本发明属于中药制剂领域，具体地说，涉及一种中药复方制剂及其制备方法。
背景技术：
肿瘤和“三高”如今已是威胁人类生命健康的常见疾病。多年来,恶性肿瘤的治疗手段保持着以手术为主、辅以全身的化疗和局部放疗的综合治疗模式，但往往不能完全有效地治愈肿瘤。“三高”是高血脂、高血压、高血糖的总称，现代医学称之为代谢综合症，属于高发慢性非传染性疾病。在我国，“三高”更是以其高患病率、高危险性、高医疗费用著称。医学界众多专家指出，提高自身免疫力是防治肿瘤、预防“三高”等疾病发生发展的最佳方法。
近些年来,中药及其复方制剂已经通过多种不同途径、多种方式应用于抗肿瘤和治疗“三高”临床中,并起到了独特的作用。中药复方制剂内包括数种、甚至是几十种生物活性的成分,因而可达到比较全面、广泛的治疗和预防作用。
天麻、酸枣仁、蛹虫草和破壁灵芝孢子粉都是常见的中药材原料，天麻是兰科天麻属多年生草本植物天麻(gastrodiaelatabl.)的干燥根茎。酸枣仁为鼠李科植物酸枣(ziziphusjujubamill)的干燥成熟种子。蛹虫草是麦角菌科虫草属的模式种，学名为cordycepsmilitaris，又名北冬虫夏草、北虫草等。灵芝是多孔菌科真菌灵芝(ganodermalucidumkarst)的子实体，破壁灵芝孢子粉是灵芝的破壁孢子粉。天麻、酸枣仁、蛹虫草和破壁灵芝孢子粉单独使用时分别具备不同的性味、归经，同时也被使用于不同的中药复方制剂中。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种中药复方制剂，该复方制剂具有抗肿瘤、调节三高、增强免疫力、改善睡眠的功效。
本发明的另一个目的是提供上述中药复方制剂的制备方法。该方法对中药材中的有效成分进行有针对性的提取纯化，从而实现较高的提取率和较佳功效。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种中药复方制剂，由下列重量份的中药原料药制成：天麻1～3份，酸枣仁5～7份，蛹虫草1～3份，破壁灵芝孢子粉1～2份。
优选地，本发明所提供的中药复方制剂，由下列重量份的中药原料药制成：天麻2份，酸枣仁5份，蛹虫草2份，破壁灵芝孢子粉1份。
一种中药复方制剂的制备方法，包含如下步骤：(1)称取下列重量份的中药原料药：天麻1～3份、酸枣仁5～7份、蛹虫草1～3份和破壁灵芝孢子粉1～2份，分别粉碎至粉末状；(2)取天麻粉末，以60～90％的乙醇加热回流提取，过滤取上清液，冷冻干燥得到天麻提取物粉末；(3)取酸枣仁粉末，以30～50％的乙醇加热回流提取，将提取液趁热过滤后加入60～80％的乙醇加热回流提取，再次将提取液趁热过滤后加入60～80％的乙醇加热回流提取，过滤，将三次提取液合并浓缩，依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯的萃取物浓缩后经大孔树脂柱分离纯化，冷冻干燥得到酸枣仁提取物粉末；(4)取蛹虫草粉末，以水加热回流提取，过滤后取上清液，冷冻干燥得到蛹虫草提取物粉末；(5)将破壁灵芝孢子粉与制得的天麻提取物粉末、酸枣仁提取物粉末、蛹虫草提取物粉末混合，加入适量淀粉和硬脂酸镁装入胶囊。
在上述中药复方制剂的制备方法中，步骤(2)中在50±2℃下加热回流3次，每次2小时。
在上述中药复方制剂的制备方法中，步骤(3)中三次加热回流的温度和时间依次分别为：75±2℃下加热回流提取2小时；60±2℃下加热回流提取1小时；50±2℃下加热回流提取1小时。根据本发明的采用不同温度梯度的三次加热回流提取步骤，可在较短时间(共4小时)和较低温度下实现对酸枣仁中的有效成分酸枣仁皂苷a的高提取率。
在上述中药复方制剂的制备方法中，步骤(3)中先将酸枣仁粉末过80目筛后再进行提取，以达到进一步提高酸枣仁中酸枣仁皂苷a的提取率的目的。
在上述中药复方制剂的制备方法中，步骤(3)中将三次提取液合并后，放置于0-4℃的环境中冷却。在三次加热回流提取操作中，某些皂苷成分已在热醇中溶解，在0-4℃的环境中，这些溶解在醇提液中的其他皂苷析出，而酸枣仁皂苷a不会在此温度下析出，借此达到了分离作用，提高了酸枣仁提取物以及中药复方制剂中酸枣仁皂苷a的含量。
