一种细胞核靶向放疗增敏剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种细胞核靶向放疗增敏剂及其制备方法，其具有核/壳空腔介孔氧化硅结构，包括：具有空腔的介孔氧化硅外壳、位于所述介孔氧化硅外壳的空腔中的作为内核的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、装载于所述介孔氧化硅外壳的空腔中的放疗增敏药物、以及共价链接于所述介孔氧化硅外壳的表面的细胞核靶向配体。本发明的细胞核靶向放疗增敏剂可以实现针对恶性肿瘤细胞核的磁共振/上转换发光双模式精确诊断以及化疗/放疗高效协同治疗，有望达到最佳的诊疗效率。
【专利说明】一种细胞核靶向放疗增敏剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞核靶向放疗增敏剂及其制备方法，属于纳米生物医学领域。具体说，这种核靶向放疗增敏剂是一种尺寸在50nm以下的核/壳空腔介孔氧化硅结构。其内核钆掺杂上转换荧光颗粒可以实现针对肿瘤病灶区的磁共振/上转换发光双模式成像诊断；介孔孔道和空腔可以装载高效破坏DNA功能的放疗增敏药物丝裂霉素MMC，从而实现细胞核内的放疗增敏，大幅度提高化疗/放疗协同治疗的效果，有望达到最佳的诊疗效率。
【背景技术】
[0002]目前，临床上普遍采用化疗和放疗治疗癌症，但往往收效甚微，其原因在于大多数肿瘤存在多药耐药性以及耐放射性，从而严重降低药物和高能X射线治疗癌症的效果。因此，如何充分发挥化疗和放疗之间协同作用以克服肿瘤的耐药性和耐放射性，成为一个亟待解决的难题。众所周知，只有药物进入细胞核并且破坏核内的DNA，才能真正杀死癌细胞，所以开发一种具有细胞核靶向功能的药物载体，将化疗药物直接运输到细胞核内，将会显著提高化疗疗效。此外，如果放疗增敏药物进入细胞核之后，必将会在细胞核内显著增强X射线损伤DNA的效率，大幅度提高放疗的效果。因此，我们提出一种“细胞核内放疗增敏”的概念，旨在将放疗增敏药物直接运输至细胞核内，从而大幅度增强药物和X射线协同损伤DNA的疗效，将有望克服肿瘤多药耐药性等诸多难题，为癌症患者早期的高效治疗提供借鉴性思路。
[0003]高效的协同治疗离不开癌症早期的精确诊断。只有先利用影像技术(如:发光、PET、CT扫描、磁共振(MRI)成像等)寻找可疑的病灶区，加以精确定位，才便于及早实施高效治疗。然而目前临床采用的多是单一成像模式，这无疑存在很多缺陷，导致诊断效果较差，诊断出的癌症患者多数属于中晚期，错过了最佳的治疗时期。CT和MRI成像虽然具有很高的空间分辨率，但灵敏度较低；而PET和发光成像与之相反，具有很高的灵敏度高，但空间分辨率较低。因此，亟待开发一种多模式成像探针，整合不同成像模式之间的优势，实现针对癌症早期的高效诊断，以便患者及早高效治疗。近年来发展的上转换荧光纳米颗粒，由于具有生物毒性低、穿透深度大、自发荧光少、信噪比高等优点，被广泛认为是具有良好应用前景的新型上转换荧光探针。此外，掺杂钆离子又可以同时引入Tl-MRI加权成像，因此，钆掺杂上转换荧光纳米颗粒可以作为一种新型的磁共振/上转换发光双模式成像探针，同时具有较高的空间分辨率和灵敏度，有助于精准定位肿瘤的位置。
【发明内容】
[0004]基于当前严峻的癌症形势以及未来纳米生物医学发展的趋势，本发明的目的是提供一种细胞核靶向放疗增敏剂，克服目前癌症诊疗领域中出现的成像模式单一、药物靶向输运效率低、化疗与放疗间缺乏协同作用等不足，以实现针对恶性肿瘤细胞核的磁共振/上转换发光双模式精确诊断以及化疗/放疗高效协同治疗，显著提高化疗/放疗协同高效破坏DNA的效果，有望在未来癌症早期的诊疗领域发挥积极作用。
[0005]在此，一方面，本发明提供一种细胞核靶向放疗增敏剂，其具有核/壳空腔介孔氧化娃结构，包括:具有空腔的介孔氧化娃外壳、位于所述介孔氧化娃外壳的空腔中的作为内核的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、装载于所述介孔氧化硅外壳的空腔中的放疗增敏药物、以及共价链接于所述介孔氧化硅外壳的表面的细胞核靶向配体。
[0006]本发明的细胞核靶向放疗增敏剂中，内核是钆掺杂上转换荧光纳米颗粒，既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis、NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提高癌症的确诊率。
[0007]本发明的细胞核靶向放疗增敏剂中，空腔介孔氧化硅结构可以装载具有高效破坏DNA功能的放疗增敏药物，在发挥化疗功效的同时原位协同增强放疗对乏氧肿瘤的杀伤作用，从而实现高效的化疗/放疗双模式协同治疗。
[0008]本发明的细胞核靶向放疗增敏剂中，嫁接于空腔介孔氧化硅结构的外表面的细胞核靶向配体赋予其核靶向输运药物的功能，从而直接在细胞核内实现放疗增敏，大幅度提高化疗/放疗协同治疗的效果。
