一种用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗及其制备方法
【专利摘要】一种用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗及其制备方法。所述疫苗中蛋白为乙肝表面抗原，细菌多糖选自b型流感嗜血杆菌多糖，A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌多糖，伤寒沙门氏菌Vi型多糖，B群链球菌Ia型等，肺炎球菌血清型1、2型等，副伤寒沙门菌甲型或副伤寒沙门菌乙型中的任意一种或几种。动物实验表明，其疫苗中细菌多糖及乙肝表面抗原的抗体阳转率均在85％以上，抗体阳转率较高，其载体蛋白不仅起到了将细菌多糖由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原的作用，同时起到了对乙肝病毒引起疾病的预防，解决了2岁以下婴幼儿的免疫接种问题，又达到一针多免的效果，扩大了疫苗的使用人群和覆盖率。
【专利说明】一种用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫 苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人用疫苗【技术领域】，具体涉及用以乙肝表面抗原为载体蛋白制备的细 菌多糖蛋白结合物制成的单价或多价疫苗制品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 细菌多糖是细菌的主要毒力因子之一，具有较好的免疫原性，可诱发机体产生有 效的保护性抗体。但细菌多糖属于非T细胞依赖性抗原，对免疫系统机能发育不完善的2 岁以下的婴幼儿，不能诱导有效的保护性抗体，且不能产生免疫记忆。而将细菌多糖抗原与 载体蛋白共价结合后，可将细菌多糖由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，使细 菌多糖也能对2岁以下的婴幼儿产生有效的抗体保护，从而也扩大了疫苗的使用人群。但 目前国内外上市销售的细菌多糖蛋白结合疫苗，仅用于预防细菌多糖抗原引起的疾病，而 载体蛋白只起到将细菌多糖由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原的作用。
[0003] 鉴于此， 申请人:发明了一种用以乙肝表面抗原为蛋白载体制备的细菌性多糖蛋白 结合物制成的疫苗，其中的乙肝表面抗原不仅起到了将细菌多糖结合疫苗由非T细胞依赖 性抗原转化为T细胞依赖性抗原的作用；而且起到了有效预防载体蛋白（乙肝表面抗原） 引起的疾病。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在疫苗中载体蛋白仅起到将细菌多 糖由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原的作用的缺陷。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖 蛋白结合物疫苗及其制备方法，该疫苗使用后，既能产生针对细菌多糖的抗原的特异性抗 体，又能产生针对乙肝表面抗原的特异性抗体，克服了疫苗中载体蛋白仅起到将细菌多糖 由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原的作用的缺陷，达到一针多免的效果。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 1. -种用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗，其特征在于：所 述疫苗中含有的蛋白为乙肝表面抗原，所述疫苗中含有的细菌多糖选自b型流感嗜血杆菌 多糖，奈瑟氏脑膜炎球菌血清群A群、C群、Y群、W135群多糖，伤寒沙门氏菌Vi型多糖，B群 链球菌la、lb、II、III、V型，肺炎球菌血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，副伤寒沙门菌甲型或副伤寒沙门菌乙型中的任意 一种或几种。
[0008] 2.根据技术方案1所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫 苗，其特征在于：各细菌多糖分别以共价键与乙肝表面抗原相连接成细菌多糖蛋白结合物。
[0009] 3.根据技术方案2所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫 苗，其特征在于：所述的细菌多糖蛋白结合物中总的细菌多糖与乙肝表面抗原的质量比为 1:0. 1 ?1:5。
[0010] 4.根据技术方案1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结 合物疫苗，其特征在于：所述的乙肝病毒表面抗原为天然乙肝病毒表面抗原或重组乙肝表 面抗原。
[0011] 5.根据技术方案1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结 合物疫苗，其特征在于：所述的疫苗为液体制剂、固体颗粒剂、半固体剂或液体制剂与固体 颗粒剂组合的组合剂。
