低氧依赖型x光动力学纳米光敏剂及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂及其制备方法与应用，所述低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂包括：能将高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体颗粒、包裹于所述纳米闪烁晶体表面的二氧化硅层、负载于所述二氧化硅层的外表面的氧化锌纳米颗粒、以及接枝于所述氧化锌纳米颗粒表面的聚乙二醇。本发明以高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体作为功能内核，当其受到X射线辐照时可发射特征紫外线，并被外壳ZnO半导体量子点高效吸收，由此产生电子空穴对，通过复杂的物理化学反应生成大量的高活性羟自由基（·OH）和超氧阴离子（·O2-），以此对癌细胞造成破坏。
【专利说明】低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂及其制备方法与应用，属于生物医用纳米材料【技术领域】。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的特殊疾病，对它的治疗已受到人们越来越多的关注。光动力学疗法(TOT)是近年来兴起的一种高效的癌症治疗技术，其整个过程涉及三种无毒的要素，分别是特定波长的光(Light)、光敏剂分子(PS)和氧气(O2)。作用机理可以简述为，特定波长的光激活光敏剂，通过复杂的光化学物理过程产生具有细胞毒性的活性氧物质，从而选择性地杀伤快速增殖的细胞。相比于传统化疗、放疗和手术治疗，光动力学疗法(PDT)因其特有的广谱性、灵活性及微创性等优点而受到愈发广泛的研究，但其在临床医学上的广泛应用尚面临两大关键问题:1)激发光源穿透深度浅:传统光敏剂的激发光通常在紫外-可见光波段，而人体组织对该波段光具有强烈的吸收，存在激发光源的活体穿透深度低的缺点，因而使得PDT仅能应用于浅层的皮肤癌，这成为限制其广泛临床应用的主要障碍；2)组织氧分压依赖性高:研究表明，通常的PDT过程为II型过程，即有机光敏剂分子的三重态与基态氧分子(3O2)发生能量传递而产生细胞毒性的单线态氧(1O2)，作为一个耗氧过程，当组织氧分压较低时，其单线态氧产率大大降低，严重影响治疗效果。对于肿瘤常氧区域，间歇性和节律性的光照可以维持氧供给，从而保证疗效。而对于肿瘤乏氧区域，PDT却见效甚微。因此，开发具有高穿透深度、低氧依赖性的新型光动力学治疗技术已成为临床亟待解决的问题。
[0003]相比于光动力学疗法，放疗不受活体穿透深度的限制，但却存在射线能量利用率低的缺陷，为达到预期治疗效果，需要延长放疗疗程以增加瘤区的放射剂量，然而这样就不可避免地引起机体强烈的副作用。此外，放疗同样面临组织氧分压依赖性大的瓶颈问题，研究表明，乏氧细胞对射线表现出极强的抵抗性。因此，针对放疗技术，如何提高射线能量利用率和降低放疗技术对组织氧分压依赖性，将是肿瘤临床医学面临的又一大挑战。
[0004]综上所述，设计一种能有效弥补传统放疗和光动力学治疗自身缺陷的医用纳米材料，将具有重要实际的意义和临床价值。
【发明内容】
[0005]针对传统放疗和光动力学治疗的缺陷，本发明的目的是提供一种低氧依赖型X光动力学治疗用纳米复合材料及其制备方法与应用。
[0006]在此，一方面，本发明提供一种低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，所述纳米光敏剂包括:能将高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体颗粒、包裹于所述纳米闪烁晶体表面的二氧化硅层、负载于所述二氧化硅层的外表面的氧化锌纳米颗粒、以及接枝于所述氧化锌纳米颗粒表面的聚乙二醇。
[0007]本发明以高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体作为功能内核，当其受到X射线辐照时可发射特征紫外线，并被外壳ZnO半导体量子点高效吸收，由此产生电子空穴对，通过复杂的物理化学反应生成大量的高活性羟自由基(.0H)和超氧阴离子(.02_)，以此对癌细胞造成破坏。由于大部分活性自由基主要从水中被激发，因此，可显著降低光动力学治疗的组织氧依赖性；同时，X射线作为光源可以弥补传统PDT穿透深度低的缺陷。这种单一激发源下的放疗和光动力学同步协同治疗具有重要的医学临床应用前景。
[0008]较佳地，所述纳米闪烁晶体为Ce3+离子掺杂LiYF4。LiYF4: Ce纳米闪烁晶体具有高光输出效率，且其在X射线辐照时发射的特征紫外线能被ZnO高效吸收。
[0009]较佳地，Ce3+离子的掺杂量为I?5wt%。具有上述掺杂量的Ce3+离子掺杂LiYF4与ZnO纳米颗粒间能实现高效的能量传递。
[0010]较佳地，所述纳米光敏剂的粒径为30?40nm，水合动力学直径为65?70nm。
[0011]较佳地，所述二氧化硅层的厚度为3?5nm。
[0012]较佳地，所述二氧化硅层上修饰有巯基，所述氧化锌纳米颗粒通过锌离子与所述巯基之间的配位作用与所述二氧化硅层共价键合。
[0013]较佳地，所述氧化锌纳米颗粒的粒径为3?5nm。
[0014]另一方面，本发明还提供上述低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂的制备方法，包括以下步骤:
