一种具有优异保湿及修复功效的面膜的制作方法

1.本发明涉及面膜及其制备方法，具体涉及一种具有优异修复功能的面膜及其制备方法。


背景技术：

2.高档面膜中通常会添加多肽，面膜中的肽有细胞的更新、代谢、生长、修复等作用。表皮细胞生长因子(epidermal growth factor)简称egf，是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，有很强的生理活性，但egf在医药以及化妆品领域并未得到广泛的应用，其原因egf难以实现批量化生产：现目前egf的提取方式主要分为两种，一种是动物来源，如小鼠下颌、牛脑等，另外一种则是从干细胞的培养上清液中提取，两种方法所得到的egf的含量都十分的微小，成本极高。另外，通常的egf的分子量大概为6000道尔顿，分子量较大，对肌肤的穿透力较差，其功效难以充分发挥。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供一种具有优异修复及保湿性能的面膜。
4.本发明目的按如下技术方案实现：
5.一种具有优异保湿及修复功效的面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽为小分子活力蛋白肽、其由至少含有一个如seq id no:1所示的核苷酸序列编码而成。
6.优选地，一种面膜，其组分包括多肽、保湿剂，其特征在于：所述多肽为小分子活力蛋白肽、其由如seq id no:1所示的核苷酸序列编码而成。
7.上述小分子活力蛋白肽(简称el)的氨基酸序列如seq id no:2所示。
8.进一步优选地，上述面膜中所含多肽，是由上述小分子活力蛋白肽与如seqid no:3所示的小分子穿膜肽(简称tat小分子穿膜肽)混合而成的混合活性蛋白肽(简称tat
‑
el)。所述tat小分子穿膜肽购自肽源企业管理(广州)有限公司，为市售产品。该tat小分子穿膜肽是一种分子量极小的多肽类物质，表面带正电荷，具有很好的亲肤性，可携带蛋白质大分子，活性肽，化学药物等，通过细胞间质，细胞膜，毛孔，毛囊等途径，实现活性肽的透皮吸收，解决了大分子肽难以被皮肤吸收的问题，它与本发明活力蛋白肽起到协同增效的作用、更利于皮肤的穿透与吸收。
9.进一步，上述小分子活力蛋白肽与所述小分子穿膜肽混合的质量比为1:4。
10.本发明通过体外基因蛋白重组技术，将活力蛋白肽的基因片段嫁接到遗传信息载体上，移植到基因工程菌大肠杆菌dh5a菌株中，通过密度发酵、蛋白质分离纯化、冷冻干燥，制得了本发明活力肽蛋白，并能保证其活性在冻干状态下3 年不降低。经细胞实验及人体临床测试实验，该蛋白肽对于痘肌修复及医美术后修复具有优良的效果。本发明活力肽安全性较高，经过微生物检测、重金属含量检测、细胞实验、安全性得到有效认证；工艺经验证可行，并可以进行批量化生产。
11.进一步优选地，一种面膜，其特征在于，由以下成分混合而成、以质量百分含量计：
12.a组份：水25％，甘油5％，丁二醇2％，黄原胶5％，尿囊素4％，羟乙基纤维素2％；
13.b组份：丁二醇1％，乙酰化透明质酸10％，水解透明质酸钠13％；
14.c组份：对羟基苯乙酮1％，丁二醇1％；
15.d组份：由质量比1:1:1:1混合的库拉索芦荟(aloe barbadensis)叶汁、丙二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油占8％，甜菜碱2％，由质量比1:1混合的聚谷氨酸钠、丁二醇占1％，由质量比2:1混合的1,2
‑
己二醇、芍药(paeonia albiflora)根提取物占7％，1,2
‑
己二醇1％，由质量比1:1:4:1混合的海藻糖、乙酰基六肽
‑
8、本发明多肽、磷酸二氢钠占10％；
16.e组份：由质量比1:1:1混合的水、丁二醇、桃(prunus persica)花水占2％。
17.上述面膜的制备方法，按如下步骤：
18.1、a组份原料加入到搅拌锅，升温至80
‑
85℃，搅拌25
‑
35rpm，溶解均匀，保温15～20min；
19.2、降温到70度加入b组份原料(预先溶解透明)，搅拌25
‑
30rpm，溶解均匀；
20.3、降温到60度加入c、d组份原料(预先溶解透明)，搅拌25
‑
30rpm，溶解均匀；
21.4、降温到45度加入e组份原料，搅拌25
‑
30rpm，溶解均匀；
22.5、继续冷却至37
‑
40℃制得面膜液。
23.本发明具有如下有益效果：
24.现在市面上所用的同类保湿剂通常为透明质酸、透明质酸钠、水解透明质酸等，同类保湿剂存在一些客观缺陷：
①
是水溶性成分，而非油溶性成分，很难到达肌肤的底层发挥作用；
②