在上述中药复方制剂的制备方法中，步骤(3)中的大孔树脂为d101大孔树脂。文献中多用硅胶柱分离纯化酸枣仁有效成分，本发明没有使用硅胶柱，而是选择了d101大孔树脂，发明人发现，通过采用d101大孔树脂对酸枣仁醇提物进行分离纯化，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脱，选择收集50％的乙醇洗脱流分，减压蒸馏浓缩，能够高选择性地提高酸枣仁提取物及中药复方制剂中酸枣仁皂苷a的纯度，减小其他皂苷类物质对药效作用的影响。
在上述中药复方制剂的制备方法的步骤(3)中，经大孔树脂柱分离纯化后，还可以进一步进行反相柱层析，丙酮-水梯度洗脱，收集50％和70％丙酮-水洗脱的流分，减压蒸馏浓缩，由此可以进一步提高酸枣仁提取物及中药复方制剂中酸枣仁皂苷a的纯度。
在上述中药复方制剂的制备方法的步骤(3)中，反相柱层析后，还可以进一步用葡聚糖凝胶柱分离，由此可以进一步提高酸枣仁提取物及中药复方制剂中酸枣仁皂苷a的纯度。
在上述中药复方制剂的制备方法中，步骤(4)中在60±2℃下加热回流提取3次，每次4小时。
在上述中药复方制剂的制备方法中，将破壁灵芝孢子粉与制得的天麻提取物、酸枣仁提取物、蛹虫草提取物混合后，装入胶囊，制得中药复方制剂胶囊剂。
本发明通过将天麻、酸枣仁、蛹虫草的提取物粉末与破壁灵芝孢子粉混合，获得了一种同时具有抗肿瘤、抑制“三高”、提高免疫力、改善睡眠功效的中药复方制剂。此外，本发明还提供了该种中药复方制剂的制备方法，该方法通过对天麻、酸枣仁和蛹虫草提取工艺的优化和改进，有效提高了酸枣仁皂苷a的提取率和含量，且利用酸枣仁皂苷a与破壁灵芝孢子粉、以及天麻提取物、蛹虫草提取物之间的协同作用，进一步实现了抗肿瘤、抑制“三高”、提高免疫力、改善睡眠的药用功效的提高。
具体实施方式
本说明书中，如无特殊说明，“份”指重量份；“％”为重量百分比。
(一)中药复方制剂实施例
1.1中药复方制剂1
由下列重量份的中药原料药制成：天麻300克，酸枣仁700克，蛹虫草300克，破壁灵芝孢子粉180克。(天麻购自云南昭通；酸枣仁购自河南禹州；蛹虫草购自安徽金寨；破壁灵芝孢子粉购自安徽金寨；以下各实施例中相同)
制备方法：将天麻、酸枣仁和蛹虫草分别按照2.1、2.2.1、2.3提取试验例中的步骤进行提取，然后将得到的天麻提取物、酸枣仁提取物、蛹虫草提取物与破壁灵芝孢子粉混合，装入胶囊，即制得中药复方胶囊剂。
1.2中药复方制剂2
由下列重量份的中药原料药制成：天麻100克，酸枣仁500克，蛹虫草200克，破壁灵芝孢子粉100克。
制备方法：将天麻、酸枣仁和蛹虫草分别按照2.1、2.2.2、2.3提取试验例中的步骤进行提取，然后将得到的天麻提取物、酸枣仁提取物、蛹虫草提取物与破壁灵芝孢子粉混合，制成片剂，即制得中药复方片剂。
1.3中药保健复方制剂3
由下列重量份的中药原料药制成：天麻200克，酸枣仁600克，蛹虫草100克，破壁灵芝孢子粉200克。
制备方法：将天麻、酸枣仁和蛹虫草分别按照2.1、2.2.3、2.3提取试验例中的步骤进行提取，然后将得到的天麻提取物、酸枣仁提取物、蛹虫草提取物与破壁灵芝孢子粉混合，制成颗粒剂，即制得中药复方颗粒剂。
(二)提取试验例
提取中采用的仪器均为中药材提取分析实验常规仪器；所用试剂均为分析纯。
2.1天麻提取
天麻药材粉碎后过80目筛，置于具塞锥形瓶中，加入6倍量的70％乙醇，在50℃下加热回流提取3次，每次2小时。合并提取液，浓缩，冷冻干燥后得到天麻提取物。
2.2酸枣仁提取
2.2.1提取方法1
取酸枣仁进行机械破碎后再过80目筛成粉，加入7倍量的40％乙醇，在75℃下加热回流提取2小时；将提取液趁热过滤后加入5倍量的80％乙醇，60℃下加热回流提取1小时；将提取液趁热过滤，再次加入5倍量的80％乙醇，在50℃下加热回流提取1小时；将三次的提取液合并、放置于0-4℃的环境中冷却。过滤除去沉淀，将上清液浓缩后用少量水混悬，加入石油醚萃取，除去石油醚萃取液，接着用乙酸乙酯萃取，得到酸枣仁的乙酸乙酯萃取物。将酸枣仁的乙酸乙酯萃取物浓缩后经d101大孔树脂进行层析，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脱，收集50％的乙醇洗脱部分得酸枣仁提取物，将酸枣仁提取物冷冻干燥制得粉末。
