一种治疗Ebola病毒的药物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗Ebola病毒的药物及其制备方法,旨在提供一种制备方法简单,用于治疗埃博拉病毒的药物;其技术要点:所述的药物为特异切割Ebola病毒RNA的融合蛋白PIN-VP30-DD,基因序列如SEQ ID NO:1所示;制备方法为:1)PIN-VP30-DD原核表达载体的构建;2)PIN-VP30-DD蛋白的原核表达纯化;属于生物医药【技术领域】。
【专利说明】_种治疗Ebola病毒的药物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种生物药物,具体地说,是一种治疗Ebola病毒的药物,本发明该 公开了该药物的制备方法,属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒(EBOV)是引起人类和灵长类动物发生埃博拉出血热(EBHF)的烈 性病毒,由此引起的出血热是当今世界上最致命的病毒性出血热,已造成10次具有规模 的爆发流行。目前没有针对Ebola病毒的特效药物。Emily P等人用纳米级的脂包被的 siRNA(nucleoprotein为革El基因)治疗Ebola病毒,目前这个实验还在进行之中,由于它只 是抑制转录,所以很难根治。
【发明内容】
[0003] 针对上述不足,本发明的目的在于提供一种制备方法简单,用于治疗埃博拉病毒 的药物及其制备方法。
[0004] 为解决上述技术问题,本发明提供的第一个技术方案是这样的:该治疗Ebola病 毒的药物,所述的药物为特异切割Ebola病毒RNA的融合蛋白PIN-VP30_ DD,基因序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0005] 进一步的,上述的治疗Ebola病毒的药物,所述的药物通过下述步骤制备:
[0006] I) PIN-VP30_DD原核表达载体的构建
[0007] 以Ebola病毒RNA为模板,进行RT-PCR,然后扩增VP30片段,并进行点突变,即突 变成 VP30_dd;
[0008] PCR扩增PIN,然后两个PCR片段融合,克隆到PET-16b的BamHI和NdeI位点;
[0009] 2) PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化
[0010] 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养,在12-18°C经IPTG 过夜诱导,收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体,经过高压破碎后离心获得可溶性的上清, 进行Ni柱亲和层析;待目的蛋白与Ni柱结合之后,先用漂洗液洗涤,在用洗脱缓冲液洗 涤,在用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的PBS溶液,之后进行 SDS-PAGE的检测,所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白;
[0011] 为制备该药物,本发明的另外一个技术方案是提供该治疗Ebola病毒药物的方 法,该方法依次包括下述步骤:
[0012] 1)PIN-VP30_DD原核表达载体的构建
[0013] 序列合成PIN-VP30_DD,然后以PIN-VP30_DD为模板,进行PCR扩增,然后克隆到 PET-16b 的 BamHI 和 NdeI 位点;
[0014] 2) PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化
[0015] 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养,在12-18°C经IPTG 过夜诱导,收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体,经过高压破碎后离心获得可溶性的上清, 进行Ni柱亲和层析;待目的蛋白与Ni柱结合之后,先用漂洗液洗涤,在用洗脱缓冲液洗 涤,在用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的PBS溶液,之后进行 SDS-PAGE的检测,所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白。
[0016] 上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,所述的漂洗液由下述组分构成:20mM Tri s-HCl,500mM NaCl,5 % 甘油,60mM 咪唑。
[0017] 进一步的,上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,所述的漂洗液pH8. 0。
[0018] 上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,所述的洗脱缓冲液由下述组分构成: 20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5%甘油,500mM 咪唑。
[0019] 进一步的,上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,所述的pH8. 0。
[0020] 进一步的,上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,所述的脱盐柱为ro-10脱盐 柱。
[0021] 与现有技术相比,本发明提供的技术方案,将一个RNA非序列特异性的切割 Domain PIN与VP30_DD进行融合,构建成PIN-VP30 _DD融合蛋白,该蛋白可以特异性切割 Ebola病毒RNA,从而可以用来Ebola病毒感染的病毒治疗。
[0022] VP30是Ebola病毒的一个特异性RNA结合蛋白,有288个氨基酸组成,它参与这 个病毒的转录开始。VP30的磷酸化,调节它与NP的结合,从而影响转录的调节。VP30在氨 基酸(aa 29 31 and 42 46)有两个和三个磷酸化位点,把这几个丝氨酸突变成天冬氨酸, 即VP30_DD。该蛋白降低Ebola病毒mRNA的合成,但是该蛋白仍然保留了特异的RNA结合特 性。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1是本发明提供的PIN-VP30-DD蛋白特异的切割Ebola virus病毒RNA。检测 图谱。
【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本发明的权利要求做进一步的详细说明,但不构成对本发明 的任何限制,任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改,仍在本发明的权利要 求保护范围之内。
[0024] 实施例1
