遗传病的研究中，通常是通过关联分析来确定其风 险基因的，本实验结果中，P值有非常显著差异，且0R值为0.36,说明该突变基因有抵抗乙 型慢性病毒性肝炎和相关肝衰竭的作用。测序结果见图1。
[0038] 实施例2 5ZC7似7p.Ser267Phe突变型蛋白结构预测：用theprogramPyMol(http://pymol.org) >DiscoveryStudio3. 0(AccelrysInc.)、theprogramsMultAlin(CorpetF. Multiplesequencealignmentwithhierarchicalclustering.Nucleic.Acids. Res. 1988; 16，10881-10890)及ESPript软件（GouetP,RobertX，CourcelleE. ESPript/ENDscript:Extractingandrenderingsequenceand3Dinformationfrom atomicstructuresofproteins.Nucleic.Acids.Res. 2003; 31，3320-3323)预测 5ZC7似7p.Ser267Phe突变型蛋白的结构及功能域。
[0039] 蛋白质结构预测结果见图2。对5ZC7似7基因编码的蛋白质结构域的预测，该 蛋白包括两个结构域：核心区和嵌板区，这两个域之间的相对运动形成inward-open或 outward-open结构。这表明核心结构域的刚体旋转可能促进胆汁酸的运送，在我们野生型 NTCP蛋白的outward-open结构中，我们发现第267位氨基酸位于跨膜结构域9b中（TM9b), 并特定位于配体迁移通路的表面。同时这个模型也表明，在NTCP蛋白中，267位氨基酸非常 靠近157-165氨基酸残基所组成的乙肝病毒感染所必须的结构域。此外，亲水性的丝氨酸 突变为了大的疏水性的苯丙氨酸后，可能会影响NTCP与配体的结合。
[0040] 实施例3 5ZC7似7基因突变检测试剂盒的制备。
[0041] 一、试剂盒成分如表1所示。
[0042]表1
【权利要求】
1. 一种慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似7的新突变蛋白，其特 征在于，在慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体基因51^7似7蛋白的氨基酸序列第267位 由丝氨酸突变为苯丙氨酸；所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因51^7似7 的新突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 权利要求1所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的新突变 蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. 权利要求1所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的新突变 蛋白在制备预防或/和治疗乙型或丁型肝炎及其相关肝衰竭药物中的应用。
4. 权利要求2所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似7的新突变 蛋白的编码基因在制备预防或/和治疗乙型或丁型肝炎及其相关肝衰竭药物中的应用。
5. 权利要求1所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似2的新突变 蛋白在制备慢性乙型或丁型肝炎的检测试剂中的应用。
6. 权利要求2所述慢性乙型和丁型肝炎病毒肝细胞受体的编码基因5ZC7似7的新突变 蛋白的编码基因在制备慢性乙型或丁型肝炎的检测试剂中的应用。
7. -种慢性乙型或丁型病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，由以下成分组成：核苷 酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的引物，PCR反应液，PCR产物纯化盒和测序反 应液； 所述PCR反应液为溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子的PCR反应缓冲液；所述PCR 产物纯化盒由纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell组成，所述纯化PCR产物的溶液 为lu/ y L虾碱性磷酸酶、20u/ y L外切酶Exo I和灭菌ddH20的混合液；所述测序反应液为 BigDye 和 5XSequence buffer 的混合液。
8. 根据权利要求7所述慢性乙型或丁型病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述引 物的浓度分别为3.2iimol/L。
【文档编号】A61K38/16GK104387457SQ201410586449
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】王一鸣, 高志良, 赵强, 彭亮, 胡彬, 王俊, 李奇斌, 廖启军 申请人:中山大学