(1)采用反微乳液法在疏水性的能将高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体颗粒的表面包裹二氧化硅层，制得纳米闪烁晶体OS12颗粒；
(2)采用末端带巯基的硅烷偶联剂对所得的纳米闪烁晶体OS12颗粒进行表面巯基修饰，制得纳米闪烁晶体OS12-SH颗粒；
(3)将所得的纳米闪烁晶体OS12-SH颗粒与氧化锌纳米颗粒反应以使所述氧化锌纳米颗粒与所述纳米闪烁晶体OS12-SH颗粒中的巯基之间形成配位共价键合，制得纳米闪烁晶体 OS12OZnO 颗粒；
(4)将所得的纳米闪烁晶体OS12OZnO颗粒与巯基聚乙二醇反应以使纳米闪烁晶体OS12OZnO颗粒中的锌离子与所述巯基聚乙二醇中的巯基形成配位共价键合，即可制得所述低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂。
[0015]较佳地，所述纳米闪烁晶体通过油酸盐高温热解法制备。
[0016]较佳地，所述末端带疏基的娃烧偶联剂为3_疏基丙基二甲氧基娃烧、3_疏基丙基二乙氧基娃烧和/或3_疏基丁基二甲氧基娃烧。
[0017]较佳地，所述氧化锌纳米颗粒通过碱性醇解法制备。
[0018]本发明合成工艺简单易行、制备成本低、效率高。所制得的材料具有非常好的分散性、稳定性以及生物相容性，具有重要的研究意义和应用前景。
[0019]再一方面，本发明还提供上述低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂在制备肿瘤的放疗/光动力学同步协同治疗药物中的应用。
[0020]与现有放疗增敏技术相比，本发明提供的纳米复合材料具有更宽的光谱响应，使得该纳米材料在不同能量的X射线下均具有良好的疗效；其次，本发明提供的纳米复合材料中重金属元素含量较低，生物安全性较好。与现有的光动力学治疗光敏剂相比，本发明提供的纳米复合材料可在X射线下实现光动力学治疗，具有穿透深度不受限的特性，对于深度部原位瘤具有良好治疗效果；更为重要的是，该光动力学过程为I型过程，细胞毒性的ROS主要由水中激发，具有较低的氧分压依赖性，对乏氧肿瘤也具有良好疗效。综上，本发明提供的纳米复合材料具有重要实际的意义和临床价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒分散于水中的透射电镜(TEM)照片；
图2为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒分散于水中的扫描透射电镜(STEM)照片；
图3为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的XRD图谱； 图4为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的能谱(EDS)
图；
图5为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的傅里叶红外光谱(FT-1R)图；
图6为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+纳米闪烁晶体颗粒和LiYF4:3% Ce、S12OZnO-PEG纳米颗粒的X射线激发光谱(XEL)以及实施例1所制得的超小ZnO纳米颗粒的紫外可见吸收光谱(UV-vis)图；
图7为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒存在条件下，X射线照射亚甲基蓝的降解曲线与空白组的比较；
图8为本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+@Si02@Zn0-PEG纳米颗粒在常氧(a)和乏氧(b)条件下细胞存活率柱状图；
图9为昆明鼠注射入本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(50mg/kg)后，各脏器组织的切片图；
图10为不同浓度的本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒与细胞共培养后，在常氧(a)和乏氧(b)条件下细胞存活率随放射剂量的变化曲线图；
图11为HeLa肿瘤荷瘤裸鼠瘤内注射本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(lmg/mL，100 μ L)组与注射相同体积生理盐水组经放疗后相对肿瘤体积生长曲线(a)，以及各组的肿瘤切片图:(b)空白组(生理盐水(saline))，(c)材料组(SZNP) (d)放射组(RT) (e)材料 + 放射组(SZNP+RT)；
图12为HeLa肿瘤荷瘤裸鼠瘤内注射本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(lmg/mL，100 μ L)组与注射相同体积生理盐水组经放疗前后肿瘤的数码照片，图中的“Pretreatment”表示治疗前；
图13为本发明实施例2所制得的LiYF4:5% Ce3+纳米颗粒分散于环己烷中的TEM照片;
