制备小牛脾提取物的方法及在抗肿瘤和免疫调节中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了制备小牛脾提取物的方法及在抗肿瘤和免疫调节中的应用。所述小牛脾提取物的制备工艺为包括匀浆液的制备，利用复合酶的协同作用对匀浆液酶解、5'-磷酸二酯酶酶解和膜过滤，以及无菌过滤和灌装。本发明改进了小牛脾提取物的生产工艺，使提取物中多肽提取率提升到原工艺的2-4倍，核糖提取率提升到原工艺的1-3倍。其抗肿瘤活性和提高免疫力活力分别提升了30%和60%，并且该提取物制剂在体内外均可以抑制肿瘤的生长并且可以逆转放化疗引起的免疫抑制现象，该提取物还可以双向调节人体的免疫力，维持免疫系统的正常工作。因此，小牛脾提取物可用于制备抗肿瘤活性和免疫调节作用的药物或者与化疗药物联用组成组合制剂。
【专利说明】制备小牛脾提取物的方法及在抗肿瘤和免疫调节中的应用
[0001]
【技术领域】： 本发明公开一种制备小牛脾提取物的方法，同时还公开了小牛脾提取物在在抗肿瘤和 免疫调节中的应用，属于生物制药【技术领域】。
[0002] 技术背景： 小牛脾提取物是小牛脾提取物注射液的主要原料。目前，国内生产小牛脾提取物的制 备方法是物理提取法。如中国发明专利（CN201010257796.0)所公开的方法：取乳牛的脾 脏，用0.9%氯化钠溶液清洗，加入1-5倍量的生理盐水进行匀浆1?5次，胶体磨粒度 为2?8μπι ;将匀浆液-KTC?_30°C深冻，达到完全冻结后，取出放入20°C?50°C以下 水浴中解冻，完全融化后继续-KTC?-30°C条件下深冻，如此反复进行三次；将冻融后的 药液60°C?KKTC保温30-40分钟，速降温至KTC?20°C ;将上述溶液离心，离心速度为 3000-4000转/分，温度0?KTC以下，离心15-30分钟，收集上清液；分别用100000? 50000道尔顿、10000?9000道尔顿、8000?5000道尔顿的膜超滤；0.20 μ m滤芯无菌过 滤分装，即得提取物。但采用上述方法得到的提取物多肽和核糖含量较低，不能有效利用生 物资源间接增加生产成本。而利用胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶的协同作用以及使用 5'-磷酸二酯酶可以降低提取物中多肽分子量并显著增加多肽和核糖成分的含量。
[0003] 5' -磷酸二酯酶它是一类可将核酸定向水解为5' -核苷酸的酶制剂，现多用于从 细菌中提取核酸类物质以及分子生物学研究领域，本发明首次将5' -磷酸二酯酶应用于生 物医药领域即从动物组织中同时提取多肽及核糖。
[0004] 目前已经有研究表明小牛脾提取物无论是与化药联用或者单独使用在临床上都 表现出抗肿瘤活性，但是其单独给药的抗肿瘤活性并不高，故小牛脾提取物至今多作为肿 瘤放化疗的辅助治疗剂。
[0005] 小牛脾提取物对小鼠的不同免疫状态的免疫调节方面鲜有研究。经过本发明研究 内容证实，小牛脾提取物能显著增加正常小鼠腹腔巨噬细胞NO及TNF- α释放，小鼠脾脏T 细胞和B细胞增殖能力比原工艺提供高了 60%。此外，小牛脾提取物在用环磷酰胺建立的小 鼠免疫抑制模型中的治疗效果证明小牛脾提取物能够使低下的免疫功能恢复到正常水平， 也能够改善免疫刺激状态，维持机体的自稳，显示出具有双向免疫调节作用。
[0006]
【发明内容】
： 本发明提供一种小牛脾提取物，使提取物中多肽提取率提升到原工艺的2-4倍，核糖 提取率提升到原工艺的1-3倍。其抗肿瘤活性和提高免疫力活力分别提升了 30%和60%，并 且该提取物制剂在体内外均可以抑制肿瘤的生长并且可以逆转放化疗引起的免疫抑制现 象。
[0007] 本发明一种小牛脾提取物，是通过以下方法制备的： 1) 取乳牛的脾脏500g，用0. 9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗； 2) 按照小牛脾重量加入1-1. 2倍量的生理盐水进行匀浆1?5次，胶体磨粒度为2? 8 μ m ； 3) 按照物料重量的0. 7?2. 0%加入组合蛋白酶，其中胰蛋白酶，菠萝蛋白和酶胃蛋白 酶的质量比为2?2. 5 :1. 5?2. 5 :0. 5?2,搅拌均匀并将匀浆液取出放入50°C以下水浴 中升温至30°C?40°C保温30分钟； 4) 按照物料重量的0. 2?0. 