2.2.2提取方法2
取酸枣仁进行机械破碎后再过80目筛成粉，加入5倍量的30％乙醇，在75℃下加热回流提取2小时；将提取液趁热过滤后加入5倍量的60％乙醇，60℃下加热回流提取1小时；将提取液趁热过滤，再次加入5倍量的60％乙醇，在50℃下加热回流提取1小时；将三次的提取液合并、放置于0-4℃的环境中冷却。过滤除去沉淀，将上清液浓缩后用少量水混悬，加入石油醚萃取，除去石油醚萃取液，接着用乙酸乙酯萃取，得到酸枣仁的乙酸乙酯萃取物。将酸枣仁的乙酸乙酯萃取物浓缩后经d101大孔树脂进行层析，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脱，收集50％的乙醇洗脱部分得酸枣仁提取物，将酸枣仁提取物冷冻干燥制得粉末。
2.2.3提取方法3
取酸枣仁进行机械破碎后再过80目筛成粉，加入5倍量的30％乙醇，在75℃下加热回流提取2小时；将提取液趁热过滤后加入5倍量的60％乙醇，60℃下加热回流提取1小时；将提取液趁热过滤，再次加入5倍量的60％乙醇，在50℃下加热回流提取1小时；将三次的提取液合并、放置于0-4℃的环境中冷却。过滤除去沉淀，将上清液浓缩后用少量水混悬，加入石油醚萃取，除去石油醚萃取液，接着用乙酸乙酯萃取，得到酸枣仁的乙酸乙酯萃取物。将酸枣仁的乙酸乙酯萃取物浓缩后经d101大孔树脂进行层析，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脱，收集50％的乙醇洗脱部分。
接着，将收集的50％的乙醇洗脱部分浓缩，进行反相柱层析，依次用30％、50％、70％丙酮-水梯度洗脱，收集50％丙酮-水洗脱的流分，减压蒸馏进行浓缩。然后，将浓缩物通过葡聚糖凝胶柱(sephadexlh-20)分离，甲醇-水进行梯度洗脱，收集50％甲醇-水洗脱液，冷冻干燥制得酸枣仁提取物粉末。
2.3蛹虫草提取
将蛹虫草子实体用中药粉碎机粉碎后过80目筛成粉，加入14倍量水，在60℃下加热回流提取3次，每次4小时。合并提取液，浓缩，冷冻干燥后得到蛹虫草提取物粉末。
(三)酸枣仁皂苷a含量测定
3.1仪器与试药
dionex-u3000高效液相色谱仪；dionex-vw3100紫外检测器；advantage系列超纯水机(美国pall)；bs124s电子分析天平(德国sartorius)；sb-12dt超声波清洗仪(宁波新芝生物仪器厂产品)。酸枣仁皂苷a标准品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用)。其他所用试剂均为分析纯。
3.2方法与结果
3.2.1酸枣仁皂苷a的含量测定
3.2.1.1色谱条件色谱柱为
3.2.1.2标准曲线的制备精密称取酸枣仁皂苷a对照品5.1mg,置10ml量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,备用。精密移取该溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分别置2ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成不同浓度的对照品系列溶液,用0.45μm微孔滤膜过滤,进样20μl。以峰面积a对浓度c(mg/ml)进行线性回归,线性方程为a＝15.937c-0.237,r＝0.9999(n＝5),结果表明,在0.049～0.311mg/ml范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。
3.2.1.3样品溶液的制备将2.2中制备得到的酸枣仁提取物用甲醇溶解后定量转移至5ml容量瓶中,定容,摇匀后作为测试液,进行含量测定。
3.2.1.4酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷a提取率的计算用高效液相色谱法测定样品溶液中酸枣仁皂苷a的含量,并计算酸枣仁颗粒中酸枣仁皂苷a的提取率。