[0012] 6.根据技术方案4所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫 苗，其特征在于：所述的疫苗为液体制剂、固体颗粒剂、半固体剂或液体制剂与固体颗粒剂 组合的组合剂。
[0013] 7.根据技术方案1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结 合物疫苗，其特征在于：所述的疫苗为注射剂、鼻用制剂、凝胶剂或控释胶囊剂。
[0014] 8.根据技术方案4所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫 苗，其特征在于：所述的疫苗为注射剂、鼻用制剂、凝胶剂或控释胶囊剂。
[0015] 9.根据技术方案1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结 合物疫苗，其特征在于：所述的疫苗中还含有铝佐剂或一种含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的 脱氧核糖核酸片段。
[0016] 10.根据技术方案4所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫 苗，其特征在于：所述的疫苗中还含有铝佐剂或一种含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核 糖核酸片段。
[0017] 11. -种用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合物疫苗的制备方 法，包括以下步骤：
[0018] (1)细菌多糖溶解
[0019] 将一种细菌多糖用0. 2mol/L的NaCl溶解为1?20mg/ml的浓度；所述的一种细 菌多糖为b型流感嗜血杆菌多糖，奈瑟氏脑膜炎球菌血清群A群、C群、Y群、W135群多糖， 伤寒沙门氏菌￥1型多糖，8群链球菌1&、113、11、111、￥型，肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6八、 6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，副伤寒沙门菌甲型 或副伤寒沙门菌乙型中的任意一种；
[0020] (2)细菌多糖活化
[0021] 在步骤（1)溶解的细菌多糖溶液中加入多糖活化剂得活化的细菌多糖，加入的多 糖活化剂的质量：细菌多糖质量比为〇. 1 :1?1. 5:1，所述的多糖活化剂为溴化氰、1-氰 基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯、碳二亚胺、3-(2-吡啶基二硫基）丙酸、N-羟基琥珀酰亚 胺酯中的任意一种；
[0022] (3)细菌多糖衍生
[0023] 在步骤（2)所得的活化的细菌多糖中按活化的细菌多糖：双功能链接剂的质量比 为1:2?1:5的比列加入双功能链接剂进行细菌多糖的衍生得细菌多糖衍生物，所述的双 功能链接剂为己二酰肼、聚乙二醇、己二胺或己二醇中的任意一种；
[0024] (4)细菌多糖衍生物的超滤
[0025] 将步骤（3)得到的细菌多糖衍生物经1?30KD的超滤膜超滤冻干得细菌多糖衍 生物；
[0026] (5)细菌多糖与蛋白结合
[0027] 用0. 2mol/L的NaCl将步骤（4)得到的细菌多糖衍生物溶解至细菌多糖衍生物 的浓度为2?20mg/ml后；按细菌多糖衍生物：乙肝表面抗原的质量比为1:0. 4?1:2的 比例加入载体蛋白中，然后加入碳二亚胺至碳二亚胺浓度为0. 001?0. 2mol/L，维持pH为 5. 5±0. 5,反应2?4小时，得一种细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物；
[0028] (6)将步骤（5)所得一种细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物用凝胶柱进行纯 化，收集％ (无法进入凝胶过滤柱料的分子的洗脱体积）附近的吸收峰，除菌过滤即得纯化 后的单价细菌多糖蛋白结合物原液；
[0029] (7)制备疫苗液体制剂
[0030] 在步骤（6)所得的纯化后的单价细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化 钠、磷酸盐缓液和铝佐剂，使细菌多糖的浓度为g/ml?60iig/ml、氯化钠浓度为4? 9mg/ml、磷酸氢二钠浓度为38?72yg/ml、磷酸二氢钠浓度为24?88yg/ml，所述错佐剂 为氢氧化错或磷酸错，使氢氧化错浓度为〇. 5?2. 5mg/ml,或磷酸错浓度为0. 5?2.Omg/ ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合物疫苗液体制剂；
[0031] 或（8)制备疫苗固体颗粒剂
