一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用。本发明miR-185是新发现的调控RAGE基因的一种miRNA分子，其可抑制食管癌细胞的转移。miR-185/RAGE的发现为食管癌分子靶向治疗提供了一新靶点。
【专利说明】一种mi RNA在制备治疗食管癌的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]食管癌是我国发病率极高的一种恶性肿瘤，其死亡率居全国恶性肿瘤死亡率的第二位。由于早期癌细胞浸润局限于粘膜上皮细胞内，未累及食管壁肌层，患者症状不明显，极易漏诊、误诊，目前尚未发现理想的食管癌分子诊断生物标志物。分子靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。因此，深入研宄与食管癌发病机制相关的基因，不仅具有重要的学术价值，而且具有巨大的应用前景和社会效益。
[0003]晚期糖基化终末产物受体(receptorfor advanced glycat1n end products，RAGE)是细胞表面分子免疫球蛋白超家族成员之一，因与晚期糖基化终末产物(advancedglycat1n end products，AGEs)相互作用被发现并因此得名。RAGE通过与其配体结合，激活细胞内包括NF- K B，Racl/Cdc 42，p38 MAPK, JNK/SAPK，ERKI/2等多种信号转导通路，参与疾病的生理和病理过程。最新研宄提示，RAGE配体并不是一段简单的多肽，而是一个配体家族。继 AGEs 之后，高迁移率蛋白 BI (high mobility group BLHMGBl/ Amphoterin)和SlOO/钙粒蛋白是新发现的RAGE配体。HMGBl和S100/钙粒蛋白可由肿瘤细胞分泌，通过RAGE-配体激活细胞，产生多种生物学效应，如增强细胞因子和生长因子的表达，促进细胞迀移，激活转录因子NF-K B等。在不同种类肿瘤中RAGE差异表达。我们前期对RAGE及其变体在食管癌中的表达进行了研宄。发现食管发生癌变时高表达RAGE，且仅与癌浸润深度有关，当侵及肌层及外层后，其表达水平高于局限在黏膜及黏膜下层者。目前，对于食管癌中RAGE表达如何被miR调节及其怎样影响食管癌细胞关键性生理功能，尚不清楚。
[0004]微小RNA (miRNA, miR)是约19~24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，具有高度保守性，能够与革E基因3’非翻译区(Untranslated Reg1ns，UTR)互补结合，降解目的基因mRNA或抑制其翻译，负调控基因表达。我们前期综合运用多种生物信息学软件分析提示miR-185可能作用于RAGE基因，但具体调控机制尚未经过一系列实验证实。最近还研宄表明，肿瘤组织的miR表达谱较正常组织有较大差异，加之肿瘤组织可能存在缺血、坏死、破溃等改变，肿瘤细胞内的miR极可能释放入血，如miR-21、miR-223和miR-17_92表达簇等miR均在多种肿瘤中被证实表达增高，而在肿瘤患者血液中亦检测到这种表达变化。血液不同于其他体液，来源于全身各处，血液中的蛋白质可与miR分子结合在一起，具有良好的稳定性。因此，血循环miR作为生物标记物进行疾病检测展示出良好的临床应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用。
[0006]本发明的技术解决方案是: 一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用。
[0007]所述食管癌是与RAGE表达的相关的食管癌，miRNA作用于RAGE mRNA的3’非翻译区预测靶位。
[0008]通过过表达miR-185抑制食管癌细胞的侵袭和迀移并抑制肺组织癌细胞转移。
[0009]本发明miR-185是新发现的调控RAGE基因的一种miRNA分子，其可抑制食管癌细胞的转移。miR-185/RAGE的发现为食管癌分子靶向治疗提供了一新靶点。
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0011]一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用。
[0012]所述食管癌是与RAGE表达的相关的食管癌，miRNA作用于RAGE mRNA的3’非翻译区预测靶位。
[0013]通过过表达miR-185抑制食管癌细胞的侵袭和迀移并抑制肺组织癌细胞转移。