[0009]因此，本发明的细胞核靶向放疗增敏剂可以实现针对恶性肿瘤细胞核的磁共振/上转换发光双模式精确诊断以及化疗/放疗高效协同治疗，有望达到最佳的诊疗效率。
[0010]较佳地,所述介孔氧化娃外壳的外径为44?50nm,内径为32?38nm,孔径为2?4nm。通过使细胞核靶向放疗增敏剂具有合适的外径，从而使其能够高效地穿越细胞核核膜上的核孔，进入细胞核；此外，还可以减少免疫系统(RES)的吞噬。通过使介孔氧化硅具有合适的孔径，从而可以有利于放疗增敏药物的装载。
[0011]较佳地,所述礼掺杂上转换突光纳米颗粒的粒径为15?19nm。这样,可以使礼掺杂上转换荧光纳米颗粒内核和介孔氧化硅外层之间具有合适大小的空腔，有利于放疗增敏药物的装载。
[0012]较佳地，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd。其在980nm近红外光激发下，不仅可以发出可见光(红光、绿光和蓝光)，还可以发出紫外光和SOOnm近红外光，用于发光成像；此外，钆离子的引入又可以实现T1-MRI加权成像。
[0013]较佳地，所述放疗增敏药物为丝裂霉素、顺钼、和/或紫杉醇。具有高效破坏DNA功能的放疗增敏药物在高能X射线的照射下，实现细胞核内的放疗增敏，高效损伤DNA，大幅度提闻化疗/放疗协同治疗的效果。
[0014]较佳地，所述细胞核靶向配体为TAT多肽、SV40T抗原、和/或腺病毒。
[0015]另一方面，本发明还提供上述细胞核靶向放疗增敏剂的制备方法，包括以下步骤:
(1)采用反微乳液法在钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的表面包裹实心氧化硅层得到实心氧化硅层包裹的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒，或者用酸对钆掺杂上转换荧光纳米颗粒进行亲水改性得到亲水的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒；
(2)以表面活性剂为造孔剂，采用溶胶-凝胶法，在所得的实心氧化硅层包裹的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的外表面包裹介孔氧化硅层得到钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核-实心氧化硅层-介孔氧化硅层三层结构，或者在亲水的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的外表面包裹介孔氧化硅层得到钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核-介孔氧化硅层双层结构；
(3)以高分子量的聚合物PVP(Mw = 40000)为保护剂，采用高温热水刻蚀法，选择性刻蚀掉所得的三层结构中的实心氧化硅层，或者选择性刻蚀掉所得的双层结构中的部分介孔氧化硅层，得到在钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核与介孔氧化硅层之间形成空腔的空腔介孔氧化硅结构；
(4)在所得的空腔介孔氧化硅结构的外表面嫁接细胞核靶向配体；
(5)在所得的空腔介孔氧化硅结构的空腔内装载放疗增敏药物，即可制得所述细胞核靶向放疗增敏剂。
[0016]本发明的制备方法可以实现各层厚度的可控，使整体尺寸可以控制在50nm以下，并使空腔具有合适的大小，合成工艺简单易行、制备成本低、效率高。所制得的材料具有非常好的分散性、稳定性以及生物相容性，具有重要的研究意义和应用前景。
[0017]较佳地，在步骤(3)中，所述高温热水刻蚀法的温度为95?100°C，反应时间为3?4小时。本发明中，对于这种尺寸在50nm以下的纳米颗粒，不能用酸或碱进行刻蚀，只能用较温和的高温热水刻蚀。并且必须以高分子量的聚合物(例如PVP(Mw = 40000))作为保护剂，才能选择性刻蚀掉中间的实心氧化硅或部分介孔氧化硅。
[0018]较佳地，在步骤(4)中，通过末端带氨基的硅烷偶联剂将细胞核靶向配体与所述空腔介孔氧化硅结构进行共价键结合。
[0019]较佳地，在步骤(5)中，通过原位搅拌法将放疗增敏药物装载于空腔介孔氧化硅结构的空腔内。采用原位搅拌的方法和浓度梯度差扩散原理，将放疗增敏药物载入空腔中，有利于提闻载药量。
[0020]本发明将钆掺杂上转换荧光纳米颗粒有效地复合至空腔介孔氧化硅结构中，并且将整体尺寸控制在50nm以下，保证了良好的分散性和稳定性。通过嫁接细胞核核靶向配体(例如TAT)以及大量装载放疗增敏药物(例如丝裂霉素MMC)，从而得到一种具有细胞核靶向功能的放疗增敏剂。这种新型的细胞核靶向放疗增敏剂，既可以实现针对肿瘤的磁共振/上转换发光双模式高效诊断，又可以实现细胞核内的药物输运以及放疗增敏，大幅度提高化疗/放疗协同治疗的效果，有望为癌症早期的精确诊断与原位治疗提供更好、更有效的方案。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为尺寸在50nm以下的基于钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的空腔介孔氧化硅复合结构RUMSNs的合成示意图，其中的数字分别表示如下:1.实心氧化硅层的包裹；2.介孔氧化硅层的包裹；3.高温热水刻蚀；4.亲水改性；5.介孔氧化硅层的包裹；6.高温热水刻蚀；
