一种二联灭活疫苗制备方法

一种二联灭活疫苗制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种二联灭活疫苗制备方法，本发明制备的二联灭活疫苗用于预防猪O型口蹄疫、猪圆环病毒2型，本发明制备方法简单，疫苗的抗原含量高，免疫方便，与现有技术中的分次免疫相比，减少了免疫次数，减少了应激反应，降低了免疫成本。其次，通过二联疫苗与单价疫苗免疫仔猪的效力比较发现，两种抗原成分在同一针二联疫苗中不仅相互没有干扰，而且二联疫苗单次注射仔猪的免疫效果高于两种单苗先后注射的免疫效果。
【专利说明】一种二联灭活疫苗制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗【技术领域】，具体涉及一种二联灭活疫苗制备方法。

【背景技术】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的一种急性和高度接触性的动物传染病。FMDV感染对象 为牛、羊、猪等家养以及野生的偶蹄动物。流行病学调查和感染实验证明，约有100多种动 物可感染此病毒。该病的临床特征是传播速度块、流行范围广，成年动物的口腔黏膜、蹄部 和乳房等处发生水泡和溃烂，幼龄动物多因心肌受损导致较高的死亡率。除动物死亡造成 直接经济损失外，动物在患病期间肉和奶的生产停止，哺乳期产奶量降低，耐过动物生长缓 慢，种用价值丧失，也可造成严重的经济损失。本病分布于世界各地，在亚洲、非洲、南美洲 和中东等地区广泛流行，而已消灭口蹄疫的国家和地区常有重新爆发本病的例证。鉴于口 蹄疫对世界经济发展、生态和谐及社会安全等方面危害极大，国际兽医局（OIE)和联合国 粮农组织（FAO)将其列为必须通报的疫病之一，我国也将其列为一类动物传染病的第一 位。
[0003] 猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现 已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒，而PCV2为致病性的病 毒，PCV2 除导致仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome， PMWS)外，还能导致母猪的繁殖障碍，PCVD广泛存在于世界各地的猪群中，造成很大的经济 损失。
[0004] 近年来，我国猪群中PCV2和猪0型FMDV流行十分严重，发病率和死亡率也不断提 高，给养猪业造成巨大经济损失。当前对这2种病毒性疫病的防控主要采用灭活疫苗，但 PCV2灭活疫苗存在病毒难培养的现实，FMDV灭活疫苗存在因灭活不彻底而散毒的危险。研 宄表明，利用生物反应器培养的PCV2病毒可提高病毒滴度和重组蛋白研制的亚单位疫苗 对FMDV感染具有良好的免疫效果，FMDV的结构蛋白Vpl包含FMDV的主要抗原位点，是病毒 的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生保护性中和抗体，可用于FMDV亚单位疫苗的 研制。因此，研制同时预防这两种病毒性疫病的二联疫苗具有重要意义。急需FMDV和PCV2 的二联灭活疫苗，以同时预防0型口蹄疫和PCV2引起的PMWS综合症。


【发明内容】

[0005] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种二联灭活疫苗制备方法，该方法 采用原核表达系统表达纯化FMDV-Vpl蛋白，结合现有PCV-2全病毒灭活疫苗生物反应器悬 浮培养的高滴度病毒，制备出猪〇型口蹄疫VPl亚单位、PCV-2二联灭活疫苗。
[0006] 为了实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 一种二联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)取PCV2ZJ/C毒株感染宿主细胞进行病毒扩增，确保病毒效价彡107_°TCID 5(l/ml， 收获细胞毒液；
[0009] 2)将步骤1)得到的细胞毒液，利用中空纤维滤柱进行澄清浓缩处理；
[0010] 3)将步骤2)浓缩处理后的病毒在搅拌状态下按0. 1?0. 3% (v/v)的比例加入 0 -丙内酯灭活，得到第一抗原原液；
[0011] 4)取pET28a-FMDV VPl菌株进行培养扩增，而后向培养体系中加入0. 1?Immol/ L的IPTG进行诱导，诱导时间为4?6h，诱导温度为25?37°C，而后收集菌体，破壁，收集 包涵体；
[0012] 5)利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15?25mg/mL的浓度重悬步骤4)得到的包 涵体，收集上清液，再用Ni 2+柱纯化蛋白，复性蛋白，再过滤除菌，即得到第二抗原原液；