图14为本发明实施例2所制得的LiYF4:5% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒分散于水中的TEM照片。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0023]针对传统放疗和光动力学治疗的缺陷，结合其各自的优势，本发明提出将纳米闪烁晶体与半导体量子点高效复合，以实现X射线诱导的新型光动力学治疗的创新性研究思路。设计思路简述为:以高光输出效率的纳米闪烁晶体作为功能内核，当其受到X射线辐照时可发射特征紫外线，并被外壳ZnO半导体量子点高效吸收，由此产生电子空穴对，通过复杂的物理化学反应生成大量的高活性羟自由基(.0H)和超氧阴离子(.02_)，以此对癌细胞造成破坏。由于大部分活性自由基主要从水中被激发，因此，可显著降低了光动力学治疗的组织氧依赖性；同时，X射线作为光源可以弥补传统PDT穿透深度低的缺陷。
[0024]本发明一方面提供一种低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其包括:具有将高能放疗射线高效转化为紫外光的纳米闪烁晶体颗粒、包裹于纳米闪烁晶体颗粒表面的实心二氧化硅层、修饰在氧化硅层表面的巯基、通过巯基与金属间配位以共价键形式吸附在二氧化硅层表面的超小氧化锌纳米颗粒以及最外层修饰的聚乙二醇。
[0025]其中纳米闪烁晶体颗粒可为Ce3+离子掺杂Y基纳米闪烁晶体，优选为Ce3+离子掺杂LiYF4纳米闪烁晶体(LiYF4 = Ce3+)，更优选地，LiYF4:Ce3+中Ce3+离子的掺杂量为I?5wt %。图6示出本发明一个示例中所制得的LiYF4:3 % Ce3+纳米闪烁晶体颗粒和LiYF4:3 %Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的X射线激发光谱(XEL)以及其中的超小ZnO纳米颗粒的紫外可见吸收光谱(UV-vis)图。由图6可见，当Ce3+离子的掺杂量为3wt%时，LiYF4:3% Ce3+纳米闪烁晶体在X射线照射下可以发射315和325nm的紫外线，该能量的光子与ZnO吸收峰完美重合，而LiYF4:3% Ce3+iSi02iZn0纳米颗粒在X射线照射下315和325nm的发射峰被完全淬灭，表明本发明的纳米光敏剂的核壳结构使得LiYF4:3% Ce3+纳米闪烁晶体与ZnO纳米颗粒间具有高效的能量传递。另外，本发明中，纳米闪烁晶体颗粒的粒径可为15?25nm。图13示出本发明一个示例中所制得的LiYF4:5% Ce3+纳米颗粒分散于环己烷中的TEM照片。由图13可见:该LiYF4:5*% Ce3纳米颗粒形貌为八面体，粒径约20nm，在环己烧溶液中分散良好。
[0026]图1、图14分别示出本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒和另一个示例的LiYF4:5% Ce3+OS12IiZnO-PEG纳米颗粒分散于水中的透射电镜(TEM)照片。由图1和图14可以看出本发明的纳米光敏剂颗粒呈球形，大小为30?40nm，具有明显的核壳结构。其中二氧化硅层的厚度为3?5nm。另外，本发明的纳米光敏剂颗粒在生理盐水中分散良好，颗粒粒径均一，水合动力学直径为65?70nm。
[0027]本发明的纳米光敏剂中，二氧化硅层上可修饰有巯基，例如可通过与末端带巯基的硅烷偶联剂连接来引入巯基。利用巯基与锌离子间强烈的配位作用使ZnO获得共价键合负载，从而超小ZnO纳米颗粒以配位共价键形式负载在二氧化娃层表面。其中ZnO纳米颗粒可为3?5nm。进一步地,可以通过巯基PEG与ZnO之间的配位作用在ZnO纳米颗粒的表面修饰PEG。通过修饰PEG，可以提高纳米光敏及的生物相容性，降低毒副作用并且提高其血液循环性能，促进其在肿瘤组织中的分布。
[0028]图2为本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒分散于水中的扫描透射电镜(STEM)照片，由图2可以进一步确认本发明的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒具有明显的核@壳1@壳2结构，表面有大量细小颗粒点缀，并且在水中具有良好的分散性。
[0029]图3为本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的XRD图谱，由图3可见:本发明LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒包含LiYF4和ZnO纳米晶体，并且结晶良好。
[0030]图4为本发明一个示例的LiYF4:3%Ce3+@Si02@Zn0-PEG纳米颗粒的能谱(EDS)图，由图4可见:本发明的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒包含Y，Ce, Si和Zn元素。
[0031]图5为本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的傅里叶红外光谱图(FT-1R)，由图5可见:本发明的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒中包含S12和PEG的振动峰，表明其中含有S12和PEG。