透明质酸很容易被皮肤里的透明质酸钠所降解。本发明采用的乙酰化透明质酸作为保湿剂之一，乙酰化透明质酸是将透明质酸结构中的羟基，通过化学合成手段转化成了酰基，从而增强了其溶解性、渗透性以及对透明质酸酶的抵抗性。乙酰化透明质酸是两亲性的，既能溶于水，也能溶于油，能够以细胞间质为载体，渗透到肌肤的基底层，发挥保湿功效；乙酰化透明质酸抗玻尿酸酶的能力为普通透明质酸的13倍，意味着完全乙酰化透明质酸在肌肤底层发挥作用的时间更持久，更长效。
25.本发明面膜配方中复配了tat
‑
el混合活性蛋白肽(本发明小分子活力蛋白肽tat与所述小分子穿膜肽el的混合蛋白肽)：
①
代替组织/胶原/毛细血管接受自由基的进攻，从而起到保护毛细血管及胶原蛋白的作用；
②
具有优异的促进细胞增殖分化、加速肌肤表皮细胞的自我更新和自我修复，因此对于受损痘肌 /医美创伤修复具有良好的效果。
26.本发明面膜配方中复配了乙酰基六肽
‑
8：乙酰基六肽
‑
8是snap
‑
25的n 末端模拟物，可以与snare复合物中的天然蛋白质竞争位置，无需破坏复合物的任何成分便可破坏其形成的稳定性。当snare复合物变得略微不稳定时，囊泡就不能有效释放神经递质。结果，肌肉得到松弛而不产生麻痹，细纹和皱纹形成减少。乙酰基六肽
‑
8作用的蛋白质复合物与肉毒杆菌毒素a相同，调节肌肉收缩。因此，这种原料是一种安全的活性物，它已经被证实体内具有破坏 snare复合物的稳定，减少皱纹形成，将现有皱纹和表情纹的深度、体积和长度及皮肤粗糙度减至最低的功效。乙酰基六肽
‑
8属于市售产品，厂家为路博润。
27.本发明面膜配方中还复配了多种天然植物成分：芍药根提取物：天然抑菌剂，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，痤疮丙酸杆菌具有良好的抑制效果，有效防止肌肤长痘；库拉索芦荟叶汁：提高纤维原细胞的活性和繁殖速度，从而促进伤口愈合。
附图说明
28.图1：为本发明活力蛋白肽的工艺制备流程图。
29.图2：为采用本发明活力肽与tat小分子穿膜肽组成的混合活性蛋白肽(简称 tat
‑
el)对人体临床痘肌修复功效图。其中，左图为修复前示意图、右图为修复后示意图。具体使用的是1000u活力单位的tat
‑
el混合活性蛋白肽，溶解在 4ml的溶媒中形成的精华液使用。
30.图3：本发明tat
‑
el混合活性蛋白肽促细胞增殖实验结果图。
31.图4：本发明tat
‑
el混合活性蛋白肽对医美创伤修复实验结果图。
32.图5：本发明tat
‑
el混合活性蛋白肽与tat
‑
egf混合活性蛋白肽穿透皮肤实验对比结果图。
具体实施方式
33.实施例1：目的dna的获得
34.(1)目的基因的基因序列为：
35.以5’—gcaagcgcattgcacatgtacggctatagcagata—3’(seq id no:1)以目的基因转录的信使rna为模板,反转录成互补的单链dna,再在t4dna连接酶的作用下合成双链dna,即目的基因。
36.(2)pcr扩增
37.变性：高温使双链dna离解成单链(94℃，30s)；
38.退火：低温下引物(pact2 gal4 ad pact2
‑
r)与模板dna互补区结合形成杂交分子(55℃，30s)；
39.延伸：中温延伸，在dna聚合酶、dntp、mg
2+
存在下，dna聚合酶催化以引物为起始点的dna链5’向3’方向的延伸，合成出与模板dna链互补的dna子链 (70
‑
72℃，30
‑
60s)；
40.以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,目的dna以2
n
形式增加，n≥1、优选为n＝30
‑
35。
41.实施例2：电泳检测及回收纯化
42.(1)电泳
43.①
配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(1x tae buffer)
44.②
根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉(1g),加入适当的锥形瓶中。
45.③
加入一定量的电泳缓冲液(1x tae buffer 100ml)。
46.④
熔化完全，冷却至60℃左右，加入eb5
‑
7ul，充分混匀。
47.⑤
将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。
48.⑥
室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放4℃保存。
