一种在生物可降解金属表面构建离子凝胶载药涂层的方法

1.本发明涉及生物可降解金属材料表面改性技术领域，具体涉及到一种在生物可降解金属表面构建离子凝胶载药涂层的方法。


背景技术：

2.目前，锌及其合金因为有着相较于镁基和铁基金属的更加适中的降解速度以及良好的生物安全性，已被认为是最有潜力的生物可降解金属材料。相较于铁基和镁基金属材料，锌基金属材料在生理环境中具有更良好的生物相容性和更优异的腐蚀行为。然而，可降解锌基植入体金属材料在体内有着不均匀的腐蚀模式，降解过程中局部释放大量的锌离子，引起严重的细胞毒性，造成周围细胞和组织的损伤，导致植入体过早失效。此外，锌基可降解金属还有着骨整合性不足，生物功能欠缺等问题。这些问题极大的限制了可降解锌基金属的应用。
3.植入物表面的性质直接影响了植入物与组织之间的相互作用，通过对植入物进行表面改性能有效提升其表面性能并赋予其新的功能。因此，表面改性有望解决锌基植入体存在的问题。然而，目前针对生物可降解锌金属的表面改性手段大多都比较单一，很难兼顾对锌基金属的腐蚀控制和提升锌基金属的生物功能，这些改性手段的效果都不是很理想。