[0032] 在步骤（6)所得的纯化后的单价细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化 钠和稳定剂，使细菌多糖的浓度为4iig/ml?60iig/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ml、所述稳 定剂为乳糖或鹿糖或甘氨酸，使乳糖浓度为8?25mg/ml;或鹿糖浓度为40?120mg/ml;或 甘氨酸浓度为20?80mg/ml，冻干即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白 结合物疫苗固体颗粒剂；
[0033] 或（9)制备疫苗半固体剂
[0034] 在步骤（6)所得的纯化后的单价细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化 钠和赋形剂，使细菌多糖的浓度为4iig/ml?60iig/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ml、所述赋 形剂为羧甲基纤维素钠或卡波姆，使羧甲基纤维素钠浓度为10?30mg/ml,或卡波姆浓度 为5?20mg/ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合物疫苗半固 体剂。
[0035] 12.-种用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价以上细菌多糖蛋白结合物疫苗的制备 方法，包括以下步骤：
[0036] (1)制备一种细菌多糖衍生物
[0037] 按权利要求11中步骤（1)至步骤（4)的方法制备得到任一种细菌多糖衍生物；
[0038] (2)细菌多糖与蛋白结合
[0039] 将两种以上细菌多糖衍生物分别按各细菌多糖衍生物之间的质量比为1:1?1 : 4的比例混合后，用0. 2mol/L的NaCl将混合后的细菌多糖衍生物溶解至混合后的细菌多 糖衍生物浓度为2?20mg/ml;再按总细菌多糖衍生物：乙肝表面抗原的质量比为1:0. 4? 1:2的比例加入载体蛋白中，然后，加入碳二亚胺至碳二亚胺浓度为0. 001?0. 2mol/L，维 持pH为5. 5±0. 5,反应2?4小时，得两价以上细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物；
[0040] (3)纯化
[0041]将步骤（2)所得两价以上细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物用凝胶柱进行 纯化，收集％附近的吸收峰，除菌过滤即得纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液；[0042] (4)制备疫苗液体制剂
[0043]在步骤（3)所得的纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、 氯化钠、磷酸盐缓液和铝佐剂，使总细菌多糖的浓度为8. 8yg/ml?300yg/ml、氯化钠浓 度为4?9mg/ml、磷酸氢二钠浓度为38?72iig/ml、磷酸二氢钠浓度为24?88iig/ml，所 述错佐剂为氢氧化错或磷酸错，使氢氧化错浓度为0. 5?2. 5mg/ml,或磷酸错浓度为0. 5? 2.Omg/ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价以上细菌多糖蛋白结合物疫苗液体制 齐U;所述总细菌多糖的浓度是各细菌多糖质量之和的浓度；
[0044] 或（5)制备疫苗固体颗粒剂
[0045] 在步骤（3)所得的纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、 氯化钠和稳定剂，使总细菌多糖的浓度为8. 8iig/ml?300iig/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ ml、所述稳定剂为乳糖或蔗糖或甘氨酸，使乳糖浓度为8?25mg/ml;或蔗糖浓度为40? 120mg/ml，或甘氨酸浓度为20?80mg/ml，冻干即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价 以上细菌多糖蛋白结合物疫苗固体颗粒剂；所述总细菌多糖的浓度是各细菌多糖质量之和 的浓度；
[0046] 或（6)制备疫苗半固体剂
[0047] 在步骤（3)所得的纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、 氯化钠和赋形剂，使总细菌多糖的浓度为8. 8iig/ml?300iig/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ ml、所述赋形剂为羧甲基纤维素钠或卡波姆，使羧甲基纤维素钠浓度为10?30mg/ml,或卡 波姆浓度为5?20mg/ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价以上细菌多糖蛋白结 合物疫苗半固体剂；所述总细菌多糖的浓度是各细菌多糖质量之和的浓度。