[0032]本发明的纳米光敏剂中，当纳米闪烁晶体受到X射线辐照时可发射特征紫外线，并被外壳ZnO半导体量子点高效吸收，由此产生电子空穴对，通过复杂的物理化学反应生成大量的高活性羟自由基(.0Η)和超氧阴离子(.02_)，以此对癌细胞造成破坏。由于大部分活性自由基主要从水中被激发，因此，可显著降低光动力学治疗的组织氧依赖性；同时，X射线作为光源可以弥补传统PDT穿透深度低的缺陷。此外，本发明的纳米光敏剂还具有较低的细胞毒性和良好生物相容性，生物安全性较好。
[0033]图7示出在本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒存在条件下，X射线照射亚甲基蓝的降解曲线与空白组的比较。由图7可见，相比于单独的X射线照射，本发明的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的存在可以显著增加亚甲基蓝的漂白速率，由此可以确认，在X射线照射材料时可以产生大量羟自由基。
[0034]图8为本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒在常氧(a)和乏氧(b)条件下细胞存活率柱状图，由图8可见:无论在常氧和乏氧条件下，该材料在500 μ g/mL的较高浓度下，共培养24h和48h后，HeLa细胞的存活率依然能维持90%，表明本发明的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒具有较低细胞毒性。
[0035]图9为昆明鼠注射入本发明一个示例的LiYF4:3 % Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(50mg/kg)后，各脏器组织的切片图。由图9可见:昆明鼠在注射LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒前后(最长为30日)的心肝脾肺肾各器官均无明显毒性反应，既无应激的肝肾毒性又无长期的组织毒性，表明本发明的纳米光敏剂在活体水平的良好生物相容性。
[0036]图10为不同浓度的本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒与细胞共培养后，在常氧(a)和乏氧(b)条件下细胞存活率随放射剂量的变化曲线图，由图10可见:本发明的纳米光敏剂的引入可以显著提高放射条件下细胞的杀伤效率，并且可以有效克服单独放疗疗效的氧分压依赖性大的缺陷。
[0037]图11为HeLa肿瘤荷瘤裸鼠瘤内注射本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(lmg/mL，100 μ L)组与注射相同体积生理盐水组经放疗后相对肿瘤体积生长曲线(a)，以及各组的肿瘤切片图:(b)空白组(生理盐水(saline))，(c)材料组(SZNP) (d)放射组(RT) (e)材料+放射组(SZNP+RT)。由图11可见:材料组肿瘤生长速率与空白组相当，进一步证明本发明的纳米光敏剂的良好的组织相容性；放射组的肿瘤生长速率明显地减慢，但在15天后依然有近3倍的增长；而材料+放射组的肿瘤生长曲线斜率平缓，肿瘤生长几乎完全受到抑制，表明作为光动力学介质的材料引入可以显著提高放射疗效。
[0038]图12为HeLa肿瘤荷瘤裸鼠瘤内注射本发明一个示例的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(lmg/mL，100 μ L)组与注射相同体积生理盐水组经放疗前后肿瘤的数码照片，由图12可以直观地得到上述结论，材料+放射组在照射后肿瘤生长得到了较好地抑制。
[0039]由上述可知，本发明可实现X射线单一激发源诱导下的放疗与深度光动力学治疗同步协同治疗，并且有效弥补了两者疗效的组织氧含量依赖性大的共性缺陷，对生物医学领域的发展和应用具有重要价值和意义。
[0040]上述纳米光敏剂的制备方法可以包括:合成纳米闪烁晶体内核、在内核表面包裹二氧化硅层、在二氧化硅层上修饰巯基、通过巯基与金属间配位以共价键形式在二氧化硅层表面吸附超小氧化锌纳米颗粒、以及在最外层修饰聚乙二醇。具体地，以LiYF4:Ce3+@S12OZnO-PEG为例，其可通过如下步骤制备。
[0041]首先，制备LiYF4 = Ce3+纳米闪烁晶体内核。可以采用油酸盐高温热解法制备，其过程可包括如下操作:
1-a)将稀土离子的前驱溶液加入十八烯与油酸混合液中，室温充分搅拌使混合均匀； Ι-b)加热到140?200°C，保温搅拌除水2h至溶液由浑浊变为澄清；
Ι-c)待体系温度降至室温，加入含氟化铵和氢氧化锂的乙酸溶液。室温搅拌I?3小时至体系混合均匀后，加热至120°C除尽体系中的乙酸；
Ι-d)在搅拌条件下将温度升到250?300°C，在氩气气氛下保温0.5?2h ;
1-e)反应结束待体系温度降至室温，用乙醇进行多次离心分离和清洗，制得疏水LiYF4 = Ce3+纳米闪烁晶体颗粒，分散于环己烷中。图13为本发明一个示例所制得的LiYF4:5% Ce3+纳米颗粒分散于环己烷中的TEM照片。由图13可见:该LiYF4:5% Ce3+纳米颗粒形貌为八面体，粒径约20nm，在环己烷溶液中分散良好。
[0042]步骤Ι-a)中的十八烯与油酸体积比可为3:1?1:1。
[0043]步骤Ι-a)中的稀土离子前驱溶液可为稀土氯化物的水溶液。
[0044]步骤Ι-a)中的总稀土离子浓度可为50?100mM。
[0045]此处以油酸高温热分解法为例，但应理解，本发明并不限定纳米闪烁晶体颗粒的制备，只要是能制得纳米闪烁晶体颗粒的方法均可。