[0014]本发明miR-185是新发现的调控RAGE基因的一种miRNA分子，其可抑制食管癌细胞的转移。miR-185/RAGE的发现为食管癌分子靶向治疗提供了一新靶点。
[0015]材料和方法 1.临床样本
食管癌标本28例(其中男19例，女9例，年龄50~82岁，中位年龄62岁)由南通大学附属医院提供。标本为未经手术、放疗和化疗等治疗的初诊患者血液标本，经EDTA抗凝、1000 X g、15分钟离心后-70度保存。对照组为南通大学附属医院正常体检者血液共35例。
[0016]2.细胞株及细胞培养
人食管癌细胞系Eca-109购自中国科学院细胞库上海保藏中心。Kyse-30、TE-1l和TE-10购自广州吉尼欧生物科技有限公司。Eca-109、TE-1l和TE-10和Kyse-30细胞分别用RPMI1640、DMDM完全培养基(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μ g /mL链霉素)，5%C02、37°C培养箱内培养，2-3 d换液一次。
[0017]3.质粒的合成与转染
miR-185 mimic激动剂和对照质粒，miR-185Agomir激动剂和对照质粒均购自广州锐博生物科技有限公司。收集处于生长对数期的食管癌细胞，用基础培养基洗涤细胞2~3次，以去除残余的青霉素和链霉素。细胞计数，将细胞悬液以I X 15个/mL的浓度接种至6孔板，每孔加1600 μ I无抗生素培养基，接种24 h后细胞融合度达到40% ;将400 μ I质粒-1ipofectamine 2000加入含1600 μ I无抗生素培养基的培养孔中，轻混匀；6 h后将含有质粒-1ipofectamine 2000混合液的培养基移去，更换新鲜双抗培养基之后，37°C培养1~3 d后检测。
[0018]4.细胞迀移和侵袭试验
细胞迀移试验时，用基础培养基制备细胞悬液，调整细胞密度至2X 104/ml。取细胞悬液100 μ?加入Transwell小室的上室，24孔板下室一般加入600 μ?无抗完培。常规培养24 ho棉签擦去上室上面的多余培养基，倒置，风干。在24孔板中加入500 μ? 0.1%结晶紫染液，染液内有4%甲醛，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，5 min后取出，PBS清洗。倒置显微镜下拍照、计数(视野内直径上分别取4个视野)。统计处理。侵袭实验时，需铺胶。枪头与EP管经冰箱预冷10 min以上，等待Matrigel胶4°C充分液化。将24孔板和Transwell小室在冰上摆放水平，快速的将30 μ? Matrigel胶加入到小室的上室底层，快速均匀铺平，摆放平整，等待凝固；将铺好的胶置于常规细胞培养箱中30 min，待胶上层出现“白色层”时，取出待用，期间处理已接种的细胞，待用，培养48 h后观测。
[0019]5.细胞免疫荧光检测RAGE表达
羊抗人多克隆RAGE抗体购自美国R&D公司。鼠抗人单克隆β-actin抗体购自美国B1vis1n公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊二抗购自美国KPL公司。HRP标记的羊抗鼠二抗购自美国Jackson公司。接种食管癌细胞至24孔板内的小圆片上，I d后细胞密度约达50%~70%;长有细胞的盖玻片用0.01 M PBS洗涤3次；4%多聚甲醛4 °C固定30min后0.01 M PBS洗涤，5 minX 3次；加二抗正常封闭血清封闭(0.3% TritonX-1OO +10%胎牛血清，余PBS补足)，室温孵育30 min，倾去，勿洗；将小园片放载玻片上，加RAGE—抗，4 °C孵育过夜；0.01 M PBS洗涤后加二抗(FITC标记)，室温孵育2~4 h ；0.01 M PBS洗涤后加Hoeschst (1:1000)，10 min, 0.01 M PBS洗涤，5 minX 3次；倒扣小圆片，吸多余液体，封片。
[0020]6.Western blotting 检测 RAGE 蛋白水平
将50 μ g总蛋白与5 X样品缓冲液混合，100 °C变性，离心，加入样品孔中。SDS-PAGE电泳(80V，20 min ;100V，90min)，转至硝酸纤维素膜上(300 mA，2 h)。含5%脱脂奶粉的
IX TBS-T封闭过夜。I X TBS-T缓冲液漂洗3次，每次5 min,滴加羊抗人RAGE抗体(稀释浓度为I: 1000)或鼠抗人β-actin抗体(I: 1000)，4°C孵育10 h。1XTBS-T漂洗5次，加入HRP标记的兔抗羊(或羊抗鼠)抗体，4°C孵育2 h，I X TBS-T漂洗3次。加ECL发光剂I?10 min内显影、定影，胶片洗涤干燥后保存。
