一种治疗Ebola病毒的药物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗Ebola病毒的药物及其制备方法，旨在提供一种制备方法简单，用于治疗埃博拉病毒的药物；其技术要点：所述的药物为特异切割Ebola病毒RNA的融合蛋白PIN-VP30-DD，基因序列如SEQ ID NO：1所示；制备方法为：1)PIN-VP30-DD原核表达载体的构建；2)PIN-VP30-DD蛋白的原核表达纯化；属于生物医药【技术领域】。
【专利说明】_种治疗Ebola病毒的药物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种生物药物，具体地说，是一种治疗Ebola病毒的药物，本发明该 公开了该药物的制备方法，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒（EBOV)是引起人类和灵长类动物发生埃博拉出血热（EBHF)的烈 性病毒，由此引起的出血热是当今世界上最致命的病毒性出血热，已造成10次具有规模 的爆发流行。目前没有针对Ebola病毒的特效药物。Emily P等人用纳米级的脂包被的 siRNA(nucleoprotein为革El基因）治疗Ebola病毒，目前这个实验还在进行之中，由于它只 是抑制转录，所以很难根治。
【发明内容】
[0003] 针对上述不足，本发明的目的在于提供一种制备方法简单，用于治疗埃博拉病毒 的药物及其制备方法。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该治疗Ebola病 毒的药物，所述的药物为特异切割Ebola病毒RNA的融合蛋白PIN-VP30_ DD，基因序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0005] 进一步的，上述的治疗Ebola病毒的药物，所述的药物通过下述步骤制备：
[0006] I) PIN-VP30_DD原核表达载体的构建
[0007] 以Ebola病毒RNA为模板，进行RT-PCR，然后扩增VP30片段，并进行点突变，即突 变成 VP30_dd;
[0008] PCR扩增PIN，然后两个PCR片段融合，克隆到PET-16b的BamHI和NdeI位点；
[0009] 2) PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化
[0010] 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，在12-18°C经IPTG 过夜诱导，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清， 进行Ni柱亲和层析；待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，在用洗脱缓冲液洗 涤，在用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的PBS溶液，之后进行 SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白；
[0011] 为制备该药物，本发明的另外一个技术方案是提供该治疗Ebola病毒药物的方 法，该方法依次包括下述步骤：
[0012] 1)PIN-VP30_DD原核表达载体的构建
[0013] 序列合成PIN-VP30_DD,然后以PIN-VP30_DD为模板，进行PCR扩增，然后克隆到 PET-16b 的 BamHI 和 NdeI 位点；
[0014] 2) PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化
[0015] 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，在12-18°C经IPTG 过夜诱导，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清， 进行Ni柱亲和层析；待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，在用洗脱缓冲液洗 涤，在用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的PBS溶液，之后进行 SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白。
[0016] 上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，所述的漂洗液由下述组分构成：20mM Tri s-HCl，500mM NaCl，5 % 甘油，60mM 咪唑。
[0017] 进一步的，上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，所述的漂洗液pH8. 0。
[0018] 上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，所述的洗脱缓冲液由下述组分构成： 20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，500mM 咪唑。
[0019] 进一步的，上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，所述的pH8. 0。
[0020] 进一步的，上述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，所述的脱盐柱为ro-10脱盐 柱。
[0021] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案，将一个RNA非序列特异性的切割 Domain PIN与VP30_DD进行融合，构建成PIN-VP30 _DD融合蛋白，该蛋白可以特异性切割 Ebola病毒RNA，从而可以用来Ebola病毒感染的病毒治疗。
[0022] VP30是Ebola病毒的一个特异性RNA结合蛋白，有288个氨基酸组成，它参与这 个病毒的转录开始。VP30的磷酸化，调节它与NP的结合，从而影响转录的调节。VP30在氨 基酸（aa 29 31 and 42 46)有两个和三个磷酸化位点，把这几个丝氨酸突变成天冬氨酸， 即VP30_DD。该蛋白降低Ebola病毒mRNA的合成，但是该蛋白仍然保留了特异的RNA结合特 性。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1是本发明提供的PIN-VP30-DD蛋白特异的切割Ebola virus病毒RNA。检测 图谱。
【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明 的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要 求保护范围之内。
[0024] 实施例1
[0025] 本发明提供的一种治疗Ebola病毒的药物，该药物为特异切割Ebola病毒RNA的 融合蛋白PIN-VP30_ DD，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