[0046]接着，制备LiYF4 = Ce3+OS12纳米颗粒。可以采用反微乳液法进行S12层的包裹，其过程可包括如下操作:
2-a)将适量NP-5加入所制得的LiYF4:Ce3+纳米闪烁晶体颗粒的环己烷溶液中，室温搅拌使混合均匀；
2-b)在体系中加入适量氨水，搅拌数小时，获得均匀溶液；
2-c)缓慢匀速滴加适量正硅酸乙酯，使体系缓慢搅拌24?48h，溶液由无色透明转变为乳白色；
2-d)反应结束后，用乙醇多次离心清洗，制得的LiYF4:Ce3+@Si02纳米颗粒分散于无水乙醇中。
[0047]步骤2-c)中的正硅酸乙酯最终体积浓度可为I?3%。
[0048]通过采用反微乳液法，可以实现厚度可控的实心氧化硅层的可控制备。但应理解，实心氧化硅层的包裹方法不限于此，也可以采用其他公知的方法。
[0049]然后，采用末端带巯基的硅烷偶联剂对LiYF4 = Ce3+OS12纳米颗粒二次包裹，进行表面巯基修饰。其中所采用的末端带巯基的硅烷偶联剂包括但不限于3-巯基丙基三甲氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷和/或3-巯基丁基三甲氧基硅烷。其过程可包括如下操作:
3-a)将适量MPTS和氨水的混合液加入到LiYF4 = Ce3+OS12纳米颗粒的乙醇中，在室温条件下中速搅拌24h ；
3-b)反应结束后，用乙醇多次离心清洗，制得的LiYF4= Ce3+OS12-SH纳米颗粒分散于无水乙醇中。
[0050]然后，在制得的LiYF4:Ce3+OS12-SH纳米颗粒上负载ZnO纳米颗粒。可以先采用碱性醇解法制备超小ZnO纳米颗粒，其过程可包括如下操作:
4-a)将适量乙酸锌和聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)加入无水乙醇中，在70°C保温搅拌数小时，使反应物充分溶解混合均匀；
4-b)待体系温度降至50°C，迅速加入氢氧化锂的饱和乙醇溶液，在该温度下保温I?2h，反应结束至体系冷却到室温过程中，避免水汽进入。所制得的超小ZnO纳米颗粒溶液密封保存，待用。
[0051]ZnO纳米颗粒的负载可包括如下步骤:
5-a)在超声条件下，将制备的超小ZnO纳米颗粒溶液逐滴加入到LiYF4= Ce3+OS12-SH纳米颗粒的乙醇溶液中，完毕后，持续超声10?30min ；
5-b)用去离子水清洗数次，离心收集获得的LiYF4:Ce3+@Si02@Zn0分散于去离子水中，待用。
[0052]反应后，超小ZnO纳米颗粒利用巯基与锌离子间强烈的配位作用以配位共价键形式负载在LiYF4 = Ce3+OS12-SH纳米颗粒表面。图4示出本发明一个示例所制得的LiYF4:3%Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的能谱(EDS)图。由图4可见:本发明所制得的LiYF4:3% Ce、S12OZnO-PEG纳米颗粒包含Y，Ce，Si和Zn元素，并且含量与投料配比相一致，表明本发明所制得的LiYF4:3% Ce3+纳米闪烁晶体与超小ZnO结合良好，未发生ZnO脱落。
[0053]最后，利用巯基PEG对LiYF4: Ce3+OS12OZnO纳米颗粒进行PEG修饰，其过程可包括如下操作:
a)将适量巯基PEG粉末加入LiYF4:Ce3+iSi02iZn0纳米颗粒水溶液中，待超声溶解后剧烈搅拌数小时；
b)用去离子水清洗数次，离心收集获得的最终产物LiYF4:Ce3+@Si02@Zn0-PEG分散于去离子水中。
[0054]其中，LiYF4:Ce3+OS12OZnO纳米颗粒与巯基PEG的摩尔比可为:1:5?1:10。
[0055]图5为本发明一个示例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的傅里叶红外光谱(FT-1R)图。由图5可见=LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒中包含S12和PEG的振动峰，表明S12的成功包裹和PEG的成功修饰。
[0056]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0057]实施例1
称取 1.94mmol YCl3.6H20 (588.5mg)和 0.0BmmoI CeCl3.6H20 (22.4mg),用 2ml 去离子水溶解；在10ml的三口烧瓶中加入15ml油酸和30ml十八烯，在搅拌条件下逐滴加入配制的稀土离子前驱溶液；在氩气保护条件下，将体系升温，至160°C保温Ih ;确保体系中的水分除尽后，停止加热，自然降至室温，获得黄色澄清溶液；称取3mmolLi0H.H2O(125.9mg)和8mmol NH4F(293.6mg)，加入1ml甲醇和2ml乙酸，超声溶解，并逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌条件2h ;在氩气保护下升温，至120°C保温lh，除尽体系中的甲醇和乙酸；力口冷凝回流管，将体系温度升至280°C保温1.5h进行热解反应；待反应结束，自然降至室温，向反应体系中加入20mL乙醇，室温下搅拌30min，然后进行离心分离；对收集的固体依次用环己烷和乙醇进行超声清洗3次；用20mL环己烷溶解所得产物(LiYF4:3% Ce3+疏水纳米闪烁晶体)，得到无色透明溶液，待用。