[0013] 6)将步骤3)得到的第一抗原原液与步骤5)得到的第二抗原原液按比例混合，即 得到混合抗原原液，上述按比例是确保得到的混合抗原原液中PCV2含量为10 7_°TCID50/头 份、FMDV VPl蛋白含量为80 y g/头份或PCV2蛋白含量为107 5TCID50/头份、FMDV VPl蛋 白含量为100 U g/头份；
[0014] 7)将步骤6)得到的混合抗原原液与疫苗佐剂搅拌混匀，即得到一种二联灭活疫 苗。
[0015] 优选的，步骤1)的具体流程如下：取PCV2ZJ/C毒株按感染复数为0. 005?0. 02 接种于PK-15细胞，34?39°C吸附25?35min，加入含2?5%犊牛血清和0. 5?2mmol/ L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，34?39°C培养，而后反复冻融，确保病毒效价 彡10 7°TCID5Q/ml，收获病毒。
[0016] 优选的，步骤7)混合抗原原液与疫苗佐剂的混合比例为I: I (v/v)。
[0017] 优选的，步骤2)滤柱澄清处理之前先利用菲托滤板进行一步过滤处理。
[0018] 优选的，步骤3)灭活条件为：加入0-丙内酯后置于4°C条件下搅拌灭活48? 72h，然后置于37°C水浴2h。
[0019] 优选的，步骤4)所述的扩增培养具体包括以下流程：取pET28a-FMDV VPl菌株划 线至Kan+抗性培养板，37°C过夜培养，挑取单个菌落接入IOmL含有Kan+的液体LB培养基 中，37°C 220r/min 振荡培养 ll-16h。
[0020] 优选的，步骤4)所述的破壁具体包括以下流程：用1/10菌液体积的wash buffer 重悬菌体，加100 U g/mL溶菌酶，于冰上超声破碎菌体。
[0021] 优选的，步骤4)具体包括以下流程：IPTG诱导浓度为0. 8mmol/L，诱导时间为5h， 诱导温度为，37°C。
[0022] 优选的，步骤5)所述的Ni2+柱为Ni-NTA柱。
[0023] 优选的，步骤5)所述的复性方法为：稀释复性结合超滤浓缩。
[0024] 优选地，步骤7所述疫苗佐剂为ISA206、ISA201、Gel01、ISA28VG等的一种或几种 组合物；更优选地，为ISA201。上述名称为商品名，其中带有ISA字样的佐剂为赛比克公司 制造的ISA系列疫苗佐剂。
[0025] 以上技术方案所述的pET28a-FMDV VPl表达菌株，其保藏编号为CCTCC M2014406。
[0026] 本发明制备的二联灭活疫苗用于预防猪0型口蹄疫、猪圆环病毒2型，本发明制备 方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便，与现有技术中的分次免疫相比，减少了免疫次数， 减少了应激反应，降低了免疫成本。
[0027] 其次，通过二联疫苗与单价疫苗免疫仔猪的效力比较发现，两种抗原成分在同一 针二联疫苗中不仅相互没有干扰，而且二联疫苗单次注射仔猪的免疫效果高于两种单苗先 后注射的免疫效果。
[0028] 即本发明的PCV2、PPV的二联灭活疫苗，具有以下有益效果：
[0029] 1)二联灭活疫苗免疫仔猪后，副反应降低，安全性更佳，避免了多次接种免疫出现 的不良反应。
[0030] 2)二联灭活疫苗免疫母猪后，通过母源抗体，仔猪获得被动免疫，明显降低了仔猪 的死亡率，提高了存活率，增加了经济效益。
[0031] 4)二联灭活疫苗免疫仔猪，与现有技术中的分次免疫相比，降低了免疫成本，节约 了免疫程序，更加经济可靠。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 图1是本发明实施例1的疫苗制备流程图。

【具体实施方式】
[0033] 实施例1猪圆环病毒2型、猪口蹄疫VPl亚单位二联灭活疫苗
[0034] 1生产用毒种的制备
[0035] I. 1PCV2ZJ/C株的制备：将毒种用病毒稀释液（无血清的MEM培养基）作适当稀 释，按感染复数（M. 0. I.)为0. 01接种于PK-15细胞培养，37°C吸附30min，加入含3% (v/ v)犊牛血清和lmmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37°C培养5日，反复冻融 3次，收获病毒，病毒效价》10 7_ciTCID5ciAil。
[0036] I. 2VP1蛋白表达菌种的活化：将保存的原核表达菌种划线至Kan+抗性培养板， 37°C过夜培养。挑取单个菌落接入IOmL含有Kan+的液体LB培养基中，37 °C 220r/min振 荡培养ll-16h，作为诱导表达用菌种。
[0037] 2制苗抗原的制备
[0038] 2.1PCV2抗原的制备
[0039] 2. I. 1病毒液培养：选择动物细胞用生物反应器IOL至42L消化放大接毒、低血清 悬浮培养工艺技术，〇. 25% EDTA-胰酶消化，用含3%低血清的MEM专用细胞生长液制备成 4 X IO5个/mL的细胞悬液，按1 %比例接种生产用毒种，37°C，搅拌转速35rpm/h，接种后每 日观察1-2次，培养至72-96h弃营养液，冻融收获细胞及培养液，于-20°C保存备用。