49.取适量的pcr产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的dna maker加入右边槽中，开始电泳。紫外观察电泳条带，当溴酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条带(1kb处)时，停止电泳并回收dna。
50.(2)纯化
51.纯化设备：色析管柱(pharmacia c column,1.6x100 cm)
52.填充胶体：胶体sephacryl s
‑
300(pharmacia)
53.缓冲液：buffera
‑
150
54.主要仪器设备：赛默飞xcell4 surelock中型胶电泳槽、霍尔斯la230系列多联发酵罐、析宇冷冻干机xy
‑
2(普通型)。
55.实施例3：重组表达载体构建
56.选用的重组表达载体质粒载体为pbr322，重组质粒的构建包括以下步骤：
57.(1)由于pbr322质粒的亲本之一是pmb1质粒，故首先以pmb1为基础，引入 rldrd19质粒的tn3易位子，得到13.3kb的pmb3质粒；
58.(2)pmb3的分子量显然使得它不适合作为载体，所以要通过在ecori活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的dna的黏性末端连接起来后就形成了pmb8质粒(2.6kb)；
59.(3)此时，另外一种psc101质粒在ecori活性条件下消化产生了含有tetr抗性的dna片断，这个片断和pmb8整合在一起就形成了pmb9质粒(5.3kb)。此时pmb9为ampstetr表型；
60.(4)pmb9已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，要让它具备amprtetr 性能，即在pmb9上引入psf2124的tn3易位子，但tn3可以来也可以走，为了留住它，切去了tn3中表达转位酶的基因，形成了pbr313质粒。
61.此后兵分两路：一路把pbr313的psti位点除去，使之成为ampstetr表型的pbr318 质粒；
62.(5)另一路把pbr313的ecorii的位点切除，使之成为amprtets表形的pbr320 质粒。
63.由此得到了两种功能互补的质粒，这样将他们杂交就得到pbr322载体质粒。
64.内切酶种类：fastdigest ecori和bamhi限制性内切酶
65.目的基因的dna用te溶解为大约0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10
×
酶切缓冲液(50mmol/l nacl，10mmol/l tris
‑
hcl ph7.8，10mmol/l mgcl2，1mmol/l dtt)， 5μl dna，2μl限制性酶(1
‑
5μl/μg dna)，用灭菌双蒸水补足至50μl，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心(3000r/mmin)数秒，以使管壁液体集中于管底，37℃恒温水浴中孵育1小时，65℃水浴作用10分钟。pcr双酶切结束之后回收，在t4dna连接酶作用下连接入载体，将连接产物转化大肠杆菌dh5a。
66.实施例4：活力蛋白肽的获得：
67.(1)基因工程菌的构建：按以上获得基因工程菌大肠杆菌dh5a。
68.(2)高密度发酵：菌种浓度为108cfu/ml，发酵温度为40
‑
42℃，发酵时间为12
‑
15天。
69.(3)蛋白质分离纯化：对发酵产物进行蛋白质分离纯化，留存分子量在 5000～7000道尔顿的蛋白肽得到本发明活力蛋白肽el(seq id no:2)。
70.(4)冷冻干燥：预冻温度为5
‑
10℃，冷冻温度为
‑
80℃，真空度为15pa。
71.(5)冷冻干燥后的样品在
‑
20℃冰箱中保存。
72.实施例5：活力蛋白肽的活性测试
73.将如seq id no:2序列所示的活力蛋白肽(简称el)与如seq id no:3所示的小分子穿膜肽(简称tat小分子穿膜肽)混合得到tat
‑
el活力蛋白肽。
74.tat
‑
el活力蛋白肽与酪蛋白酶会发生酶解反应，酶解为氨基酸，用甲醛测定氨基
酸氮，以测试tat
‑
el活力蛋白肽的活性。
75.一、活力测试采用的原料：
76.①
酪蛋白酶(0.01g/ml)：称取1.0g酪蛋白，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；
77.②
0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.5)；
78.③
1％tat
‑
el活力蛋白肽：取1.0gtat
