rhEGF在制备预防、治疗创伤性脑损伤的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了rhEGF的一种新的医药用途，具体而言，是将rhEGF用于制备预防治疗创伤性脑损伤的药物或保健品中的新用途。药理实验发现rhEGF可使内源性VEGF表达增加，改善脑神经功能，增加脑部微血管密度，说明药物可能通过复杂的信号通路，如调控炎性因子释放、NO和氧自由基的释放和微血管再生等，修复受损脑组织，改善TBI大鼠的神经功能等，达到治疗TBI，改善症状的目的。
【专利说明】rhEGF在制备预防、治疗创伤性脑损伤的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及rhEGF在预防、治疗脑血管疾病中的用途，尤其涉及rhEGF用于预防、 治疗创伤性脑损伤的药物制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 脑血管疾病是当今世界严重危害人类生命健康的主要疾病之一，是我国的常见 病、多发病。创伤性脑损伤（traumaitc brain injury，TBI)是神经外科领域常见的急症之 一，尤其是重型TBI，死亡率达到30% -50%;即便存活下来，其中轻度损伤患者中的10% 会遗留永久残疾，中度和重度患者可达到66%和100%。据统计，TBI目前已成为全世界 35岁以下青壮年人群第一位死亡和致残原因。在我国，随着经济的快速发展，交通运输业、 建筑业、体育事业发展十分迅速，交通事故、建筑工伤、运动意外事故等意外伤害大大增 力口，由此造成脑外伤的发病率逐年增高,对社会和病人家庭造成极大的经济和心理负担。近 20年来，有兴奋性氨基酸学说、Ca2+超载学说、血管损伤学说等，但依据这些理论设计和 制造的许多神经保护剂，疗效不佳。深入研究TBI具体的病理机制及保护机制，开拓有效 治疗TBI的药物已成为不容忽视的社会性问题，研发理想的TBI保护剂和治疗策略显得十 分紧迫和必要。
[0003] 基因重组人表皮生长因子（recombinant human Epidermal Growth Factor, rhEGF)在医学上有显著的创伤修复、愈合伤口等功效。近年来发现，rhEGF在美容 产品领域也有广阔的应用前景，具有促进皮肤细胞更新、防止皮肤衰老等功能。本发明研 究发现，rhEGF对创伤性脑损伤大鼠有治疗作用，从而为创伤性脑损伤的治疗提供了新思 路，其作用机理有待于进一步研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供rhEGF的一种新的医药用途，具体而言，是将rhEGF用于制 备预防治疗脑部疾病的药物或保健品中的新用途，更进一步的，所述脑部疾病为TBI。所述 的TBI疾病包括：由作用于脑底或脊柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑 血检形成或检塞，AIDS所致神经障碍，和大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震 荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤，和/或上述病症的后遗症。
[0005] 本发明还提供rhEGF作为VEGF表达调节剂的用途，可使内源性VEGF表达增加，可 用于制备调节VEGF的药物或保健品中。
[0006] 本发明还提供rhEGF在制备改善脑神经功能的药物或保健品中的用途。
[0007] 本发明还提供rhEGF在制备增加脑部微血管密度的药物或保健品中的用途。
[0008] 本发明的目的还在用提供一种用于治疗TBI的药物组合物，其中包括活性成分 rhEGF和药学可接受载体。
[0009] 本发明的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：甘露醇、山 梨醇、山梨酸或钾盐、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨 酸、维生素 A、维生素 C、维生素 E、维生素 D、氮酮、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸 盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木 糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维 素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土温60-80、司班-80、 蜂蜡、羊毛脂、液体石蜡、十六醇、没食子酸酯类、琼脂、三乙醇胺、碱性氨基酸、尿素、尿囊 素、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、 滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁，植物油：大豆油、中链油、橄榄油、茶油、棕榈油、当归油、沙棘 油、莪术油、川芎油、薏米仁油、红花油、花椒油、大蒜油；磷脂：蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化 蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、人工合成磷脂；聚乙二醇磷脂或其衍生物，选自：聚乙二醇-脑磷脂或其衍生物、聚乙二醇-胆固醇或其衍生物、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油酯或其衍 生物、聚乙二醇-脂肪酸酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪胺或其衍生物、聚乙二醇-脂肪醇 或其衍生物、以及含有脂溶性高分子片段的聚乙二醇磷脂衍生物；油酸或油酸盐，选自：油 酸、油酸钾盐、油酸钠盐；抗氧化剂：维生素 E ;亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、维生素 C ;控制阳 离子浓度的络合剂，选自=EDTA或其它离子络合剂。
[0010] 本发明所述的药物组合物，可以以药物制剂的形式存在，可以是任何一种可服用 的药物制剂形式，如：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊 齐?、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软 膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸或贴剂。
[0011] 本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，如一日2-3次。
【具体实施方式】
[0012] 创伤性脑损伤药理实验 1动物分组和模型的建立 140只SPF级健康雄性Wistar大鼠，体重250-280g，由中国人民解放军军事医学科学 院提供。随机分成正常组、模型组、药物组和溶剂组。每组又分为术后l、4、7d和14d亚组， 每亚组8只（实验共140只大鼠，模型制作死亡12只，剔除)。参考Feeney's落体法，用1% 戊巴比妥钠（40mg/kg)腹腔麻醉，将大鼠俯卧位并固定。头顶部剪毛、消毒、铺巾。沿头皮 正中切开头皮，在右侧顶骨开骨窗，直径〇. 5cm，暴露硬脑膜。以25g重锤自32cm处自由落 下(在圆形套管内），击中骨窗下硬脑膜，造成右顶叶脑挫伤。药物组在制模后立即经静脉注 入药物100 μ m/kg ;溶剂组在静脉注入与药物组等量的溶剂，排除溶剂的影响；模型组用等 量生理盐水建立模型；正常组仅麻醉与手术。 2标本的收集与处理 实验动物在TBI后各个时间点经观察神经系统症状后，1%戊巴比妥钠（40mg/kg)腹腔 麻醉、迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，先用IOOml生理盐水快速冲洗，随后用40g/ L多聚甲醛磷酸缓冲液心脏灌注约30min，灌毕立即取脑浸入上述缓冲液中固定ld，常规脱 水、浸蜡、包埋。予正中隆起水平行4 μ m连续冠状切片，备免疫组化使用。另外4只1%戊巴 比妥钠（40mg/kg)腹腔麻醉，迅速断头后取新鲜脑组织，液氮冷存，备Western blot和real time RT-PCR 使用。 3神经行为评分 采用Menzies等大鼠走横木试验方法评价大鼠精细运动功能恢复情况。于TBI前1周 及TBI后l、4、7d和14d由2人同时测试评分。 4免疫组织化学检测微血管密度 取上述切片，在2g/L Triton X 2100液中孵育40min (室温)，将切片分别浸入兔抗大鼠 VIII因子相关抗原抗体(福州迈新生物技术开发有限公司），4°C孵育48h，PBS洗涤3次，然 后利用SABC试剂盒(北京中山生物技术有限公司)进行免疫组织化学反应，最后使用DAB显 色试剂盒(北京中山生物技术有限公司）进行显色反应30min，充分水洗，酒精脱水，二甲苯 透明，封片。光镜(德国Leica公司）下观察。
[0013] 5Westem_blot 检测 VEGF 蛋白表达 取50mg标本组织，制成匀浆，冰浴下加入300 μ 1预冷的细胞裂解液（50mm/L的Tris-HCl pH7. 6 ,200mmol/L, NaCl,2 mmol/LEDTA,1% (V/V) Tritonx-100,0. Olmm/LPMSF),以 12000rpm/min 4°C离心15min。抽提蛋白(凯基全蛋白提取试剂盒，南京凯基生物科技发展有 限公司），用BCA试剂盒以570nm于酶标仪上测定蛋白含量。