图2为由RUMSNs制备细胞核靶向放疗增敏剂(RUMSNs-TAT-MMC)的合成示意图，其中Extracellular表示细胞外，Cytoplasm表示细胞质，Nucleus表示细胞核；
图3为本发明的制备方法的一个示例的流程图；
图4为RUMSNs的合成过程中每步产物的TEM照片。^1) UCNPs ； (b2) UCNPsiS12 ； (b3)UCNPsiSi02imSi02 ； (b4) RUMSNs ； (C1)UCNPs ； (c2) ligand-free UCNPs ； (c3) UCNPsimS12 ；(c4) RUMSNs ；
图5为嫁接细胞核靶向配体TAT的材料RUMSNs-TAT以及未嫁接TAT的材料RUMSNs分别与MCF-7癌细胞共培养24h后进入细胞核的2D&3D共聚焦成像图，其中(a_c)代表嫁接细胞核靶向配体TAT的材料RUMSNs-TAT，以及(f_h)代表未嫁接TAT的材料RUMSNs，其中Extracellular表示细胞外，Cytoplasm表示细胞质，Nucleus表示细胞核；
图6为荷瘤小鼠体内尾静脉注射(a「a3) RUMSNs以及(a4_a6) RUMSNs-TAT之后肿瘤区域的(a)I\-MRI成像图以及(b)信号强度对比图；
图7为MCF-7癌细胞经过不同模式治疗后的(a)存活率评价以及(b)活性氧自由基ROS表征；
图8为MCF-7癌细胞经过不同模式治疗后的DNA损伤(彗星实验)表征:(I)control (对照)，(2)MMC, (3)RUMSNs-MMC, (4)RUMSNs-TAT-MMC, (5)RT(放疗)，(6)MMC+RT, (7)RUMSNs-MMC+RT, and(8)RUMSNs-TAT-MMC+RT ；
图9荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后(a)半个月内肿瘤体积的变化曲线以及(b)第15天的肿瘤相对体积；
图10为荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后的肿瘤组织切片分析:(a)COntix)l，(b)RUMSNs-MMC, (c)RUMSNs-TAT-MMC, (d)RT, (e)RUMSNs-MMC+RT, and(f)RUMSNs-TAT-MMC+RT ；图11为将RUMSNs和RUMSNs-TAT通过尾静脉注射入小鼠体内30天后的全血指标评价:
(a)肝功能指标包括:丙氨酸转氨酶(ALT)，天门冬氨酸转氨酶(AST)，以及血清碱性磷酸酶(ALP);肾功能指标包括(b)尿素氮(BUN)以及(c)肌氨酸酐(CREA);血液指标包括:(d)红细胞(RBC)，(e)白细胞(WBC)，(f)血红蛋白(HGB)，(g)红细胞平均体积(MCV)，(h)红细胞平均血红蛋白量(MCH)，(i)红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，(j)血细胞压积(HCT)，(k)平均红细胞体积(RDW)，(I)平均红细胞体积分布宽度(RDW-SD)；
图12为将RUMSNs和RUMSNs-TAT通过尾静脉注射小鼠体内30天后的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的生理组织切片。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0023]本发明一方面提供一种细胞核靶向放疗增敏剂，参见图2中的RUMSNs-TAT-MMC，其包括核/壳空腔介孔氧化硅结构(RUMSNs)、连接于核/壳空腔介孔氧化硅结构的表面的细胞核靶向配体(在图2的示例中为TAT)、以及装载于核/壳空腔介孔氧化硅结构的空腔中的放疗增敏药物(在图2的示例中为MMC)。又，参照图1和图2，其中的核/壳空腔介孔氧化娃结构包括:具有空腔的介孔氧化娃外壳、以及位于所述介孔氧化娃外壳的空腔中的作为内核的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒(UCPNs)。