‑
el活力蛋白肽，加100ml 0.2mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.5)，搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；
79.④
5％三氯醋酸(tca)溶液。
80.二、实验步骤：
81.1、将5％tca溶液和1％tat
‑
el活力蛋白肽溶液在37℃下保温。
82.2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号a1、a0、b1和b0。在a1和a0试管中各吸入0.20ml酶液，在b1和b0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/l 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在a0和b0试管中各吸入6.00ml5％三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
83.3、在各试管中吸入2.00ml 1％tat
‑
el活力蛋白肽，在37℃下保温10min(准确计时)后，再向a1和b1试管中吸入6.00ml5％三氯醋酸溶液。
84.4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
85.5、在280nm波长下，分别以a0和b0滤液为空白，测定a1和b1滤液的吸光度。
86.三、计算与结果
87.在以上实验条件下，以每分钟增加0.001吸光度定义为一个活力单位。每克酶制剂中酶活力的计算：
88.δa
×
1000/(t
×
w)酶活力单位/克酶制剂
89.式中，δa——样品与空白吸光度差值(即a1和b1的吸光值)；t——酶作用时间(本实验为10min)；w——反应中酶的用量，g。
90.tat
‑
el混合活性蛋白肽促细胞增殖实验结果如图3所示，从图3可以看出，相同条件下，同浓度的tat
‑
egf(tat
‑
egf：本方案中采用的tat小分子穿膜肽与表皮细胞生长因子egf以质量比4:1混合而成)和tat
‑
el混合活性蛋白肽促细胞增殖的效果相差不大，可见tat
‑
el活力蛋白肽确实有很好的促细胞增殖效果。该实验所用细胞为hacat(人表皮细胞)。
91.实施例6：tat
‑
el混合活性蛋白肽对医美创伤修复实验结果
92.经过医美损伤后的肌肤，涂抹相同浓度的tat
‑
egf和tat
‑
el混合活性蛋白肽 48小时后，创面修复效果均较好。如图4所示。
93.实施例7：tat
‑
el混合活性蛋白肽与tat
‑
egf透皮吸收对比实验
94.如图5所示，绿色部分为绿色荧光标记的多肽，荧光的厚度可以指示多肽到达肌肤的深度，从图5显示中我们可以看出，tat
‑
el活力蛋白肽能够被肌肤吸收的量明显多于tat
‑
egf，到达肌肤的深度也明显深于tat
‑
egf。证明tat小分子穿膜肽与el活力蛋白肽起到良好的协同增效的作用。
95.实施例8：一种具有优异修复及保湿性能的面膜由以下成分混合而成、以质量百分含量计：
96.a组份：水25％，甘油5％，丁二醇2％，黄原胶5％，尿囊素4％，羟乙基纤维素2％；
97.b组份：丁二醇1％，乙酰化透明质酸10％，水解透明质酸钠13％；
98.c组份：对羟基苯乙酮1％，丁二醇1％；
99.d组份：由质量比1:1:1:1混合的库拉索芦荟(aloe barbadensis)叶汁、丙二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油占8％，甜菜碱2％，由质量比1:1混合的聚谷氨酸钠、丁二醇占1％，由质量比2:1混合的1,2
‑
己二醇、芍药(paeonia albiflora)根提取物占7％，1,2
‑
己二醇1％，由质量比1:1:4:1混合的海藻糖、乙酰基六肽
‑
8、tat
‑
el混合活性蛋白肽、磷酸二氢钠占10％；
100.e组份：由质量比1:1:1混合的水、丁二醇、桃(prunus persica)花水占2％。上述面膜的制备方法，按如下步骤：
101.1、a组份原料加入到搅拌锅，升温至80
‑
85℃，搅拌25
‑
35rpm，溶解均匀，保温15～20min；
102.2、降温到70度加入b组份原料(预先溶解透明)，搅拌25
‑
30rpm，溶解均匀；
103.3、降温到60度加入c、d组份原料(预先溶解透明)，搅拌25
‑
30rpm，溶解均匀；
104.4、降温到45度加入e组份原料，搅拌25
‑
30rpm，溶解均匀；
105.5、继续冷却至37
‑
40℃制得面膜液。