[0058]取上述溶液3ml分散于20ml环己烧中，加入lmlNP-5后,在室温下搅拌40min ;力口Λ 140 μ L氨水，继续搅拌2h ;利用蠕动泵，在体系中以lml/h的速度缓慢滴加20% TEOS的环己烷溶液；Ih后停止滴加，使体系继续搅拌反应20h后，加入2ml甲醇中止反应；搅拌Ih后，离心收集产物，用乙醇清洗数次后再分散于1ml乙醇中；在室温剧烈搅拌的条件下，迅速加入75 μ L氨水和50 μ L MPTS,持续搅拌1h后离心收集产物，获得的巯基修饰的LiYF4:3% Ce3+OS12颗粒分散于1ml乙醇中，待用。
[0059]称取0.5mmol Zn (Ac)2.Η20(109.8mg)和 lmmol PVP40 (Illmg)溶于 20ml 乙醇中，于70°C搅拌1.5h ;带体系温度降至70°C，迅速加入1ml含有lmmol L1H.H20(105mg)的乙醇溶液，并在该温度下搅拌lh，获得超小ZnO纳米颗粒的乙醇溶液，待用。
[0060]将得到的巯基修饰的LiYF4:3% Ce3+OS12颗粒(以下简称SZNP)的溶液乙醇逐滴加入到超小ZnO纳米颗粒的乙醇溶液中，超声1min后离心收集产物溶于20ml的乙醇中；加入20mg巯基PEG，搅拌6h后，离心，清洗收集获得最终产物LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米复合颗粒。其分散于水中的透射电镜(TEM)照片参见图1、分散于水中的扫描透射电镜(STEM)照片参见图2、XRD图谱参见图3、能谱(EDS)图参见图4、傅里叶红外光谱图(FT-1R)参见图5。由这些图可以确证所制得的LiYF4:3% Ce3+@Si02@Zn0-PEG纳米复合颗粒的结构。
[0061]性能实验
A.亚甲基蓝漂白实验实验材料及仪器:
10mg/L的亚甲基蓝水溶液；
本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒；
实验方法:
将4mL亚甲基蓝溶液与含本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(100 μ g/mL)的亚甲基蓝溶液照射不同剂量的X射线后，测试溶液在644nm处吸收峰的强度值。
[0062]实验结果:
图7为在本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12IiZnO-PEG纳米颗粒存在条件下，X射线照射亚甲基蓝的降解曲线与空白组的比较。由图7可见，相比于单独的X射线照射，本发明实施例1所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的存在可以显著增加亚甲基蓝的漂白速率，由此可以确认，在X射线照射材料时可以产生大量羟自由基。
[0063]B.毒性评价实验 1.体外细胞毒性实验 1.1实验材料:
本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒 1.2细胞模型:
HeLa细胞(人宫颈癌细胞)模型
1.3实验方法:
采用标准CCK-8(Cell Counting Kit-8)方法评价细胞存活率，具体实验方法为:(I)接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔3000个细胞接种到96孔板，每孔培养液体积lOOyL。待细胞贴壁后，分别置于常氧(21% O2)和乏氧(2% O2)培养箱中培养。⑵培养细胞:加入不同浓度的纳米颗粒后与细胞共培养24h后，每孔加CCK-8试剂盒溶液10微升，继续共培养4h。(3)定量:选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
[0064]1.4实验结果:
图8为本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒在常氧(a)和乏氧(b)条件下细胞存活率柱状图，由图8可见:无论在常氧和乏氧条件下，该材料在500 μ g/mL的较高浓度下，共培养24h和48h后，HeLa细胞的存活率依然能维持90%，表明本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒具有较低细胞毒性。
[0065]2.体内组织毒性实验
2.1实验材料
本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒 2.2实验动物
昆明小鼠，平均体重20g，5?6周龄，购自复旦大学医学院动物房；
2.3实验方法
尾静脉注射本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的生理盐水溶液(剂量为50mg/kg)。通过常规的H&E染色来观察注射前、注射后的7和30日后的组织切片。
[0066]2.4实验结果
图9为昆明鼠注射入本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(50mg/kg)后，各脏器组织的切片图。由图9可见:昆明鼠在注射LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒前后(最长为30日)的心肝脾肺肾各器官均无明显毒性反应，既无应激的肝肾毒性又无长期的组织毒性，表明该材料在活体水平的良好生物相容性。