5%加入5' -磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90°C 以下水浴中升温至60°C?70°C保温120分钟； 5) 保温结束后迅速降温至KTC?20°C ; 6) 将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0?5°C以下，离心10-20分 钟，收集上清液； 7) 分别用100000?50000道尔顿/10000?9000道尔顿、8000?5000道尔顿的膜超 滤； 8) 0. 20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物； 其中所述的组合蛋白酶为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶混合物，所述复合酶的质 量比为：胰蛋白酶2?2. 5份，菠萝蛋白酶1. 5?2. 5份，胃蛋白酶0. 5?2份。
[0008] 本发明所述的小牛脾提取物可在制备调节机体免疫功能的药物中的用途。
[0009] 本发明改进现有的小牛脾提取物的提取工艺及参数，利用复合酶的协同作用与 5' -磷酸二酯酶联合作用不仅大大提高产品中多肽和核糖的提取率还使所得提取物的抗肿 瘤活性和免疫调节功能显著增强；制备的小牛脾提取物中含21-35重量份多肽、1-2重量 份核糖，显著提升原材料的利用度、增加产品收率、提高产品的质量标准。
[0010] 发明的有益效果在于：利用复合酶的协同作用和5'-磷酸二酯酶酶解法处理小牛 脾提取物中间品，能够增加小牛脾提取物中多肽和核糖的收率，其中多肽含量较原工艺提 升了 216. 5-378. 6%，核糖浓度提升了 96. 6-296. 9%，提高原材料的利用率即增加产品收率， 降低生产成品本；提取物的抗肿瘤活性较原工艺提高了 30% ;提高该小牛脾提取物的免疫 调节活力，尤其实在提高免疫力方面，采用复合酶协同酶解法比物理法得到提取物其提高 免疫力的活力提1?了 60%;提1?药品的质量标准。
【具体实施方式】
[0011] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而 不用于限定本发明的范围。其中对照例1和对照例2再现专利CN201010257796. 0的制备 方法。
[0012] 实施例1 : 取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，用0.9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1倍量的生理盐水进行匀浆1次，胶体磨粒度为 2?8 μ m ;加入组合蛋白酶加入胰蛋白酶3. 57g，菠萝蛋白酶3. 57g，胃蛋白酶2. 86g份，搅 拌均匀并将匀浆液取出放入50°C以下水浴中升温至30°C保温30分钟；加入Ig的5' -磷酸 二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90°C以下水浴中升温至60°C保温120分钟；保温结束后 迅速降温至KTC ;将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0?5°C以下，离 心20分钟，收集上清液；分别用100000?50000道尔顿、10000?9000道尔顿、8000? 5000道尔顿的膜超滤；0.20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
[0013] 实施例2: 取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，用0.9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入I. 2倍量的生理盐水进行匀浆5次，胶体磨粒度 为?8μηι;加入胰蛋白酶1.75g份，菠萝蛋白酶1.31 g份，胃蛋白酶0. 44 g份，搅拌均勻 并将匀浆液取出放入50°C以下水浴中升温至40°C保温30分钟；加入2. 5g的5' -磷酸二 酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90°C以下水浴中升温至70°C保温120分钟；保温结束后迅 速降温至20°C ;将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0?5°C以下，离心 10分钟，收集上清液；分别用100000?50000道尔顿、10000?9000道尔顿、8000?5000 道尔顿的膜超滤；〇. 20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