酸枣仁皂苷a提取率＝(药液中酸枣仁皂苷a的量×总药液量/总药材量)×100％
根据上述计算方法，对1.1-1.3中制备的中药复方制剂1-3中酸枣仁皂苷a的提取率进行统计，结果如下：
表1中药复方制剂1-3的酸枣仁皂苷a提取率
由上表可以看出，通过酸枣仁提取工艺的改进和优化，实现了对酸枣仁皂苷a较高的提取率，从而有助于提高酸枣仁皂苷a与该中药复方制剂中其他提取物成分之间的协同药效作用。
(四)中药复方制剂的药效研究
4.1抗肿瘤活性
采用mtt法研究1.1-1.3中制备得到的中药复方制剂对人体hepg2，mcf-7和hela癌细胞株系的细胞毒性。
4.1.1、实验材料
4.1.1.1仪器及设备
超净工作台(吴县实验动物器材厂)恒温co2培养箱(德国heraeus)96孔培养板(nunclon)酶标仪(tecansunrise)倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)全自动双蒸水机(上海玻璃仪器一厂)超速离心机optimaxl-100k(贝克曼公司)。
4.1.1.2试剂
rpmi1640培养基(gibco)；胰蛋白酶(sigma)；胎牛血清(hyclone)；mtt(sigma)；dmso(sigma)。
4.1.1.3细胞株及培养
人乳腺癌细胞株(mcf-7)、人子宫癌细胞株(hela)和人肝癌细胞株(hepg2)(均由北京协和药物所提供)培养于rpmi1640培养基中，含10％小牛血清，37℃，5％co2。
4.1.2、实验部分
4.1.2.1实验原理
mtt比色法是一种经典的检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚矾(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法己广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验等。
4.1.2.2实验过程
分别取处于对数生长期的贴壁人乳腺癌细胞株(mcf-7)、人子宫癌细胞株(hela)、人肝癌细胞株(hepg2)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的rpmi1640培养基配成5000个/ml的细胞悬液，以8×103个/孔接种在96孔细胞培养板中，每孔接种200μl，37℃，5％co2培养24小时。设置一系列不同浓度，同时对照组换含有等体积的pbs培养基，每组设3平行孔，37℃，5％co2培养2天。1500r/min离心，弃去上清液，每孔加入5mg/ml新鲜配置的含mtt工作液20μl，37℃，继续培养4小时。小心弃去上清液，用胰酶消化后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲臜沉淀，用微型超声震荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为490nm测定光密度值。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率＝(1-药物组a490值/对照组a490)×100％。然后求得该化合物的半数杀伤浓度ic50。
4.1.3、结果
经过初步的细胞毒活性测试，计算得1.1-1.3中制备的中药复方制剂对人乳腺癌细胞株(mcf-7)、人子宫癌细胞株(hela)、人肝癌细胞株(hepg2)的ic50分别如下。提示本发明的中药复方制剂对人乳腺癌细胞株(mcf-7)、人子宫癌细胞株(hela)、人肝癌细胞株(hepg2)具有良好的抑制活性，可用于乳腺癌、子宫癌、肝癌的防治。
表2中药复方制剂1-3的抗肿瘤活性(n＝8)
4.2糖、脂代谢信号通路影响
4.2.1.材料与方法：
4.2.1.1实验药物：本发明中药复方制剂1-3(1.1-1.3中制备)。
4.2.1.2实验动物：wistar大鼠购自上海斯莱克动物有限公司。