[0021]7.双荧光素酶报告基因检测
利用生物信息学软件预测miR-185与RAGE 3’UTR结合序列；根据结合位点，化学合成RAGE基因3’UTR片段；重组至psiCHECK_2，生物信息学预测miR-185与RAGE基因的靶结合位点，并针对该位点进行定点突变。调整细胞数量和转染效率的差异；荧光素酶报告载体分别转染进入miR-185 mimic+野生型RAGE组、miR-185 mimic+突变型RAGE组及miR-185阴性对照(NC)组中，检测荧光素酶活性。注:psiCHECK-2 Vector以萤火虫荧光素酶为内参。
[0022]8.食管癌细胞株及食管癌患者血浆miR-185的实时荧光定量PCR检测
Trizol法(美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA，紫外分光光度仪检测RNA质量和浓度。血楽miR按QIAGEN miRNeasy Mini试剂说明书进行。逆转录(SuperScript?III逆转录试剂盒)按美国Fermentas公司试剂说明书进行。miR-185逆转录引物和RTFQ-PCR引物由广州锐博生物科技有限公司提供。
[0023]9.动物实验
用200 μ I PBS稀释转染miR-185 Agomir或对照的(广州锐博生物科技有限公司合成)Eca-109细胞。将2 X 15 Eca_109细胞经尾静脉注射至裸鼠。6周后处理裸鼠，肺组织经固定、包埋后制成切片行HE染色，观察肿瘤细胞的数量。
[0024]10.统计学分析
使用 SigmaPlot 11.0 软件进行统计分析。Kruskal-Wallis one way analysis ofvariance on ranks方法计算直，K0.05时具有统计学意义。
[0025]结果
1.miR-185对RAGE表达的调控机制
通过对RTFQ-PCR反应条件的优化，确定最终的反应条件为:95°C预变性10 min，95°C15 s、62°Cl min，40个循环。将同一份标本进行5倍倍比稀释，取上述稀释物及阴性对照扩增后，扩增曲线效率=87.313，R2=0.998，斜率=-3.669，截距=38.82。进行熔解曲线分析并对扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析其特异性，未发现明显杂带。取上述倍比稀释标本(低、中、高值)，每个标本连续测5 d，每天重复3次，根据循环阈值计算变异系数(CV)，以评价所建方法的重复性，结果显示，批内CV为0.38%~0.64%，批间CV为3.71%~4.34%。上述表明，RTFQ-PCR检测miR-185的方法具有线性范围宽、特异和重复性好等优点。
[0026]采用RTFQ-PCR方法检测四种食管细胞株(Kyse-30、Eca-109, TE-1l和TE-10)中miR-185的表达，并采用RTFQ-PCR和Western blotting检测RAGE表达。结果表明，Eca-109和TE-1l细胞株RAGE表达显著高于Kyse-30和TE-10细胞株，而miR-185在四种细胞株中的表达量差异不明显。因此，最终确定Eca-109和TE-1l为后续研宄使用的细胞株。
[0027]通过多种生物信息学软件分析得到miR-185与RAGE3’ UTR区结合的靶位点序列。经靶序列扩增、克隆、电泳及测序所得克隆序列与miR-185靶序列一致，将构建完成miR-185-reporter 载体(ps1-CHECK-2)及内参质粒、突变质粒、miR-185 mimic 和 miR-185对照分别按既定分组共转染293 T细胞，经48 h常规培养后，进行双荧光素酶活性检测及数据分析。结果显示，与RAGE+NC组相比，RAGE+miR-185组的荧光素酶活性明显抑制(K0.01);与RAGE-mut+NC相比，RAGE-mut+ miR-185组的荧光素酶活性无明显变化(m.05)。说明miR-185存在与RGAE 3’ UTR区的互补结合序列并且可通过互补结合靶向抑制RAGE表达。
[0028]通过转染miR-185 mimic和对照，观察miR-185和RAGE表达量的变化。50 nMmiR-185 mimic和对照均分别转染Eca-109和TE-1I两种细胞株，48 h收集细胞行RTFQ-PCR检测两种食管癌细胞中miR-185和RAGE的表达，72 h后行细胞免疫荧光法检测RAGE表达。结果显示，转染miR-185 mimic组较转染miR-NC组，miR-185含量显著增高而两种食管癌细胞中RAGE表达受到抑制。上述结果表明低表达miR-185可上调食管癌中RAGE表达。
[0029]2.miR-185对食管癌迀移和侵袭的影响