[0014] 实施例3 : 取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，用0.9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时 以去除血水并漂洗；按照小牛脾重量加入1-1.2倍量的生理盐水进行匀浆3次，胶体磨粒 度为2?8μπι ;加入胰蛋白酶2g份，菠萝蛋白酶1.5 g，胃蛋白酶2g份，搅拌均匀并将 匀浆液取出放入50°C以下水浴中升温至40°C保温30分钟；加入I. 9g的5' -磷酸二酯酶， 搅拌均匀并将匀浆液放入90°C以下水浴中升温至65°C保温120分钟；保温结束后迅速降温 至15°C ;将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0?5°C以下，离心20分 钟，收集上清液；分别用100000?50000道尔顿、10000?9000道尔顿、8000?5000道 尔顿的膜超滤；〇. 20 μ m滤芯无菌过滤分装，即得提取物。
[0015] 对照例1 : 领取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，除去掉结缔组织和脂肪，用0.9%氯化 钠溶液清洗，加入3倍量的生理盐水进行匀浆，一般进行3次，胶体磨粒度为4μπι ;将 匀浆液放入冰库-20°C深冻，达到完全冻结后，取出放入30°C以下水浴中解冻，完全融化 后继续放入冰库，如此反复进行三次；将冻融后的药液70°C保温35分钟，速降温至15°C ; 将上述溶液离心，离心速度为3500转/分，温度5°C以下，离心20分钟，收集上清液； 分别用80000道尔顿、10000道尔顿、7000道尔顿的膜超滤；0.20 μ m滤芯无菌过滤分 装，即得注射液。
[0016] 对照例2 : 领取乳牛的脾脏（出生24小时以内）500g，除去掉结缔组织和脂肪，用0.9%氯化 钠溶液清洗，加入4倍量的生理盐水进行匀浆，一般进行5次，胶体磨粒度为3μπι ;将匀 浆液放入冰库30°C深冻，达到完全冻结后，取出放入40°C以下水浴中解冻，完全融化后继 续放入冰库，如此反复进行三次；将冻融后的药液80°C保温40分钟，速降温至20°C ;将上 述溶液离心，离心速度为3000转/分，温度4°C以下，离心30分钟，收集上清液；分别 用60000道尔顿、9000道尔顿、6000道尔顿的膜超滤；0.20 μ m滤芯无菌过滤分装，即 得提取物。
[0017] 以上实施例得到的提取物中各成分含量以及核酸纯度(核酸纯度由0D26(i/0D 28(i表 示）由表1体现。
[0018] 表1不同解法各种提取方法的提取结果
【权利要求】
1. 一种小牛脾提取物，是通过以下方法制备的： 1) 取乳牛的脾脏500g，用0. 9%氯化钠溶液清洗并浸泡12小时以去除血水并漂洗； 2) 按照小牛脾重量加入1-1. 2倍量的生理盐水进行匀浆1?5次，胶体磨粒度为2? 8 u m ； 3) 按照物料重量的0. 7?2. 0%加入组合蛋白酶，其中胰蛋白酶，菠萝蛋白和酶胃蛋白 酶的质量比为2?2. 5 :1. 5?2. 5 :0. 5?2,搅拌均匀并将匀浆液取出放入50°C以下水浴 中升温至30°C?40°C保温30分钟； 4) 按照物料重量的0. 2?0. 5%加入5' -磷酸二酯酶，搅拌均匀并将匀浆液放入90°C 以下水浴中升温至60°C?70°C保温120分钟； 5) 保温结束后迅速降温至10°C?20°C ; 6) 将上述溶液离心，离心速度为3000-4000转/分，温度0?5°C以下，离心10-20分 钟，收集上清液； 7) 分别用100000?50000道尔顿/10000?9000道尔顿、8000?5000道尔顿的膜超 滤； 8) 0. 20 y m滤芯无菌过滤分装，即得提取物； 其中所述的组合蛋白酶为胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和胃蛋白酶混合物，所述复合酶的质 量比为：胰蛋白酶2?2. 5份，菠萝蛋白酶1. 5?2. 5份，胃蛋白酶0. 5?2份。
2. 如权利要求1所述的小牛脾提取物可在制备调节机体免疫功能的药物中的用途。
【文档编号】A61K35/26GK104352521SQ201410615823
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】滕利荣, 贾东旭, 蔡广胜, 彭小君, 卢文倩, 逯家辉, 孟庆繁, 王迪, 滕乐生, 谢晶, 王贞佐, 刘艳 申请人:吉林大学