[0040] 2. L 2病毒含量测定
[0041] 以0. 25%的EDTA-胰酶将生长良好的PK15细胞进行消化分散，并以细胞生长液 重悬（8% NBCS MEM)为浓度为2 X IO5个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，IOOul/ 孔，置于37°C，5% 0)2细胞培养箱中。
[0042] 取病毒液以无血清MEM进行10倍倍比梯度稀释，将稀释后各梯度（KT4?KT 7)病 毒液接种于步骤1已经加入细胞悬液的96孔细胞培养板中，IOOul/孔，每个梯度6或8个 重复孔，设置阳性与阴性对照，37 °C，5 % CO2细胞培养箱中培养72h。
[0043] 维持培养结束后，弃尽板孔内维持液，以甲醇/丙酮固定液（1:1)对细胞进行固 定，IOOul/孔，-20°C，5?lOmin。弃尽固定液，将细胞板风干；以1 %的牛血清白蛋白（BSA) 溶液进行封闭处理，IOOul/孔，37°C，孵育60min。以0. OlM PBS洗3遍，200ul/孔。将1000 倍稀释的一抗添加于细胞培养板，IOOul/孔，37°C，孵育60min。以0. OlM PBS洗5遍，200ul/ 孔次。添加200倍稀释的荧光色素（FITC标记的二抗，IOOul/孔，37°C，孵育60min。弃尽 二抗，以0. OlM PBS洗5遍，200ul/孔，荧光显微镜下观察。统计出现特异荧光孔的数目，按 Reed-Muench法计算对病毒滴度（TCID 5tl)。
[0044] 2. 1. 3抗原的澄清和纯化
[0045] 将PCV2ZJ/C株合格的细胞毒液，分别用菲托滤板（澄清装置）进行澄清处理，而 后澄清毒液再用GE公司的中空纤维纯化系统（300KDa中空纤维柱）进行杂蛋白进一步去 除和浓缩处理。
[0046] 2. L 4病毒液的灭活
[0047] 病毒灭活：将病毒液置于灭活容器中，在搅拌状态下按1:2000比例缓慢加入 0-丙内酯，置于4°C条件下搅拌灭活48h，然后置于37°C水浴2h，2-8°C保存，不超过1个 月。
[0048] 灭活检验：取灭活病毒液1份与9份PK15细胞悬液（2 X IO5个/mL)充分混匀，接 种5个不小于25cm2的细胞培养瓶，同时设置病毒阳性对照。于37°C、5% CO 2培养箱培养 72h，收获细胞及培养液，冻融3次作为盲传的接种物，盲传2代，IFA方法检验产物，灭活病 毒的接种细胞均应无绿色荧光，病毒接种的对照细胞均应有绿色荧光。
[0049] 无菌检验：灭活病毒液接种TG小管、GA斜面各2支，每支0. 2mL，l支置37°C培养， 一支置于25°C培养，另取0. 2mL接种1支GP小管置于25°C培养，均培养7d，应无菌生长。
[0050] 2. 2VP1蛋白抗原的制备
[0051] 2. 2. IVPl蛋白的诱导表达：按1:100比例接种新鲜菌液至含Kan+的LB液体培养 基，37°C，180rpm/min，培养 3. 5h，测定 0D6QQ，加入 0? 8mmoL/L IPTG 诱导，37°C，培养 5h。收 集菌体。用1/10菌液体积的wash buffer重悬菌体，加IOOy g/mL溶菌酶，于冰上超声破 碎菌体，收集包涵体。
[0052] 2. 2. 2VP1蛋白的纯化：CAPS裂解液或尿素裂解液裂解包涵体：按20mg/mL的比例 用裂解液重悬包涵体（必要时需要超声混匀），收集含有可溶蛋白的上清。Ni 2+柱纯化蛋 白，稀释复性蛋白，结合超滤浓缩获得足量的蛋白。测定内毒素含量< 50EU，蛋白浓度达到 lmg/mL。经过0. 22um滤膜过滤除菌，保存备用。
[0053] 2. 4 配苗
[0054] 将浓缩、纯化后的2抗原液按合适比例混合，然后混合液与ISA201佐剂（法国赛 比克SEPPIC公司生产）按I : I (V/V)混合，以300转/分钟搅拌30min即可。
[0055] 本发明实施例1中上述制备二联疫苗的方法可参照图1。
[0056] 2. 5性状检验
[0057] 外观：乳白色乳剂，久置后后，上层有少量油析出，振摇后呈均匀乳剂。剂型：水包 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。稳定性：吸取疫 苗IOmL加入离心管中，2500rpm离心3min，乳液未分明，即达到使用要求。黏度：用ImL吸 管（下口内径I. 2mm，上口内径2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其垂直自然流出0. 4mL， 记录所需时间，应在8s以内。将上述制备的3批（批号为：201401、201402、201403)。性状 检验结果符合要求。将上述制备的3批（批号为：201401、201402、201403)。性状检验结果 符合要求。性状检验结果见表1。