[0067]C.细胞水平放射实验实验材料:
本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒细胞模型:
HeLa细胞(人宫颈癌细胞)模型实验方法:
(I)接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔3000个细胞接种到96孔板，每孔培养液体积100 μ L。待细胞贴壁后，分别置于常氧(21% O2)和乏氧(2% O2)培养箱中培养。(2)培养细胞:加入不同浓度(25和50 μ g/mL)的纳米颗粒后与细胞共培养24h。(3)照射:用培养液小心清洗数次除去自由材料后,加入新鲜培养液100 μ L,将细胞置于不同剂量的X射线照射后，继续培养24h。(3)定量:采用标准CCK-8(CellCounting Kit-8)方法评价细胞存活率，选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
[0068]实验结果:
图10为不同浓度的本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒与细胞共培养后，在常氧(a)和乏氧(b)条件下细胞存活率随放射剂量的变化曲线图，由图10可见:材料的引入可以显著提高放射条件下细胞的杀伤效率，并且可以有效克服单独放疗疗效的氧分压依赖性大的缺陷。
[0069]D.活体水平放射实验实验材料:
本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒实验动物:
BALB/c雌性裸鼠，平均体重20g，8?9周龄，购自复旦大学医学院动物房；
肿瘤模型:
左右大腿双HeLa移植肿瘤(人宫颈癌细胞)模型实验方法:
(I)肿瘤模型建立:分别在裸鼠的左右大腿皮下小心注入100 μ LHeLa细胞(I X 16细胞)的PBS悬液，两周后，肿瘤体积生长至70?100mm3。(2)瘤内注射100 μ L生理盐水以及lmg/mL本实施例制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒的生理盐水溶液。(3)裸鼠经10v%水合氯醛进行腹腔麻醉后，置于临床放射仪(SARRP，Gulmay Medical Inc.，USA)上施以8Gy剂量的照射。(4)两天后处死部分裸鼠取肿瘤，制H&E染色切片评估治疗效果。剩余裸鼠每三天记录肿瘤体积。
[0070]实验结果:
图11为HeLa肿瘤荷瘤裸鼠瘤内注射本实施例制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(lmg/mL，100 μ L)组与注射相同体积生理盐水组经放疗后相对肿瘤体积生长曲线(a)，以及各组的肿瘤切片图:(b)空白组(saline), (c)材料组(SZNP) (d)放射组(RT) (e)材料+放射组(SZNP+RT)。由图11可见:材料组肿瘤生长速率与空白组相当，进一步证明材料良好的组织相容性；放射组的肿瘤生长速率明显地减慢，但在15天后依然有近3倍的增长；而材料+放射组的肿瘤生长曲线斜率平缓，肿瘤生长几乎完全受到抑制，表明作为光动力学介质的材料引入可以显著提高放射疗效；
图12为HeLa肿瘤荷瘤裸鼠瘤内注射本实施例所制得的LiYF4:3% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒(lmg/mL，100 μ L)组与注射相同体积生理盐水组经放疗前后肿瘤的数码照片，由图12可以直观地得到上述结论，材料+放射组在照射后肿瘤生长得到了较好地抑制。
[0071]实施例2
称取 1.94mmol YCl3.6H20 (588.5mg)和 0.lmmol CeCl3.6H20 (37.3mg),用 2ml 去离子水溶解；在10ml的三口烧瓶中加入20ml油酸和20ml十八烯，在搅拌条件下逐滴加入配制的稀土离子前驱溶液；在氩气保护条件下，将体系升温，至160°C保温Ih ;确保体系中的水分除尽后，停止加热，自然降至室温，获得黄色澄清溶液；称取3mmol L1H.H2O(125.9mg)和8mmol NH4F(293.6mg)，加入1ml甲醇和2ml乙酸，超声溶解，并逐滴加入到反应体系中，在室温下搅拌条件2h ;在氩气保护下升温，至120°C保温lh，除尽体系中的甲醇和乙酸；力口冷凝回流管，将体系温度升至280°C保温1.5h进行热解反应；待反应结束，自然降至室温，向反应体系中加入20mL乙醇，室温下搅拌30min，然后进行离心分离；对收集的固体依次用环己烷和乙醇进行超声清洗3次；用20mL环己烷溶解所得产物(LiYF4:5% Ce3+疏水纳米闪烁晶体)，得到无色透明溶液，待用。所制得的LiYF4:5 % Ce3+纳米颗粒分散于环己烷中的透射电镜(TEM)照片参见图13，可见该LiYF4:5% Ce3+纳米颗粒形貌为八面体，粒径约20nm，在环己烷溶液中分散良好。
[0072]取上述溶液3ml分散于20ml环己烧中，加入lmlNP-5后,在室温下搅拌40min ;力口Λ 140 μ I氨水，继续搅拌2h ;利用蠕动泵，在体系中以3ml/h的速度缓慢滴加20% TEOS的环己烷溶液；Ih后停止滴加，使体系继续搅拌反应36h后，加入2ml甲醇中止反应；搅拌Ih后，离心收集产物，用乙醇清洗数次后再分散于1ml乙醇中；在室温剧烈搅拌的条件下，迅速加入75 μ I氨水和50 μ I MPTS,持续搅拌1h后离心收集产物，获得的巯基修饰的LiYF4:5% Ce3+OS12颗粒分散于1ml乙醇中，待用。