[0048] 本发明提供的疫苗，可通过注射、口服、滴鼻、外敷的方法进行免疫，用于预防细菌 多糖对应的血清型病原菌引起的疾病和乙型肝炎病毒引起的疾病。
[0049] 与现有结合物疫苗制品相比，本发明的有益效果是：
[0050] 1、动物试验表明，本发明疫苗既能产生较高的细菌多糖的抗体阳转率（阳转率 85%以上），同时乙肝表面抗原的小鼠效率试验也很好（抗体阳转率85%以上）。表明本发 明疫苗中的载体蛋白不仅起到了将细菌多糖由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗 原的作用，而且同时起到了对乙肝病毒引起疾病的预防。本发明疫苗既扩大了疫苗的使用 人群，解决了 2岁以下婴幼儿的免疫接种问题，又达到了一针多免的效果。克服了现有结合 物疫苗中载体蛋白仅起到将细菌多糖由非T细胞依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原的作 用的缺陷。
[0051] 2、本发明疫苗扩大了疫苗的使用人群和覆盖率，减少了疫苗接种人群注射疫苗的 次数，减少了注射带来的痛苦。
[0052] 3、本发明制备方法制备的细菌多糖-乙肝表面抗原结合疫苗，很好的保留了细菌 多糖抗原和乙肝表面抗原的抗原性和免疫原性。
【具体实施方式】
[0053]以下各实施例无特殊说明均为常规技术，各实施例中各种试剂、原料等均为市售 产品，各型细菌菌种无特殊说明均购买自中国医学微生物学菌种保藏中心。以下各实施例 用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围。
[0054] 实施例1?实施例5为细菌多糖的制备。实施例6:乙肝表面抗原的制备。实施 例7 :细菌多糖-己二酰肼衍生物的制备。实施例8 (1)?（13):细菌多糖-乙肝表面抗原 结合物原液的制备；实施例9(1)?（13):疫苗制品的制备。实施例10 :疫苗制品的有效性 试验。实施例11(1)?（4):疫苗制品的安全性试验。实施例12 :试验结果统计分析。
[0055] 实施例1B群链球菌和肺炎链球菌多糖的制备
[0056] (1)发酵：分别用la型B群链球菌、lb型B群链球菌、II型B群链球菌、III型B 群链球菌、V型B群链球菌、1型肺炎球菌、2型肺炎球菌、3型肺炎球菌、4型肺炎球菌、5型 肺炎球菌、6A型肺炎球菌、6B型肺炎球菌、7F型肺炎球菌、8型肺炎球菌、9N型肺炎球菌、9V 型肺炎球菌、10A型肺炎球菌、11A型肺炎球菌、14型肺炎球菌、15B型肺炎球菌、17F型肺炎 球菌、18C型肺炎球菌、19A型肺炎球菌、19F型肺炎球菌、20型肺炎球菌、22F型肺炎球菌、 23F型肺炎球菌或33F型肺炎球菌的工作种子，分别接种于改良半综合培养基中，35?37°C 二氧化碳环境中培养4?12小时，当培养液0D_ > 2时，加入脱氧胆酸钠至脱氧胆酸钠浓 度为1%。（质量体积分数）进行杀菌。
[0057] (2)粗纯：离心收集上清，加入乙醇至乙醇浓度40%体积分数，再离心收集上清， 再加入乙醇至乙醇浓度75%体积分数，再离心收集沉淀；
[0058] (3)精纯：沉淀用0. 3mol/L的中性乙酸钠溶液溶解，加入冷酚抽提数次，去除蛋 白；收集上清，超滤,加入乙醇至乙醇浓度35%体积分数，离心收集上清；上清超滤，收集回 流端，加入乙醇至乙醇浓度75%体积分数，收集沉淀；用丙酮、乙醚洗涤沉淀，抽干，即分别 得纯化的la型B群链球菌多糖、lb型B群链球菌多糖、II型B群链球菌多糖、III型B群链 球菌多糖、V型B群链球菌多糖、1型肺炎球菌多糖、2型肺炎球菌多糖、3型肺炎球菌多糖、4 型肺炎球菌多糖、5型肺炎球菌多糖、6A型肺炎球菌多糖、6B型肺炎球菌多糖、7F型肺炎球 菌多糖、8型肺炎球菌多糖、9N型肺炎球菌多糖、9V型肺炎球菌多糖、10A型肺炎球菌多糖、 11A型肺炎球菌多糖、14型肺炎球菌多糖、15B型肺炎球菌多糖、17F型肺炎球菌多糖、18C型 肺炎球菌多糖、19A型肺炎球菌多糖、19F型肺炎球菌多糖、20型肺炎球菌多糖、22F型肺炎 球菌多糖、23F型肺炎球菌多糖、或33F型肺炎球菌多糖。
[0059] 所述改良半综合培养基为：
【权利要求】
1. 一种用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗，其特征在于：所述疫 苗中含有的蛋白为乙肝表面抗原，所述疫苗中含有的细菌多糖选自b型流感嗜血杆菌多 糖，奈瑟氏脑膜炎球菌血清群A群、C群、Y群、W135群多糖，伤寒沙门氏菌Vi型多糖，B群 链球菌 la、lb、II、III、V 型，肺炎球菌血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F，副伤寒沙门菌甲型或副伤寒沙门菌乙型中的任意 一种或几种。
2. 根据权利要求1所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗，其 特征在于：各细菌多糖分别以共价键与乙肝表面抗原相连接成细菌多糖蛋白结合物。
3. 根据权利要求2所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗， 其特征在于：所述的细菌多糖蛋白结合物中总的细菌多糖与乙肝表面抗原的质量比为 1:0. 1 ?1:5。
