靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-1 RNAi复合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-1 RNAi复合物及其制备方法和应用，靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-1 RNAi复合物由H9-V9融合肽与高迁移率族蛋白-1 RNAi通过静电作用结合而成，H9-V9融合肽由H9肽的羧基端与V9肽的氨基端连接而成，该复合物可利用V9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性MCP-1受体，在V9肽与MCP-1受体作用的同时，HMGB1 RNAi高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的炎症反应，可用于制备治疗脑出血后小胶质细胞炎症损伤的药物，在脑出血的治疗领域有着良好的开发应用前景。
【专利说明】靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-1 RNAi复合物及其制 备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi 复合物，还涉及靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 炎症反应在介导脑出血（ICH)继发性损伤中具有重要作用，但启动环节尚不清 楚。已有研究表明，在脑出血引起神经损伤最终致死、致残的机制中有两个重要环节，一是 ICH早期血肿的机械压迫、占位效应，对脑组织结构破坏损伤。另一方面是血肿成分及代谢 产物的继发性神经损伤。但针对ICH早期物理性占位效应的血肿清除术治疗的大型临床试 验却未得到预期良好的临床效果，因此近年来ICH继发性损伤的机制及防治成为该领域研 究的热点问题。目前认为血肿成分激发的炎症反应在继发性神经损伤中具有重要作用而备 受关注。ICH后血肿周围小胶质细胞等炎性细胞激活，释放TNF-a、IL-I等致炎因子，加之 血脑屏障破坏，外周血单核巨噬细胞等炎症细胞向血肿周边区聚集，由此诱发炎症级联放 大反应，最终导致继发性脑损伤和神经功能缺损加剧。目前针对下游细胞因子等抗炎治疗 的临床试验结果并未显示出显著的神经保护效应。因此，深入探讨炎症级联反应的上游启 动环节及调节机制是脑出血炎症损伤的关键所在。
[0003] 高迁移率族蛋白-I (High-mobility group box 1，HMGB1)作为染色质绑定的核蛋 白，是最典型的损伤相关模式分子（damage-associated molecular pattern，DAMP)。在细 胞内，HMGBl扮演着染色质结合分子的作用，促进p53, p73, Rel/NF-icB，雌激素受体与特定 DNA靶点上转录蛋白结合。在细胞外，HMGBl通过与许多受体如晚期糖基化终产物（RAGE)、 Toll样受体（TLR)等结合，参与了多种生物学过程，如炎症、细胞迁移、细胞分化和肿瘤发 生。但是，HMGBl在小胶质细胞介导的脑出血的炎症损伤领域的应用未见报道。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-1 RNAi复合物；本发明的目的之二在于提供靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合 物的制备方法；本发明的目的之三在于提供靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复 合物的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物，由H9-V9融合肽与高迁移 率族蛋白-I RNAi通过静电作用结合而成，所述H9-V9融合肽由H9肽的羧基端与V9肽的 氨基端连接而成，所述H9肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述V9肽的氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示；所述高迁移率族蛋白-I RNAi的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0007] 2、所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物的制备方法，包括如下 步骤：在涡旋条件下，向含有高迁移率族蛋白-I RNAi和氯化钠的水溶液中滴加 H9-V9融合 肽溶液，滴毕，继续涡旋30?50分钟，再静置10?20分钟，即得靶向小胶质细胞的高迁移 率族蛋白-IRNAi复合物。
[0008] 优选的，所述高迁移率族蛋白-I RNAi与H9-V9融合肽的质量比为3:1。
[0009] 优选的，在涡旋条件下，向含有300 μ g/mL高迁移率族蛋白-I RNAi和100 μ g/mL 氯化钠的水溶液中滴加等体积浓度为100 μ g/mL的H9-V9融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡 旋30?50分钟，再静置10?20分钟，即得靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复 合物。
[0010] 3、所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物在制备治疗脑出血后小 胶质细胞炎症损伤的药物中应用。
[0011] 优选的，所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物在制备抑制小胶 质细胞炎症因子的药物中的应用。
[0012] 优选的，所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物在制备减轻脑出 血脑水肿的药物中的应用。
[0013] 优选的，所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-I RNAi复合物在制备提高脑出 血神经功能的药物中的应用。