[0024]本发明的细胞核靶向放疗增敏剂中，核/壳空腔介孔氧化硅结构中的内核是具有钆掺杂上转换发光纳米颗粒UCNPs，在980nm近红外光激发下，不仅可以发出可见光(红光、绿光和蓝光)，还可以发出紫外光和SOOnm近红外光，用于发光成像；此外，钆离子的引入又可以实现Tl-MRI加权成像。因此，本发明的细胞核靶向放疗增敏剂既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis、NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提高癌症的确诊率。钆掺杂上转换发光纳米颗粒包括但不限于NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd。另外,礼掺杂上转换发光纳米颗粒的粒径可为15?19nm,例如19nm左右。
[0025]核/壳空腔介孔氧化娃结构中的外壳为介孔氧化娃。外壳的外径可为44?50nm。表面嫁接上细胞核靶向配体后，这种50nm以下的探针可以高效地穿越细胞核的核孔，靶向进入细胞核。外壳的内径可为32?38nm。S卩，内核和外壳之间的空腔的厚度可为5?7nm。这样可以装载需要量的放疗增敏药物。外壳的介孔孔道的孔径可为2?4nm。这样有利于放疗增敏药物的装载。
[0026]本发明中，空腔结构可以用来装载具有高效破坏DNA功能的放疗增敏药物，在发挥化疗功效的同时原位协同增强放疗对乏氧肿瘤的杀伤作用，从而实现高效的化疗/放疗双模式协同治疗。其中的放疗增敏药物的载药量可为7%?10%。又，所装载的放疗增敏药物可以根据需要选择，包括但不限于丝裂霉素、顺钼、紫杉醇。
[0027]核/壳空腔介孔氧化硅结构的外表面嫁接有细胞核靶向配体，赋予其核靶向输运药物的功能，从而直接在细胞核内实现放疗增敏，大幅度提高化疗/放疗协同治疗的效果。其中，细胞核靶向配体包括但不限于TAT多肽、SV40T抗原、腺病毒等。通过嫁接细胞核靶向配体，具有高效破坏DNA功能的放疗增敏药物可以被直接运输入细胞核，在高能X射线的照射下，实现细胞核内的放疗增敏，高效损伤DNA，大幅度提高化疗/放疗协同治疗的效果。
[0028]本发明将钆掺杂上转换荧光纳米颗粒复合至具有细胞核靶向功能的50nm以下的空腔介孔氧化硅结构中，可以实现细胞核靶向输运药物与磁共振/上转换荧光双模式成像功能的复合。另外，充分利用介孔孔道和空腔结构，实现放疗增敏药物的高效装载；其外表面修饰上细胞核靶向配体，有利于实现细胞核靶向输运药物。
[0029]图5为嫁接细胞核靶向配体TAT的材料RUMSNs-TAT以及未嫁接TAT的材料RUMSNs分别与MCF-7癌细胞共培养24h后进入细胞核的2D&3D共聚焦成像图，其中(a_c)代表嫁接细胞核靶向配体TAT的材料RUMSNs-TAT，以及(f_h)代表未嫁接TAT的材料RUMSNs。由图5可知，与肿瘤细胞共培养后，发现细胞核内出现了明显的上转换荧光信号，证明了本发明的细胞核靶向放疗增敏剂具有优异的细胞核靶向功能。
[0030]图6为荷瘤小鼠体内尾静脉注射(a「a3) RUMSNs以及(a4_a6) RUMSNs-TAT之后肿瘤区域的(a)T1-MRI成像图以及(b)信号强度对比图。由图6可知，本发明的细胞核靶向放疗增敏剂通过尾静脉注入小鼠体内后，肿瘤区域的磁共振信号明显增强，有利于精确定位肿瘤的位置。
[0031]图7为MCF-7癌细胞经过不同模式治疗后的(a)存活率评价以及(b)活性氧自由基ROS表征。从图中可以看出，相比于其他治疗模式而言，细胞核内的放疗增敏RUMSNs-TAT-MMC+RT (放疗)可以产生更多的活性氧，使MCF-7癌细胞的存活率降到最低。
[0032]图8为MCF-7癌细胞经过不同模式治疗后的DNA损伤(彗星实验)表征:(I)control (对照)，(2) MMC, (3) RUMSNs-MMC, (4) RUMSNs-TAT-MMC, (5) RT, (6)MMC+RT, (7)RUMSNs-MMC+RT, and (8) RUMSNs-TAT-MMC+RT。从图中可以看出，相比于其他治疗模式而言，细胞核内的放疗增敏RUMSNs-TAT-MMC+RT产生更明显的彗星拖尾现象，造成更显著的DNA损伤。
[0033]图9为荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后(a)半个月内肿瘤体积的变化曲线以及(b)第15天的肿瘤相对体积。可以发现，相比于其他治疗模式而言，细胞核内的放疗增敏RUMSNs-TAT-MMC+RT使肿瘤在半个月内几乎不生长，表现更为明显的肿瘤生长抑制效果。
[0034]图10为荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后的肿瘤组织切片分析:(a)COntix)l(对照)，(b)RUMSNs-MMC, (c)RUMSNs-TAT-MMC, (d)RT, (e)RUMSNs-MMC+RT,and(f)RUMSNs-TAT-MMC+RT。可以发现，相比于其他治疗模式而言，细胞核内的放疗增敏RUMSNs-TAT-MMC+RT造成大面积的肿瘤细胞凋亡和坏死，表现出更好的治疗效果。