4. 根据权利要求1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物 疫苗，其特征在于：所述的乙肝病毒表面抗原为天然乙肝病毒表面抗原或重组乙肝表面抗 原。
5. 根据权利要求1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物 疫苗，其特征在于：所述的疫苗为液体制剂、固体颗粒剂、半固体剂或液体制剂与固体颗粒 剂组合的组合剂。
6. 根据权利要求4所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗，其 特征在于：所述的疫苗为液体制剂、固体颗粒剂、半固体剂或液体制剂与固体颗粒剂组合的 组合剂。
7. 根据权利要求1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物 疫苗，其特征在于：所述的疫苗为注射剂、鼻用制剂、凝胶剂或控释胶囊剂。
8. 根据权利要求4所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗，其 特征在于：所述的疫苗为注射剂、鼻用制剂、凝胶剂或控释胶囊剂。
9. 根据权利要求1或2或3所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物 疫苗，其特征在于：所述的疫苗中还含有铝佐剂或一种含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的脱氧 核糖核酸片段。
10. 根据权利要求4所述的用乙肝表面抗原为载体蛋白的细菌多糖蛋白结合物疫苗， 其特征在于：所述的疫苗中还含有铝佐剂或一种含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核糖核 酸片段。
11. 一种用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合物疫苗的制备方法，包 括以下步骤： (1) 细菌多糖溶解 将一种细菌多糖用〇. 2mol/L的NaCl溶解为1?20mg/ml的浓度；所述的一种细菌多 糖为b型流感嗜血杆菌多糖，奈瑟氏脑膜炎球菌血清群A群、C群、Y群、W135群多糖，伤寒 沙门氏菌Vi型多糖，B群链球菌la、lb、II、III、V型，肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、 7卩、8、9队听、1(^、1认、14、158、17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩，副伤寒沙门菌甲型或副 伤寒沙门菌乙型中的任意一种； (2) 细菌多糖活化 在步骤（1)溶解的细菌多糖溶液中加入多糖活化剂得活化的细菌多糖，加入的多糖 活化剂的质量：细菌多糖质量比为0. 1 :1?1. 5:1，所述的多糖活化剂为溴化氰、1-氰 基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯、碳二亚胺、3-(2-吡啶基二硫基）丙酸、N-羟基琥珀酰亚 胺酯中的任意一种； (3) 细菌多糖衍生 在步骤（2)所得的活化的细菌多糖中按活化的细菌多糖：双功能链接剂的质量比为 1:2?1:5的比列加入双功能链接剂进行细菌多糖的衍生得细菌多糖衍生物，所述的双功 能链接剂为己二酰肼、聚乙二醇、己二胺或己二醇中的任意一种； (4) 细菌多糖衍生物的超滤 将步骤（3)得到的细菌多糖衍生物经1?30KD的超滤膜超滤冻干得细菌多糖衍生物； (5) 细菌多糖与蛋白结合 用0. 2mol/L的NaCl将步骤（4)得到的细菌多糖衍生物溶解至细菌多糖衍生物的浓 度为2?20mg/ml后；按细菌多糖衍生物：乙肝表面抗原的质量比为1:0. 4?1:2的比 例加入载体蛋白中，然后加入碳二亚胺至碳二亚胺浓度为〇. 001?〇. 2mol/L，维持pH为 5. 5±0. 5,反应2?4小时，得一种细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物； (6) 将步骤（5)所得一种细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物用凝胶柱进行纯化， 收集％ (无法进入凝胶过滤柱料的分子的洗脱体积）附近的吸收峰，除菌过滤即得纯化后 的单价细菌多糖蛋白结合物原液； (7) 制备疫苗液体制剂 在步骤（6)所得的纯化后的单价细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化钠、 磷酸盐缓液和铝佐剂，使细菌多糖的浓度为4 y g/ml?60 y g/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ ml、磷酸氢二钠浓度为38?72 ii g/ml、磷酸二氢钠浓度为24?88 ii g/ml，所述错佐剂为氢 氧化错或磷酸错，使氢氧化错浓度为〇. 5?2. 5mg/ml，或磷酸错浓度为0. 