[0014] 本发明的有益效果在于：本发明公开了靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-1 RNAi复合物，利用H9肽带正电荷，可通过静电作用与带负电荷的HMGBl miRNA聚合形成致 密颗粒，提高细胞对miRNA的摄取率，增强转染效率;MCP-I受体在中枢神经系统中主要在 小胶质细胞上表达，来源于MCP-I受体N末端的配体多肽V9可以阻断MCP-I受体结合生理 性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然 活性；因此本发明利用V9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性MCP-I受体，在 V9肽与MCP-I受体作用的同时，HMGBl RNAi高效转染入小胶质细胞，抑制HMGBl的表达和 小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的脑出血后的炎症反应，可用于制备治疗 由小胶质细胞介导的脑出血后的抗炎药物，在脑出血治疗领域有着良好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0016] 图1为透射电镜鉴定HMGBl RNAi复合物。
[0017] 图2为HMGBl RNAi复合物红细胞裂解液刺激小胶质细胞的HMGBl表达影响（1 : 对照；2 :HMGB1 RNAi)。
[0018] 图3为HMGBl RNAi复合物对红细胞裂解液刺激小胶质细胞分泌IL-8和TNF- α 的能力。
[0019] 图4为HMGBl RNAi复合物对脑出血小鼠脑水肿影响的检测。
[0020] 图5为HMGBl RNAi复合物对脑出血小鼠神经功能影响的检测。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 实施例1、靶向小胶质细胞的HMGBl RNAi复合物的制备
[0023] I、H9肽和V9肽的H9-V9融合肽的制备
[0024] H9-V9融合肽由H9肽的羧基端与V9肽的氨基端直接连接而成，其中H9肽的氨基 酸序列为 HHHHHHHHH(SEQ ID No. 1)，V9 肽的氨基酸序列为 LTQQVVMKF(SEQ ID No. 2)，形成 的 H9-V9 融合肽的氨基酸序列为 HHHHHHHHH-LTQQVVMKF(SEQ ID No. 3)。
[0025] H9-V9融合肽的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行，采用标准Fmoc方案。以 0. 25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP)树脂为起始树脂，按照H9-V9融合肽的氨基酸 序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割 液（由酒石酸乙二胺〇.25mL、三氟乙酸9.5mL和去离子水0.25mL组成）中，室温（18-25°C) 下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，然后用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温（18-25°C ) 下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用AKTA explorer 100增中压液相色谱仪进行纯 化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数0. 1 %的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数 0. 1 %的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0?15分钟内由 10%上升至50%，流速为1111171^11，收集!19,9融合肽的洗脱液，冷冻干燥，即得!19,9融 合肽，用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液，用孔径为0. 20 μ m的微孔滤膜过滤除 菌，-70°C冻存备用。
[0026] 取H9-V9融合肽溶液，用Delta600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱 为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数0. 1 %的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数 0. 1 %的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在0?15分钟内由 10%上升至60%，流速为lmL/min。结果经峰面积归一化法计算，H9-V9融合肽的纯度为 98%。另取H9-V9融合肽的洗脱液，用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，结果 显示，H9-V9融合肽的分子量实测值与理论值相符。
[0027] 2、HMGBl RNAi复合物的制备
[0028] 合成 HMGBl RNAi 的核苷酸序列，具体序列如下：5'-caagacgtaagaagaattattttct tcaaactgctt ctt_3'（SEQ ID No. 4)。
[0029] 于室温、涡旋条件下，向100 μ L含有浓度为300 μ g/mL的HMGBl RNAi和浓度为 100 μ g/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为100 μ g/mL的H9-V9融合肽溶液，滴 加完毕后，于室温（18_25°C )下继续涡旋30?50分钟，再静置10?20分钟，即得HMGBl RNAi复合物。将新鲜制备的HMGBl RNAi复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸 吸干，晾干30秒，以质量分数为1 %的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒， 80kV透射电镜观察，结果如图1所示。结果显示，所得HMGBl RNAi复合物呈大小均一的近 圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。该颗粒是由带正电荷的H9肽与带负电荷的HMGBl miRNA通过静电作用聚合形成致密颗粒；符合物中V9肽具有导向作用，特异靶向小胶质细 胞表面特异性MCP-I受体，在V9肽与MCP-I受体作用的同时，复合物高效转染入小胶质细 胞。