[0035]图11为将RUMSNs和RUMSNs-TAT通过尾静脉注射入小鼠体内30天后的全血指标评价:(a)肝功能指标包括:丙氨酸转氨酶(ALT)，天门冬氨酸转氨酶(AST)，以及血清碱性磷酸酶(ALP);肾功能指标包括(b)尿素氮(BUN)以及(c)肌氨酸酐(CREA);血液指标包括:(d)红细胞(RBC)，(e)白细胞(WBC)，(f)血红蛋白(HGB)，(g)红细胞平均体积(MCV)，(h)红细胞平均血红蛋白量(MCH)，(i)红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，(j)血细胞压积(HCT)，(k)平均红细胞体积(RDW)，(I)平均红细胞体积分布宽度(RDW-SD)。可以发现，小鼠的生化指标均正常，和对照组几乎一样，说明RUMSNs以及RUMSNs-TAT均具有良好的生物相容性。
[0036]图12为将RUMSNs和RUMSNs-TAT通过尾静脉注射小鼠体内30天后的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的生理组织切片。可以发现，RUMSNs和RUMSNs-TAT注入小鼠体内后，并没有对小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)造成明显损伤，对正常组织没有造成明显的毒副作用。
[0037]本发明还提供上述细胞核靶向放疗增敏剂的制备方法。图1示出其中的核/壳空腔介孔氧化硅结构(RUMSNs)的合成示意图；图2示出本发明的细胞核靶向放疗增敏剂的一个示例的合成示意图；图3为本发明的制备方法的一个示例的流程图。参见这些图可知，本发明的制备方法包括核/壳空腔介孔氧化硅结构(RUMSNs)的制备，以及在制得的核/壳空腔介孔氧化硅结构(RUMSNs)的表面嫁接细胞核靶向配体，并在其内部装载放疗增敏药物。
[0038]首先，参照图1和图3说明核/壳空腔介孔氧化硅结构(RUMSNs)的制备方法。核/壳空腔介孔氧化硅结构的制备主要包括:内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒内核的制备、介孔氧化硅外壳的包裹、以及内核和外壳之间的空腔的形成。其中空腔的形成可以通过两种方法实现:在内核和介孔氧化硅外壳之间引入实心氧化硅层后再将其刻蚀掉(参见图1中的步骤1、2、3);或者直接在内核外表面形成介孔氧化硅外壳并刻蚀掉内侧的部分介孔氧化硅(参见图1中的步骤4、5、6)。以下具体说明核/壳空腔介孔氧化硅结构(RUMSNs)的制备的一个示例。
[0039](I)内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒(UCNPs)的制备:采用高温热分解法，制备粒径尺寸为19nm左右的上转换荧光纳米颗粒NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd。即按照各种稀土离子掺杂的比例，称取相应的稀土离子氯化物作为前驱体。然后以氩气作为保护气，将稀土离子前驱体与油酸和十八烯搅拌，加热除水后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液后，接着搅拌(至少2小时，以使油酸前驱体与氢氧化钠和氟化铵充分混合)，甲醇除去后，升温至280?290度，进行高温热解反应1.5h。冷却至室温后，离心收集样品，分散在环己烷溶液中。此处以高温热分解法为例，但应理解，本发明并不限定内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒的制备，只要是能制得内核钆掺杂上转换发光纳米颗粒的方法均可。
[0040](2-1)实心氧化硅层的包裹(UCNPs@Si02):参见图1中的步骤I，采用反微乳液法，以C0-520作为表面活性剂，少量氨水作为催化剂，使用注射泵将稀释后的硅源TE0S，匀速加入到内核Gd-UCNPs的环己烷溶液体系中，反应36h后，滴加甲醇破坏反微乳液体系，随后离心收集样品，最后分散在去离子水中。通过采用反微乳液法，可以实现厚度可控的实心氧化硅层的可控制备。但应理解，实心氧化硅层的包裹方法不限于此，也可以采用其他公知的方法。
[0041]或者，也可以不进行实心氧化硅层的包裹，而直接将钆掺杂上转换发光纳米颗粒进行亲水改性，即可以采用如下步骤(2-2)。
[0042](2-2)UCNPs 的亲水改性(ligand-free UCNPs):参见图1 中的步骤 4，在 UCNPs 的环己烷/水混合体系中，滴加微量浓盐酸，充分搅拌后，环己烷中的UCNPs便转移到水相中，随后离心收集样品，最后分散在去离子水中。此处以浓盐酸为示例，但应理解，其它无机酸也是可以的。
[0043](3)介孔氧化硅层的包裹(UCNPs@Si02@mSi02或UCNPs@mSi02):参见图1中的步骤2或5，以表面活性剂CTAC作为造孔剂，少量TEA作为催化剂，往UCNPs@Si02或ligand-freeUCNPs的水溶液中，逐滴加入硅源TE0S，整个过程在80度水浴中进行。反应Ih后，离心收集样品，最后分散在去离子水中。此处的表面活性剂不限于CTAC，也可以是其它阳离子表面活性剂、或阴离子表面活性剂、嵌段共聚物表面活性剂。另外，此处采用溶胶-凝胶法，但应理解，也可以采用其它合适的方法。