Transwell迀移试验表明，miR-185 mimic组和对照组的穿膜细胞数分别为:52±16vs.490±26 (TE-1l) ;164±13 vs.493±40 (Eca-109)，差异有统计学意义(代0.05)。Transwell侵袭试验表明，miR-185 mimic组和对照组的穿膜细胞数分别为:26±3 vs.66±7 (TE-1l) ;16±2 vs.54±4 (Eca-109)，差异有统计学意义(K0.05)。动物实验显示，miR-185 Agomir组转移的肿瘤细胞明显少于miR-185 Agomir对照(NC)组(代0.05)。
[0030]3.miR-185在食管癌患者血液中的含量
以U6为内参，用SYBR Green I RTFQ-PCR检测28例食管癌患者和35例健康体检者血楽 miR-185 的相对表达量分别为 0.500 (95% Cl 0.248 - 1.676)，2.410 (95% C1.612 -5.671)。结果显示，食管癌患者血浆miR-185的相对表达量低于健康体检者(片0.002);根据食管癌患者与健康体检者数据结果绘制ROC曲线，发现以miR-185作为诊断指标时，ROC曲线下面积(AUC)为0.7，说明miR-185在食管癌辅助分子诊断方面发挥一定作用。
[0031]讨论
RAGE是新近发现的肿瘤侵袭相关性基因，RAGE蛋白是细胞表面分子免疫球蛋白超家族的一个多配体成员，是一跨膜信号转导受体。与不同配体结合后，在生理病理过程中发挥作用。RAGE在不同种类的恶性肿瘤组织和恶性转化细胞中差异表达，并且与肿瘤细胞增殖、运动和侵袭转移能力密切相关。我们首次发现食管癌组织RAGE表达量显著高于其远端正常组织。RAGE在食管癌侵及肌层及外层后表达明显高于局限在黏膜及黏膜下层者，提示其高表达可能与肿瘤侵袭深度有关，而与淋巴结转移、癌细胞分化程度、?!分期无关。对此调节机制的深入研宄，将有力促进食管癌诊断标志物的探寻和发病分子机制研宄。miR是约19~24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，具有高度保守性，能够与靶基因3’ UTR互补结合，降解目的基因mRNA或抑制其翻译，负调控基因表达。miR如何调控RAGE表达及其在食管癌中的应用尚不清楚。
[0032]为了阐明miR-185和RAGE基因之间的关系，我们对体外生长的食管癌细胞进行miRNA模拟的转染促进miR-185的表达，运用RTFQ-PCR、We stern blotting和双荧光素酶报告基因的技术从蛋白和基因两个水平来验证两者之间的靶向调节作用，最终证明miR-185可以直接调控RAGE基因。
Li等发现miR-25在晚期胃癌患者组织和血液中表达明显升高，应用miR-25抑制剂转染胃癌细胞系HGC-27 and SGC-7901，发现低水平的miR-25能够抑制肿瘤细胞的迀移和转移，进一步发现将miR-25抑制剂转染载体经静脉注入裸鼠，其肺转移灶的形成明显降低、腹部淋巴结数量明显减少。我们通过检测临床标本发现，食管癌患者血miR-185含量显著低于正常对照者。肿瘤转移相关基因的特点是不影响肿瘤细胞的成瘤性，但可以明显改变肿瘤细胞的转移。为了探索miR-185对食管癌细胞侵袭转移的影响，我们转染miR-185模拟物及对照至食管癌细胞株进Transwell小室侵袭和迀移实验。结果发现，过表达miR-185后RAGE表达降低，食管癌细胞株的穿膜细胞数明显减少。进一步，通过构建裸鼠食管癌模型行静脉注射miR-185模拟物，6周后取肺组织行HE染色，发现miR-185模拟物较对照组可显著减少转移的食管癌细胞。
[0033]综上，miR-185是新发现的调控RAGE基因的一种miRNA分子，其可抑制食管癌细胞的转移，在食管癌的发生发展过程中具有重要作用。miR-185/RAGE的发现为食管癌分子靶向治疗提供了一新靶点。
【权利要求】
1.一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用，其特征是:所述食管癌是与RAGE表达的相关的食管癌，miRNA作用于RAGE mRNA的3’非翻译区预测靶位。
3.根据权利要求2所述的一种miRNA在制备治疗食管癌的药物中的应用，其特征是:通过过表达miR-185抑制食管癌细胞的侵袭和迀移并抑制肺组织癌细胞转移。
【文档编号】A61P35/00GK104491877SQ201410752341
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】景蓉蓉, 崔明, 王惠民, 鞠少卿, 丛辉 申请人:南通大学附属医院