[0025] 本发明提供的一种治疗Ebola病毒的药物,该药物为特异切割Ebola病毒RNA的 融合蛋白PIN-VP30_ DD,基因序列如SEQ ID N0:1所示。
[0026] 该药物由下述步骤依次制备:
[0027] I. PIN_VP30_DD原核表达载体的构建。
[0028] 序列合成PIN-VP30_ddDNA融合序列,克隆到PET-16b的BamHI和NdeI位点。具 体序列如SEQ ID NO :1所示:
[0029] 以 PIN-VP30, DNA 融合序列为模板,用引物 PET-16b_F:TTGTTAGCAGCCGGATCCATG GAAGCTTCATATGAGAGAGGAC(SEQ ID N0:2)和引物 PET-16b_R:ATCGAAGGTCGTCATATGTTATAGC CGGATTGGCTCCTCTT(SEQ ID NO :3)进行 PCR 扩增,然后 Infusion 克隆到 PET-16b 的 BamHI 和NdeI位点。即为原核表达载体PET-16b-PIN-VP30_DD
[0030] 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化。
[0031] 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养,在16°C经IPTG过 夜诱导,分别收集所得到的PIN-VP30_ DD蛋白菌体,经过高压破碎后离心获得可溶性的上清, 进行Ni柱亲和层析。待目的蛋白与Ni柱结合之后,先用漂洗液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5% (v/v)甘油,60mM 咪唑,pH8. 0)洗涤,之后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5% (v/v)甘油,500mM咪唑,pH8.0)。利用PD-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液 置换成含有20 %甘油的PBS溶液,之后进行SDS-PAGE的检测。所得即为纯化的PIN-VP30_dd 蛋白具体序列如SEQ ID NO :4所不。
[0032] 为了更好的说明本发明的效果,下面给出PIN_VP30_DD蛋白活性的验证方法:
[0033] PIN-VP30_DD蛋白与Ebola virus病毒RNA进行孵育,经过RT-PCR检查。发现 PIN-VP30_DD能够特异的切割Ebola virus病毒RNA。
[0034] 具体实验如下:
[0035] PIN-VP30_DD蛋白与 Ebola virus 病毒 RNA 的切割实验。
[0036] 取Ebola virus病毒感染的细胞。然后把PIN_VP30_DD克隆到真核表达载体上(慢 病毒),然后用这个病毒感染这株细胞。24小时后,用荧光RT-PCR检查Ebola virus病毒 RNA,与对照相比,实验组的Ebola virus病毒RNA明显减少,甚至消失。这个实验说明, PIN-VP30_DD蛋白可以特异的切割Ebola virus病毒RNA。检测图谱如图1所示。
【权利要求】
1. 一种治疗Ebola病毒的药物,其特征在于,所述的药物为特异切割Ebola病毒RNA的 融合蛋白PIN-VP30_DD,基因序列如SEQ ID N0:1所示。
2. 根据权利要求1所述的治疗Ebola病毒的药物,其特征在于,所述的药物通过下述步 骤制备: 1. PIN-VP30_DD原核表达载体的构建 序列合成PIN-VP30_DD,然后以PIN-VP30_DD为模板,进行PCR扩增,然后克隆到PET-16b 的BamHI和Ndel位点; 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养,在12-18°C经IPTG过夜 诱导,收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体,经过高压破碎后离心获得可溶性的上清,进行 Ni柱亲和层析;待目的蛋白与Ni柱结合之后,先用漂洗液洗涤,在用洗脱缓冲液洗涤,在 用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20 %甘油的PBS溶液,之后进行SDS-PAGE 的检测,所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白。
3. 制备权利要求1所述的治疗Ebola病毒药物的方法,其特征在于,该方法依次包括下 述步骤: 1. PIN-VP30_DD原核表达载体的构建 序列合成PIN-VP30_DD,然后以PIN-VP30_DD为模板,进行PCR扩增,然后克隆到PET-16b 的BamHI和Ndel位点; 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养,在12-18°C经IPTG过夜 诱导,收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体,经过高压破碎后离心获得可溶性的上清,进行 Ni柱亲和层析;待目的蛋白与Ni柱结合之后,先用漂洗液洗涤,在用洗脱缓冲液洗涤,在 用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20 %甘油的PBS溶液,之后进行SDS-PAGE 的检测,所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白。
4. 根据权利要求3所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,其特征在于,所述的漂洗液 由下述组分构成:20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5%甘油,60mM咪唑。
5. 根据权利要求3或者4所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,其特征在于,所述的 漂洗液PH8. 0。
6. 根据权利要求3所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,其特征在于,所述的洗脱缓 冲液由下述组分构成:20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5%甘油,500mM咪唑。
7. 根据权利要求3或者6所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,其特征在于,所述的 pH8. 0〇
8. 根据权利要求3所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法,其特征在于,所述的脱盐柱 为ro-io脱盐柱。
【文档编号】A61K38/00GK104491833SQ201410719533
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】霍依然, 李红梅, 覃启红, 黄龙 申请人:覃启红