[0044](4)空腔结构的引入(RUMSNs):参见图1中的步骤3或6，以高分子量的PVP(Mw =40000)作为保护剂，采用高温热水腐蚀工艺，将样品UCNPs@Si02@mSi02或UCNPs@mSi02加入到95?100度热水中，反应2.5?3小时后,冷却至室温,离心收集样品,最后分散在去离子水中。此处保护剂仅限于高分子量的PVP (Mw = 40000)。
[0045]图4为RUMSNs的合成过程中每步产物的TEM照片。(Id1)UCNPs ； (b2)UCNPsiS12 ；(b3)UCNPsiSi02imSi02 ； (b4) RUMSNs ； (C1)UCNPs ； (c2) ligand-free UCNPs ； (c3)UCNPsimS12 ；(c4) RUMSNs。从图中可以看出，每步合成的产物均呈现规则均一的球形，且具有非常好的分散性和稳定性，便于后续的生物学效应研究。
[0046]接着，参照图2和图3，在制得的RUMSNs的表面嫁接细胞核靶向配体，并在RUMSNs的内部装载放疗增敏药物。以下，细胞核靶向配体以TAT为例，放疗增敏药物以MMC为例，例如通过如下步骤(5)和步骤(6)制备细胞核靶向放疗增敏剂(RUMSNs-TAT-MMC)。
[0047](5)嫁接细胞核靶向配体(RUMSNs-TAT):首先利用氨基羧基结合反应，对细胞核靶向配体TAT进行氨基硅烷修饰；然后利用硅羟基键结合的原理，将TAT通过共价键结合的形式嫁接于RUMSNs的外表面。也可以是，先将RUMSNs的外表面氨基功能化，再通过共价键结合细胞核靶向配体。
[0048](6)装载放疗增敏药物丝裂霉素(RUMSNs-TAT-MMC):采用原位搅拌的方法和浓度梯度差扩散原理，将丝裂霉素MMC载入空腔中，有利于提高载药量。
[0049]本发明提供了一种具有细胞核靶向功能的放疗增敏剂，其结构主要是尺寸在50nm以下的基于钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的空腔介孔氧化硅，具有以下优点:(1)钆掺杂上转换发光纳米颗粒UCNPs (NaYF4:Yb/Er/Tm/Gd)作为内核，既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis、NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提高癌症的确诊率。(2)空腔和介孔孔道可以装载具有高效破坏DNA功能的放疗增敏药物丝裂霉素MMC，从而实现化疗/放疗协同治疗。(3)其外表面嫁接的细胞核靶向配体TAT赋予其核靶向输运药物的功能，从而直接在细胞核内实现放疗增敏，大幅度提高化疗/放疗协同治疗的效果(4)这种细胞核靶向放疗增敏剂可以实现针对恶性肿瘤细胞核的磁共振/上转换发光双模式精确诊断以及化疗/放疗高效协同治疗，有望达到最佳的诊疗效率。此外，本发明合成工艺简单易行、成本低、效率高，在纳米生物医学领域具有重要的研究意义和广阔的应用前景。
[0050]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0051]实施例1钆掺杂上转换荧光纳米颗粒UCNPs的制备
1.稀土氯化物的准备。分别称取 1.28mmol(388.3008mg)YCl3-6H20，
0.36mmol (139.4964mg) YbCl3-6H20, 0.04mmol (15.2684mg) ErCl3-6H20, 0.02mmol (5.5087mg)TmCl3,0.3mmol (79.083mg)GdCl3_6H20。这些粉末放置于同一个样品瓶中，然后用4mL去离子水溶解，转入10mL三口烧瓶中；
2.向三口瓶中加入15mL油酸，30mL十八烯，室温下搅拌lh。然后开始通5min氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程。先升温到80度，保持Ih或者更长时间(将自由水除尽)；随后升到120度，保持Ih ;然后升到156度左右，保持lh，获得黄色澄清液。停止加热，让体系自然降温至室温；
3.恥0!1(上海凌锋)-20011^，NH4F(Sigma)-296.3mg，用1mL甲醇溶解，超声加速分散。然后小心加入体系中。室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成。期间，将氩气撤去，塞住三口瓶；
4.2h后，体系开始进入除甲醇环节。同样是缓慢进行。先通5min氩气，然后升温到50度，Ih ;80?100度，lh。直到体系中看不见白色气泡为止，表明甲醇已除完。也可以升到120度，保持Ih ;确保甲醇基本去除干净；