4.2.1.3造模方法：健康雄性wistar大鼠(2周龄)，适应性喂养1周后，选取20只大鼠作为nor组(正常对照)，其余大鼠喂养高脂饲料和基础饲料的混合料，2周后改为完全高脂饲料，喂养6周后，腹腔注射链脲佐菌素(25mg/kg体重)，继续喂养高脂饲料，4周后断尾采血测血糖，选血糖异常者(血糖>16.7mmol/l)继续喂养高脂饲料2周，复核血糖后进入分组实验。实验动物，基础饲料及定制的高脂饲料均由中国科学院上海实验动物中心提供。
4.2.1.4实验步骤：①2型糖尿病大鼠造模成功后，选择体重相近的大鼠开始实验。整个实验期间，所有糖尿病大鼠均给予高脂饲料。②将大鼠分为4组(中药复方制剂组1-3/糖尿病模型对照)，灌胃，每日一次；给药组大鼠每日药量按每公斤体重以人体每日用药量为基数，根据换算系数进行计算(换算系数确定为15)。③每周记录大鼠生长情况一次。④干预时间为4周。⑤每组随机选取大鼠20只，禁食12h后，用3％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉。⑥分别在大鼠0min和灌服葡萄糖负荷(2g/kg)后5min，10min,15min时间点取全血各1ml，按照试剂盒要求采集样本，分离血清，-70℃低温冰箱保存，统一检测相关指标。⑦每组随机选取大鼠10只，禁食12h后，用3％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，分离胰腺，液氮罐保存。匀浆后检测pdx-1表达。⑧随机选取每组大鼠5只进行葡萄糖钳夹实验。⑨sgnfm-01组和模型组每组随机选取大鼠3只，选取血液和肝脏组织，提取总rna，进行affymetrix230基因表达谱芯片检测。
4.2.1.5观察指标：大鼠血糖检测(罗氏advandge)，胰岛细胞内pdx-1因子检测(rt-pcr法)，血清胰岛素、glp-1检测(elisa法)，基因表达谱芯片检测。
4.2.2实验结果：
表3中药复方制剂1-3影响的信号通路
通过对糖尿病大鼠肝脏组织和血液组织的基因表达谱检测发现，与模型组比较，经本发明的中药复方制剂治疗后，肝脏组织和血液组织的基因表达谱中共520个基因表达发生变化，其中302个基因表达上调，218个基因表达下调。通过go分析，发现差异基因重点参与代谢过程。通过基因芯片信号通路的分析可以看出，共有89条信号通路与影响糖、脂代谢机制有关，其中胰岛素分泌、脂肪酸代谢通路、tnf信号通路等均参与“三高”疾病的发生、发展过程。由此可见，本发明的中药复方制剂能显著影响多个差异基因的表达和多条通路的调节，有效提高自身免疫力、抑制“三高”疾病。
4.3改善睡眠活性试验
4.3.1.材料与方法
4.3.1.1样品：本发明的中药复方制剂1-3(1.1-1.3中制备)。
4.3.1.2实验动物：spf级ci/f1代健康雌性小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
4.3.1.3造模方法：40只小鼠适应性喂养1周后，随机分为四组，每组10只，进行延长戊巴比妥钠睡眠时间实验。
4.3.1.4实验内容
四组动物连续灌胃一个月，在末次给药15min后，各组动物按40mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为10mg/kg，以小鼠翻正消失1min为睡眠指标，观察样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。比较对照组与实验组睡眠时间延长之间的差异，睡眠时间延长有显著性，则实验结果阳性。
4.3.2试验结果
本发明中药复方制剂对延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
经口给予小鼠不同剂量的本发明中药复方制剂一个月，腹腔注射戊巴比妥钠，观察小鼠的睡眠时间。由表4结果可见，本发明的三个试验组小鼠睡眠时间显著长于对照组(p＜0.05)。
表4中药复方制剂对延长戊巴比妥纳诱导小鼠睡眠时间的影响(n＝10)
由以上结果可知，本发明的中药复方制剂1-3与对照组相比，均能显著改善睡眠。