制备12%十二基甲酸钠一聚丙 烯酰胺凝胶（8%分离胶，6%浓缩胶)，每孔加入60 μ g蛋白质，恒压120V电泳I. 5h，转移到硝 酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2h后，分别加入兔抗大鼠 VEGF抗体和抗β-actin单抗(美 国Santa Cruz Biotechnology), 37°C摇床lh，PBST洗漆3次，IOmin/次，然后加入与结合含 有辣根过氧化物酶标记大鼠 IGg (北京中山生物技术有限公司)，37°C摇床lh，PBST洗涤3次 IOmin/次，采用化学发光剂ECL显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司）反应，X胶片显色， 暗室，曝光。用Image master VDS成像系统摄影，图像分析件（Total lab V101)行灰度扫描 分析。以目的蛋白VEGF与β -actin的蛋白产物条带灰度的比值表示。 6实时荧光定量RT-PCR检测VEGFmRNA表达 取50mg标本组织，制成匀浆，提取总RNA (凯基总RNA提取试剂盒，南京凯基生物科技 发展有限公司），用GeneQuant RNA/DNA定量仪(美国Bio-Rad公司)进行RNA纯度测定和定 量。保证A260/A280值在1. 8-2. 0之间，否则重新提取RNA。转录cDNA (Takana反转录试 剂盒，日本Takana公司），然后样品在iCycler iQ荧光PCR仪(美国Bio-Rad公司）上进行 扩增。采用相对定量法，在测定目的基因 VEGF的同时测定内源性看家基因 GAPDH，两者比值 表示最终结果。大鼠 VEGF PCR引物：上游引物：5'-AGG AGG AGG GCA GAA TCA TCA-3';下 游引物：5'_ CTC GAT TGG ATG GCA GTA GCT-3'。GAPDH PCR 引物：上游引物：5'-GCA CCG TCA AGG CTG ACA AC-3'；下游引物：5' -ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3'。以上 3 对引物 均由北京奥科生物技术有限公司设计并合成。 7统计学处理 采用SPSS12. 0软件包进行统计分析，实验数据以表示；不同组之间的比较采用完全 随机设计的单因素方差分析，不同时间之间比较采用重复测量的方差分析，组问两两比较 采用q检验。P < 〇. 05为差异具有统计学意义。 结果 1药物对神经功能评分的影响 与正常组神经功能评分相比，模型组和溶剂组在TBI后ld，评分显著降低（P < 0. 01)， 4d后开始升高（P < 0. 05)至Hd基本恢复正常；而药物组，在TBI后Id评分开始下降（P < 0. 05)，4d后显著升高并一直到14d (表1 )。而药物组和模型组比较，神经功能评分在 TBI后Id和4d比较有显著统计学差异（P < 0. 05)。 2药物对VEGF的影响 Westem-blot结果显示，与正常组VEGF蛋白灰度值相比，模型组和溶剂组VEGF先升高 (P < 0.05)，7d后又下降（P > 0.05)，两组比较无显著性差异（P > 0.05);药物组VEGF从 Id (P < 0. 05)开始明显升高并维持至14d (P < 0. 01)。 实时荧光定量RT-PCR结果显示，各组VEGF的mRNA表达变化与VEGF蛋白的表达变化 一致。 3药物对血管密度的影响 免疫组化结果显示，与正常组大鼠微血管密度比较，TBI后l-7d，模型组和溶剂组微 血管密度明显降低（P > 〇. 01)，14d时基本恢复正常；TBI后l-7d，药物组微血管密度降低 (P > 0.05)，第4d表现很明显，14d时恢复正常。 各组大鼠神经功能评分比较(i=s , n=8)
【权利要求】
1. rhEGF在制备预防、治疗创伤性脑损伤的药物或保健品中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述创伤性脑损伤包括：由作用于脑底或脊 柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑血检形成或检塞，AIDS所致神经障碍， 和大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损 伤，和/或上述病症的后遗症。 3. rhEGF作为VEGF表达调节剂的用途，用于制备调节VEGF的药物或保健品中。 4. rhEGF在制备改善脑神经功能的药物或保健品中的用途。 5. rhEGF在制备增加脑部微血管密度的药物或保健品中的用途。
6. -种用于治疗创伤性脑损伤的药物组合物，其中包括活性成分rhEGF和药学可接受 载体。
【文档编号】A61P25/00GK104491842SQ201510025292
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月19日 优先权日:2015年1月19日
【发明者】梁青, 梁兰, 邹庆薇, 郝瑞雪, 闻家兴, 王菁, 于琪, 顾久莹, 田雪, 李姣, 刘建强 申请人:天津冠勤生物科技有限公司