[0058] 2. 6无菌检验：按《中华人民共和国兽药典》（2010年版）附录进行，疫苗应无菌生 长。无菌检验结果见表1，结果表明3批疫苗（批号为：201401、201402、201403)无菌生长， 疫苗成品合格。
[0059] 表13批二联灭活疫苗的性状检验、无菌检验和安全性检验结果
[0060]

【权利要求】
1. 一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取PCV2ZJ/C毒株感染宿主细胞进行病毒扩增，确保病毒效价多107_°TCID5(l/ml，收获 细胞毒液； 2) 将步骤1)得到的细胞毒液，利用中空纤维滤柱进行澄清浓缩处理； 3) 将步骤2)浓缩处理后的病毒在搅拌状态下按0. 1?0. 3% (v/v)的比例加入0 -丙 内酯灭活，得到第一抗原原液； 4) 取pET28a-FMDV VP1菌株进行培养扩增，而后向培养体系中加入0. 1?lmmol/L的 IPTG进行诱导，诱导时间为4?6h，诱导温度为25?37°C，而后收集菌体，破壁，收集包涵 体； 5) 利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15?25mg/mL的浓度重悬步骤4)得到的包涵体， 收集上清液，再用Ni2+柱纯化蛋白，复性蛋白，再过滤除菌，即得到第二抗原原液； 6) 将步骤3)得到的第一抗原原液与步骤5)得到的第二抗原原液按比例混合，即得到 混合抗原原液，上述按比例是确保得到的混合抗原原液中PCV2含量为107_°TCID50/头份、 FMDV VP1蛋白含量为80 y g/头份或PCV2蛋白含量为107 5TCID50/头份、FMDV VP1蛋白含 量为100 u g/头份； 7) 将步骤6)得到的混合抗原原液与疫苗佐剂搅拌混匀，即得到一种二联灭活疫苗。
2. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1)的具体流 程如下：取PCV2ZJ/C毒株按感染复数为0. 005?0. 02接种于PK-15细胞，34?39°C吸附 25?35min，加入含2?5%犊牛血清和0. 5?2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞 维持液，34?39°C培养，而后反复冻融，确保病毒效价彡107_°TCID5(l/ml，收获病毒。
3. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤7)混合抗原原 液与疫苗佐剂的混合比例为1:1 (v/v)。
4. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2)滤柱澄清处 理之前先利用菲托滤板进行一步过滤处理。
5. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3)灭活条件 为：加入0 _丙内酯后置于4°C条件下搅拌灭活48?72h，然后置于37°C水浴2h。
6. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述的扩增 培养具体包括以下流程：取pET28a-FMDV VP1菌株划线至Kan+抗性培养板，37°C过夜培养， 挑取单个菌落接入10mL含有Kan+的液体LB培养基中，37°C 220r/min振荡培养ll-16h。
7. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述的破壁 具体包括以下流程：用1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，加100 y g/mL溶菌酶，于冰上 超声破碎菌体。
8. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以 下流程：IPTG诱导浓度为0. 8mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为，37°C。
9. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)所述的Ni 2+柱为Ni-NTA柱。
10. 根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)所述的复 性方法为：稀释复性结合超滤浓缩。
【文档编号】A61P31/14GK104474542SQ201410659965
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】吕茂杰, 梁武, 杨保收, 李亚杰, 边程 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司