5?2. Omg/ml，即 制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合物疫苗液体制剂； 或（8)制备疫苗固体颗粒剂 在步骤（6)所得的纯化后的单价细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化钠和 稳定剂，使细菌多糖的浓度为4 y g/ml?60 y g/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ml、所述稳定剂 为乳糖或蔗糖或甘氨酸，使乳糖浓度为8?25mg/ml ;或蔗糖浓度为40?120mg/ml ;或甘氨 酸浓度为20?80mg/ml，冻干即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合 物疫苗固体颗粒剂； 或（9)制备疫苗半固体剂 在步骤（6)所得的纯化后的单价细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化钠和 赋形剂，使细菌多糖的浓度为4 y g/ml?60 y g/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ml、所述赋形剂 为羧甲基纤维素钠或卡波姆，使羧甲基纤维素钠浓度为10?30mg/ml,或卡波姆浓度为5? 20mg/ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的单价细菌多糖蛋白结合物疫苗半固体剂。
12. -种用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价以上细菌多糖蛋白结合物疫苗的制备方 法，包括以下步骤： (1)制备一种细菌多糖衍生物 按权利要求11中步骤（1)至步骤（4)的方法制备得到任一种细菌多糖衍生物； (2) 细菌多糖与蛋白结合 将两种以上细菌多糖衍生物分别按各细菌多糖衍生物之间的质量比为1:1?1 :4的比 例混合后，用0. 2mol/L的NaCl将混合后的细菌多糖衍生物溶解至混合后的细菌多糖衍生 物浓度为2?20mg/ml ;再按总细菌多糖衍生物：乙肝表面抗原的质量比为1:0. 4?1:2的 比例加入载体蛋白中，然后，加入碳二亚胺至碳二亚胺浓度为0. 001?0. 2mol/L，维持pH为 5. 5±0. 5,反应2?4小时，得两价以上细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物； (3) 纯化 将步骤（2)所得两价以上细菌多糖衍生物与载体蛋白共价结合物用凝胶柱进行纯化， 收集％附近的吸收峰，除菌过滤即得纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液； (4) 制备疫苗液体制剂 在步骤（3)所得的纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化 钠、磷酸盐缓液和铝佐剂，使总细菌多糖的浓度为8. 8 y g/ml?300 y g/ml、氯化钠浓度为 4?9mg/ml、磷酸氢二钠浓度为38?72 y g/ml、磷酸二氢钠浓度为24?88 y g/ml，所述 错佐剂为氢氧化错或磷酸错，使氢氧化错浓度为0. 5?2. 5mg/ml,或磷酸错浓度为0. 5? 2. Omg/ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价以上细菌多糖蛋白结合物疫苗液体制 齐U ;所述总细菌多糖的浓度是各细菌多糖质量之和的浓度； 或（5)制备疫苗固体颗粒剂 在步骤（3)所得的纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯 化钠和稳定剂，使总细菌多糖的浓度为8. 8 y g/ml?300 y g/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ ml、所述稳定剂为乳糖或蔗糖或甘氨酸，使乳糖浓度为8?25mg/ml ;或蔗糖浓度为40? 120mg/ml，或甘氨酸浓度为20?80mg/ml，冻干即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价 以上细菌多糖蛋白结合物疫苗固体颗粒剂；所述总细菌多糖的浓度是各细菌多糖质量之和 的浓度； 或（6)制备疫苗半固体剂 在步骤（3)所得的纯化后的两价以上细菌多糖蛋白结合物原液中加入注射用水、氯化 钠和赋形剂，使总细菌多糖的浓度为8. 8 y g/ml?300 y g/ml、氯化钠浓度为4?9mg/ml、 所述赋形剂为羧甲基纤维素钠或卡波姆，使羧甲基纤维素钠浓度为10?30mg/ml,或卡波 姆浓度为5?20mg/ml，即制成用乙肝表面抗原为载体蛋白的两价以上细菌多糖蛋白结合 物疫苗半固体剂；所述总细菌多糖的浓度是各细菌多糖质量之和的浓度。
【文档编号】A61K39/295GK104383532SQ201410723098
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】马波, 陈玉秋, 吴凯, 黄镇, 何建东, 范荣坤, 陶佳明, 白锐琼, 钱雯 申请人:云南沃森生物技术股份有限公司