5.甲醇除完之后。将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在280度左右，并保持1.5h。自然降至室温；
6.清洗过程:首先，向体系中加入20mL无水乙醇,搅拌30min。然后分装到两个50mL离心管中，用11000r/min,离心1min ;收集到略带黄色的产物(第一次)。随后，各加入5?1mL环己烧，小心摇晃，并超声，可以发现产物迅速溶解，得到浑浊溶液，然后加入15mL无水乙醇，超声约5min,离心收集(第二次)。重复清洗3?5次。最后产物用20mL环己烷分散，获得10mM内核。其TEM图参见图4中的(bj或(C1)，可以看出其粒径为19nm左右。
[0052]实施例2UCNPs外表面包裹实心氧化硅UCNPs@Si02
采用反微乳液法，实现实心氧化硅的包裹。ImL NP-5加入20mL环己烷中，磁力搅拌40min。1.5mL 10mM UCNPs的环己烷溶液加入到NP-5/环己烷体系中，无色透明，密封搅拌3h。0.14mL 30%氨水逐滴加入混合液，密封搅拌2h。0.16mL TEOS溶于Iml环己烷，以lmL/h的速率引入体系中。36h后，加入甲醇破坏反微乳液体系，搅拌30min后，离心收集，整个过程用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，最后分散在5mL去离子水中。产物的TEM图参见图4中的(b2)。
[0053]实施例3UCNPs外表面亲水改性ligand-free UCNPs 2.5mL 10mM UCNPs的环己烷溶液加入到5mL去离子水中，随后滴加20 μ L的浓盐酸，密封搅拌2h。UCNPs便从上层的环己烷转移到去离子水中，离心收集，整个过程用去离子水清洗并且超声分散，重复三次，最后分散在1mL去离子水中。产物的TEM图参见图4中的
(C。)。
[0054]实施例4UCNPs@Si02或ligand-free UCNPs外表面介孔氧化硅的包裹UCNPs@Si02@HiS12 或 UCNPs@mSi02
2g CTAC和0.02g TEA溶于20mL去离子水中，室温下搅拌1.5h。随后加入10mLUCNPs@S12或ligand-free UCNPs的去离子水溶液，继续搅拌1.5h。然后将整个反应体系转移到80度水浴中，逐滴加入200 μ L TE0S，反应Ih后立即取出来。之后先用乙醇反复清洗3遍，再将其溶于质量分数为Iwt %的NaCl的甲醇溶液中，室温下搅拌3h，整个过程持续3遍，直至CTAC完全除去为止。最后，将产物UCNPs@Si02@mSi02 (其TEM图参见图4中的(b3))或UCNPs@mSi02(其TEM图参见图4中的(C3))分散至1mL去离子水中。
[0055]实施例5空腔结构的引入RUMSNs
将 1mL UCNPs@Si02@mSi02 *UCNPs@mSi02 的去离子水溶液，加入到 1mL PVP (25mg/mL)的去离子水溶液中，搅拌0.5h后，升温至95度，反应3h后，用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，最后将产物RUMSNs分散在1mL去离子水中。其TEM图参见图4中的(b4)或
(。4)。
[0056]实施实例6细胞核靶向放疗增敏剂的构建RUMSNs-TAT-MMC
a.通过共价键嫁接核靶向配体TAT:将38mg EDC, 57mg NHS和200 μ g TAT溶解于8mL去离子水中，搅拌5分钟后，加入45μ L APTES，继续反应24h。然后逐滴加入2mLRUMSNs的去离子水溶液，继续反应24h后，用去离子水清洗三遍，最后，将产物RUMSNs-TAT分散在5mL去离子水中；
b.通过原位搅拌法装载丝裂霉素:将上述5mLRUMSNs-TAT的去离子水溶液，加入到5mL丝裂霉素的去离子水溶液(浓度为5mg/mL)中,避光搅拌24h后,离心收集最后的产物RUMSNs-TAT-MMC,干燥后备用。
[0057]实施例7细胞核靶向放疗增敏剂的磁共振/上转换荧光双模式成像性能表征:
体外表征:将一定浓度(400 μ g/mL)的RUMSNs-TAT或RUMSNs与MCF-7癌细胞共培养
24h后，然后用DAPI染色，进行共聚焦成像实验，结果见图5 ；
体内表征:将RUMSNs-TAT或RUMSNs通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内，测量肿瘤区域的磁共振信号强度变化，结果见图6。
[0058]实施例8细胞核靶向放疗增敏剂的化疗/放疗协同治疗性能表征:
体外表征:将MMC, RUMSNs-MMC或RUMSNs-TAT-MMC与MCF-7癌细胞共培养后，施加5Gy的X射线照射，观察各种治疗模式下细胞的存活率以及DNA损伤情况，结果见图7、8 ；
体内表征:将RUMSNs-MMC或RUMSNs-TAT-MMC通过尾静脉注入荷瘤小鼠体内，施加8Gy的X射线照射，每隔一天测量肿瘤的体积，结果见图9、10。