[0026] 该药物由下述步骤依次制备：
[0027] I. PIN_VP30_DD原核表达载体的构建。
[0028] 序列合成PIN-VP30_ddDNA融合序列，克隆到PET-16b的BamHI和NdeI位点。具 体序列如SEQ ID NO :1所示：
[0029] 以 PIN-VP30, DNA 融合序列为模板，用引物 PET-16b_F:TTGTTAGCAGCCGGATCCATG GAAGCTTCATATGAGAGAGGAC(SEQ ID N0:2)和引物 PET-16b_R:ATCGAAGGTCGTCATATGTTATAGC CGGATTGGCTCCTCTT(SEQ ID NO :3)进行 PCR 扩增，然后 Infusion 克隆到 PET-16b 的 BamHI 和NdeI位点。即为原核表达载体PET-16b-PIN-VP30_DD
[0030] 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化。
[0031] 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，在16°C经IPTG过 夜诱导，分别收集所得到的PIN-VP30_ DD蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清， 进行Ni柱亲和层析。待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5% (v/v)甘油，60mM 咪唑，pH8. 0)洗涤，之后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5% (v/v)甘油，500mM咪唑，pH8.0)。利用PD-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液 置换成含有20 %甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE的检测。所得即为纯化的PIN-VP30_dd 蛋白具体序列如SEQ ID NO :4所不。
[0032] 为了更好的说明本发明的效果，下面给出PIN_VP30_DD蛋白活性的验证方法：
[0033] PIN-VP30_DD蛋白与Ebola virus病毒RNA进行孵育，经过RT-PCR检查。发现 PIN-VP30_DD能够特异的切割Ebola virus病毒RNA。
[0034] 具体实验如下：
[0035] PIN-VP30_DD蛋白与 Ebola virus 病毒 RNA 的切割实验。
[0036] 取Ebola virus病毒感染的细胞。然后把PIN_VP30_DD克隆到真核表达载体上（慢 病毒），然后用这个病毒感染这株细胞。24小时后，用荧光RT-PCR检查Ebola virus病毒 RNA，与对照相比，实验组的Ebola virus病毒RNA明显减少，甚至消失。这个实验说明， PIN-VP30_DD蛋白可以特异的切割Ebola virus病毒RNA。检测图谱如图1所示。
【权利要求】
1. 一种治疗Ebola病毒的药物，其特征在于，所述的药物为特异切割Ebola病毒RNA的 融合蛋白PIN-VP30_DD，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
2. 根据权利要求1所述的治疗Ebola病毒的药物，其特征在于，所述的药物通过下述步 骤制备： 1. PIN-VP30_DD原核表达载体的构建 序列合成PIN-VP30_DD，然后以PIN-VP30_DD为模板，进行PCR扩增，然后克隆到PET-16b 的BamHI和Ndel位点； 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，在12-18°C经IPTG过夜 诱导，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清，进行 Ni柱亲和层析；待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，在用洗脱缓冲液洗涤，在 用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20 %甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE 的检测，所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白。
3. 制备权利要求1所述的治疗Ebola病毒药物的方法，其特征在于，该方法依次包括下 述步骤： 1. PIN-VP30_DD原核表达载体的构建 序列合成PIN-VP30_DD，然后以PIN-VP30_DD为模板，进行PCR扩增，然后克隆到PET-16b 的BamHI和Ndel位点； 2. PIN-VP30_DD蛋白的原核表达纯化 将带有重组质粒PIN-VP30_DD的大肠杆菌BL21菌种扩大培养，在12-18°C经IPTG过夜 诱导，收集所得到的PIN-VP30_DD蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的上清，进行 Ni柱亲和层析；待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液洗涤，在用洗脱缓冲液洗涤，在 用脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20 %甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE 的检测，所得即为纯化的PIN-VP30_DD蛋白。
4. 根据权利要求3所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，其特征在于，所述的漂洗液 由下述组分构成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，60mM咪唑。
5. 根据权利要求3或者4所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，其特征在于，所述的 漂洗液PH8. 0。
6. 根据权利要求3所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，其特征在于，所述的洗脱缓 冲液由下述组分构成：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5%甘油，500mM咪唑。
7. 根据权利要求3或者6所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，其特征在于，所述的 pH8. 0〇
8. 根据权利要求3所述的治疗Ebola病毒药物的制备方法，其特征在于，所述的脱盐柱 为ro-io脱盐柱。
【文档编号】A61K38/00GK104491833SQ201410719533
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】霍依然, 李红梅, 覃启红, 黄龙 申请人:覃启红