[0073]称取0.5mmol Zn (Ac)2.Η20(109.8mg)和 lmmol PVP40 (Illmg)溶于 20ml 乙醇中，于70°C搅拌1.5h ;带体系温度降至70°C，迅速加入1ml含有lmmol L1H.H20(105mg)的乙醇溶液，并在该温度下搅拌lh，获得超小ZnO纳米颗粒的乙醇溶液，待用。
[0074]将得到的巯基修饰的LiYF4:5% Ce3+OS12颗粒(以下简称SZNP)的溶液乙醇逐滴加入到超小ZnO纳米颗粒的乙醇溶液中，超声1min后离心收集产物溶于20ml的乙醇中；加入20mg巯基PEG，搅拌6h后，离心，清洗收集获得最终产物LiYF4:5% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米复合颗粒。
[0075]图14为本发明实施例2所制得的LiYF4:5% Ce3+OS12OZnO-PEG纳米颗粒分散于水中的透射电镜(TEM)照片。由图14可见，LiYF4:5% Ce3+、S12以及ZnO核壳结构明显，且其间结合良好，整体颗粒尺寸约40nm。
[0076]综上所述可见，本发明提供的纳米复合材料可以实现X射线诱导的光动力学治疗，并且可以显著降低传统放疗和光动力学治疗的氧分压依赖性；该材料具有较好的生物相容性和组织安全性；在临床8Gy放疗剂量下，材料的引入可以有效提高单纯放疗的疗效。可实现X射线单一激发源诱导下的放疗与深度光动力学治疗同步协同治疗，并且有效弥补了两者疗效生物组织氧含量依赖性大的共性缺陷，对生物医学领域的发展和应用具有重要价值和意义。
【权利要求】
1.一种低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，包括:能将高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体颗粒、包裹于所述纳米闪烁晶体表面的二氧化硅层、负载于所述二氧化硅层的外表面的氧化锌纳米颗粒、以及接枝于所述氧化锌纳米颗粒表面的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，所述纳米闪烁晶体为Ce3+离子掺杂LiYF4。
3.根据权利要求2所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，Ce3+离子的惨杂量为I?5 wt%0
4.根据权利要求1至3中任一项所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，所述纳米光敏剂的粒径为30?40nm,水合动力学直径为65?70nm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，所述二氧化硅层的厚度为3?5nm。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，所述二氧化硅层上修饰有巯基，所述氧化锌纳米颗粒通过锌离子与所述巯基之间的配位作用与所述二氧化硅层共价键合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂，其特征在于，所述氧化锌纳米颗粒的粒径为3?5nm。
8.—种权利要求1至7中任一项所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采用反微乳液法在疏水性的能将高能放疗射线转化为紫外光的纳米闪烁晶体颗粒的表面包裹二氧化硅层，制得纳米闪烁晶体OS12颗粒； (2)采用末端带巯基的硅烷偶联剂对所得的纳米闪烁晶体OS12颗粒进行表面巯基修饰，制得纳米闪烁晶体OS12-SH颗粒； (3)将所得的纳米闪烁晶体OS12-SH颗粒与氧化锌纳米颗粒反应以使所述氧化锌纳米颗粒与所述纳米闪烁晶体OS12-SH颗粒中的巯基之间形成配位共价键合，制得纳米闪烁晶体 OS12OZnO 颗粒； (4)将所得的纳米闪烁晶体OS12OZnO颗粒与巯基聚乙二醇反应以使纳米闪烁晶体OS12OZnO颗粒中的锌离子与所述巯基聚乙二醇中的巯基形成配位共价键合，即可制得所述低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纳米闪烁晶体通过油酸盐高温热解法制备。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述末端带巯基的硅烷偶联剂为3-疏基丙基二甲氧基娃烧、3-疏基丙基二乙氧基娃烧和/或3-疏基丁基二甲氧基娃烧。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氧化锌纳米颗粒通过碱性醇解法制备。
12.—种权利要求1至7中任一项所述的低氧依赖型X光动力学纳米光敏剂在制备肿瘤的放疗/光动力学同步协同治疗药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104353076SQ201410657710
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】张辰, 步文博, 施剑林 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所