[0059]实施例9细胞核靶向放疗增敏剂的生物安全性评价:
将RUMSNs-TAT或RUMSNs通过尾静脉注入小鼠体内，30天后取血进行生化指标测试，解剖出主要的器官(心、肝、脾、肺、肾)进行生理组织切片测试。生化指标测试结果见图11，生理组织切片测试结果见图12。
【权利要求】
1.一种细胞核靶向放疗增敏剂，其特征在于，具有核/壳空腔介孔氧化硅结构，包括:具有空腔的介孔氧化硅外壳、位于所述介孔氧化硅外壳的空腔中的作为内核的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、装载于所述介孔氧化硅外壳的空腔中的放疗增敏药物、以及共价链接于所述介孔氧化硅外壳的表面的细胞核靶向配体。
2.根据权利要求1所述的细胞核靶向放疗增敏剂，其特征在于，所述介孔氧化硅外壳的外径为44?50nm,内径为32?38nm,孔径为2?4nm。
3.根据权利要求1或2所述的细胞核靶向放疗增敏剂，其特征在于，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的粒径为15?19nm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞核靶向放疗增敏剂，其特征在于，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4: Yb/Er/Tm/Gd。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞核靶向放疗增敏剂，其特征在于，所述放疗增敏药物为丝裂霉素、顺钼、和/或紫杉醇。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞核靶向放疗增敏剂，其特征在于，所述细胞核靶向配体为TAT多肽、SV40T抗原、和/或腺病毒。
7.—种权利要求1至6中任一项所述的细胞核靶向放疗增敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采用反微乳液法在疏水性钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的表面包裹实心氧化硅层得到实心氧化硅层包裹的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒，或者用酸对钆掺杂上转换荧光纳米颗粒进行亲水改性得到亲水的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒； (2)以表面活性剂为造孔剂，采用溶胶-凝胶法，在所得的实心氧化硅层包裹的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的外表面包裹介孔氧化硅层得到钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核-实心氧化硅层-介孔氧化硅层三层结构，或者在亲水的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的外表面包裹介孔氧化硅层得到钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核-介孔氧化硅层双层结构； (3)以分子量为40000的聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，采用高温热水刻蚀法，选择性刻蚀掉所得的三层结构中的实心氧化硅层，或者选择性刻蚀掉所得的双层结构中的部分介孔氧化硅层，得到在钆掺杂上转换荧光纳米颗粒内核与介孔氧化硅层之间形成空腔的空腔介孔氧化硅结构； (4)在所得的空腔介孔氧化硅结构的外表面嫁接细胞核靶向配体； (5)在所得的空腔介孔氧化硅结构的空腔内装载放疗增敏药物，即可制得所述细胞核靶向放疗增敏剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高温热水刻蚀法的温度为95?100 °C，反应时间为3?4小时。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，通过末端带氨基的硅烷偶联剂将细胞核靶向配体与所述空腔介孔氧化硅结构进行共价键结合。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，通过原位搅拌法将放疗增敏药物装载于空腔介孔氧化硅结构的空腔内。
【文档编号】A61K49/18GK104288790SQ201410587224
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】范文培, 步文博, 施剑林 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所