[0030] 同时，按照上述相同方法，以阴性对照（PBS)替代HMGBl RNAi，制得阴性对照复合 物。
[0031] 实施例2、靶向小胶质细胞的HMGBl RNAi复合物的抗炎效应研究
[0032] 1、红细胞裂解物处理后小胶质细胞HMGBl的检测
[0033] 将小胶质细胞于6孔板内单层培养至覆盖面积30%，换入无血清DMEM培养基 2mL，并加入HMGBl RNAi复合物100 μ L(加入后HMGBl RNAi复合物终浓度为1 μ g/mL)，培 养4小时，再换入完全DMEM培养基2mL，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得 HMGBl RNAi复合物转染的小胶质细胞。同时按照相同方法加入阴性对照复合物，作为对照 小胶质细胞。将10 μ L红细胞裂解液加入HMGBl RNAi复合物孵育的小胶质细胞或对照小 胶质细胞，然后在37°C条件下孵育24小时，用Western blotting (WB)法检测红细胞裂解液 刺激小胶质细胞HMGBl的表达，结果如图2所示。结果显示，HMGBl RNAi复合物孵育的小 胶质细胞HMGBl的表达少于对照小胶质细胞。
[0034] 2、红细胞裂解物处理后小胶质细胞的炎症因子的检测
[0035] 将小胶质细胞于6孔板内单层培养至覆盖面积30%，换入无血清DMEM培养基 2mL，并加入HMGBl RNAi复合物100 μ L(加入后HMGBl RNAi复合物终浓度为1 μ g/mL)，培 养4小时，再换入完全DMEM培养基2mL，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得 HMGBl RNAi复合物转染的小胶质细胞。同时按照相同方法加入阴性对照复合物，作为对照 小胶质细胞。将10 μ L红细胞裂解液加入小胶质细胞或对照小胶质细胞，然后在37°C条件 下孵育24小时，用ELISA法检测红细胞裂解液刺激小胶质细胞分泌IL-8和TNF- α的能力， 结果图3所示。结果显示，HMGBl RNAi复合物转染的小胶质细胞所分泌的IL-8和TNF-α 均少于对照小胶质细胞。
[0036] 3、脑出血小鼠的脑水肿的检测
[0037] 取25 μ L自体全血注射到小鼠基底节，10分钟后，并于相同部位注射HMGBl RNAi 复合物100 μ L或对照复合物。3天后，处死小鼠，取得脑组织，并用干湿重法检测小鼠的脑 水肿情况，结果如图4所示。结果显示，与对照组相比HMGBl RNAi复合物能明显减轻脑出 血小鼠的脑水肿。
[0038] 4、脑出血小鼠的神经功能的检测
[0039] 取25 μ L自体全血注射到小鼠基底节，10分钟后，并于相同部位注射HMGBl RNAi 复合物IOOyL或对照复合物。3天后，用神经功能评分法，观察小鼠的神经功能，结果如图 5所示。结果显示，与对照组相比HMGBl RNAi复合物能明显提高小鼠的神经功能。
[0040] 上述结果可以看出，本发明获得的HMGBl RNAi复合物具有抗脑出血的炎症损伤。
[0041] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1. 靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合物，其特征在于：由H9-V9融合肽与 高迁移率族蛋白-lRNAi通过静电作用结合而成，所述H9-V9融合肽由H9肽的羧基端与V9 肽的氨基端连接而成，所述即肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述V9肽的氨基酸序 列如SEQ ID No. 2所示；所述高迁移率族蛋白-lRNAi的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
2. 权利要求1所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合物的制备方法，其特 征在于，包括如下步骤：在涡旋条件下，向含有高迁移率族蛋白-lRNAi和氯化钠的水溶液 中滴加 H9-V9融合肽溶液，滴毕，继续涡旋30?50分钟，再静置10?20分钟，即得靶向小 胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合物。
3. 根据权利要求2所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合物的制备方法， 其特征在于：所述高迁移率族蛋白-lRNAi与H9-V9融合肽的质量比为3:1。
4. 根据权利要求2所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合物的制备方法， 其特征在于：在涡旋条件下，向含有300 y g/mL高迁移率族蛋白-lRNAi和100 y g/mL氯化 钠的水溶液中滴加等体积浓度为100 U g/mL的H9-V9融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋 30?50分钟，再静置10?20分钟，即得靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合 物。
5. 权利要求1所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋白-lRNAi复合物在制备治疗脑出 血后小胶质细胞炎症损伤的药物中应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋 白-lRNAi复合物在制备抑制小胶质细胞炎症因子的药物中的应用。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋 白-lRNAi复合物在制备减轻脑出血脑水肿的药物中的应用。
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述靶向小胶质细胞的高迁移率族蛋 白-lRNAi复合物在制备提高脑出血神经功能的药物中的应用。
【文档编号】A61P9/10GK104353081SQ201410604530
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】杨曌 申请人:重庆医科大学附属永川医院