技术实现要素：

4.针对上述的不足，本发明的目的是提供一种在生物可降解金属表面构建离子凝胶载药涂层的方法。本发明利用明胶和羧甲基壳聚糖之间的共价结合，在锌金属表面形成一层明胶/羧甲基壳聚糖涂层；再加入锌离子作为螯合剂/离子交联剂，加入如阿司匹林等药物作为载体药物；多次交替沉积后，最终在锌金属表面构建了一层负载药物的离子凝胶涂层。本发明提供的针对生物可降解锌金属的表面改性方法兼顾了对锌基金属的腐蚀降解控制与提高生物功能性的目的。
5.为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
6.本发明提供一种在生物可降解金属表面构建离子凝胶载药涂层的方法，包括以下步骤：
7.步骤(1)：将预处理后的锌基底表面进行磷酸化处理；
8.步骤(2)：将步骤(1)所得的锌基底在羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液和锌离子/载体药物混合溶液中交替沉积，即可。
9.进一步地，步骤(1)中预处理的具体过程为：将锌基底的表面进行打磨，超声清洗，干燥备用。
10.进一步地，步骤(1)中磷酸化处理的具体过程为：将预处理后的锌基底置于磷酸溶液中，于45～50℃温度下浸泡1～3小时，清洗并干燥，即可。
11.进一步地，磷酸溶液的浓度为1～3g/l，优选为2g/l。
12.进一步地，步骤(2)中羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液的配制过程为：将明胶和羧甲
基壳聚糖用去离子水混合，于50～70℃温度下搅拌0.5～2小时，制得羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液；其中，明胶和羧甲基壳聚糖的浓度均为8～12mg/ml。
13.进一步地，明胶和羧甲基壳聚糖的浓度均优选为10mg/ml。
14.进一步地，步骤(2)中锌离子/载体药物混合溶液的配制过程为：将锌盐和载体药物用去离子水混合，于20～30℃温度下搅拌10～20min，制得锌离子/载体药物混合溶液；其中，锌盐的浓度为0.01～0.03mol/l，载体药物的浓度为0.008～0.015mg/ml。
15.进一步地，锌盐可选本领域常用的如硫酸锌、氯化锌、硝酸锌等锌盐。
16.进一步地，载体药物优选为阿司匹林；本发明并不限定载体药物，可根据实际需要和功能进行选择如阿司匹林等其他药物作为载体药物。
17.进一步地，锌盐的浓度优选为0.02mol/l，载体药物的浓度优选为0.01mg/ml。
18.进一步地，步骤(2)的具体过程为：
19.a)于45～55℃温度下，将步骤(1)所得的锌基底以8～12cm/s的速度在羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液进行浸提，干燥；
20.b)于45～55℃温度下，将a)中所得的锌基底以8～12cm/s的速度在锌离子/载体药物混合溶液进行浸提，干燥；
21.c)按照步骤a)和b)操作顺序及过程重复2～5次，即可。
22.值得注意的是，本发明经过大量试验筛选发现：加入明胶和羧甲基壳聚糖的浓度为8～12mg/ml时，制得离子凝胶载药涂层的均匀度佳，两者的浓度过高或过低都会使得离子凝胶载药涂层的均匀度变差；加入硝酸锌等锌盐的适宜浓度为0.01～0.03mol/l，因为锌盐浓度较高时同样会影响涂层的均匀程度；锌盐浓度较低时，交联程度不够，使得涂层的如稳定性等性能下降；载体药物的适宜浓度为0.008～0.015mg/ml，浓度过高或过低都会使得涂层的如生物功能性等性能下降；交替沉积的合适温度为45～55℃温度，最佳温度为50℃；因为若反应温度太高，会导致明胶熔化，反应温度太低会影响涂层的成胶能力；同时交替沉积时的交替顺序需是先羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液后锌离子/载体药物混合溶液，否则是无法形成本发明中的离子凝胶载药涂层，具体原因可见本发明中载药凝胶的制备原理。
23.本发明还提供上述方法制得的离子凝胶载药涂层。
24.综上所述，本发明具有以下优点：
25.1、本发明提供了一种在生物可降解金属表面构建离子凝胶载药涂层的方法，本发明的利用明胶和羧甲基壳聚糖之间的共价结合，在锌金属表面形成一层明胶/羧甲基壳聚糖涂层；再加入锌离子作为螯合剂/离子交联剂，加入如阿司匹林等药物作为载体药物；多次交替沉积后，最终在锌金属表面构建了一层负载药物的离子凝胶涂层。本发明构建的涂层兼顾了腐蚀控制和生物功能。在腐蚀控制方面，起到了减缓锌基底的腐蚀，减少锌离子释放的效果。在生物功能方面，起到了促进成骨细胞黏附，促进钙磷盐沉积，提升抗菌性能和抗炎性能的效果。
26.2、本发明制备方法的基本原理包括：1)涂层固定的原理：根据化学配位的原理，通过凝胶涂层中羧甲基壳聚糖和明胶与磷酸锌打底层上的锌离子活性位点螯合配位，以及凝胶涂层与磷酸锌打底层之间的物理吸附作用，使得涂层能牢固的结合在锌片表面；2)载药凝胶的制备原理：羧甲基壳聚糖和明胶中有大量的羟基和氨基，在锌离子的作用下，可以交联形成水凝胶，并将与锌离子一同加入的如阿司匹林等载体药物包裹在了其中，达到了载
药的效果。
27.3、本发明通过各组分间的协同作用，使得制备的改性功能层-离子凝胶载药涂层实现了兼顾对锌基金属的腐蚀降解控制与提高生物功能性的目的。具体过程为：通过明胶的作用，实现了对锌基底的腐蚀控制并提升了成骨细胞的黏附和增殖能力；加入羧甲基壳聚糖后，既解决了明胶涂层本身力学性能不足的问题又赋予了涂层抗菌的功能，还强化了涂层的腐蚀控制能力；在明胶和壳聚糖的共同作用下，实现了对锌基底的更好的腐蚀控制以及对成骨细胞黏附、增殖和抗菌能力的提升，且明胶和羧甲基壳聚糖均为可降解天然聚合物，生物相容性良好，而且在降解的过程中不会产生酸性产物；锌离子作为螯合剂/离子交联剂，使得羧甲基壳聚糖和明胶能够交联形成离子凝胶，既提升了其热力学稳定性，同时能让涂层很好的固定在锌基底上，还让涂层具有了很好的载药能力；如阿司匹林等作为载体药物加入涂层中，不仅进一步提升了涂层的交联程度，加强了涂层的稳定性；而且还能作为药物解决植入体早期的炎症反应和治疗骨缺损。
附图说明
28.图1为锌基底金属材料表面改性前后的sem图片；
29.图2为锌基底金属材料表面改性功能层及其载的药物的红外光谱图；
30.图3为锌基底金属材料表面改性前后的电化学表征结果；
31.图4为锌基底金属材料表面改性前后的钙磷盐沉积的sem图片；
32.图5为锌基底金属材料表面改性前后的钙磷盐沉积的xrd图片；
33.图6为锌基底金属材料表面改性前后的成骨细胞间接培养荧光染色图；
34.图7为锌基底金属材料表面改性前后的成骨细胞间接培养细胞活性统计图；
35.图8为锌基底金属材料表面改性前后的样品表面巨噬细胞培养后的炎症因子测试图；
36.图9为锌基底金属材料不同浓度的羧甲基壳聚糖溶液制备的涂层的表面形貌光镜图；
37.图10为锌基底金属材料不同浓度的锌离子溶液制备的涂层的表面形貌光镜图；
38.图11为锌基底金属材料不同浓度的阿司匹林溶液制备的涂层的成骨细胞间接培养荧光染色图。
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
40.因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1
42.本例提供一种在生物可降解金属表面构建离子凝胶载药涂层的方法，包括以下步骤：
43.a、锌片的预处理：将锌片用600#，1200#，2000#的砂纸逐步打磨，之后用去离子水和无水乙醇在超声条件下依次清洗，最后干燥备用；
44.b、锌片的磷酸化处理：将上述步骤中打磨好的锌金属片置于7.68g/l nah2po4,1.85g/l zn(no3)
·
6h2o混合溶液中，在50℃的条件下浸泡两小时，然后用去离子书清洗，干燥备用；
45.c、凝胶溶液和离子溶液的配置：将10g/l的羧甲基壳聚糖溶液和10g/l的明胶溶液在50℃的条件下混合，配置成羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液；将5.94g/l的zn(no3)
·
6h2o和0.05g/l的阿司匹林在50℃的条件下混合，配置成锌离子/载体药物混合溶液；
46.d、凝胶涂层的制备：将b中磷酸化的锌金属片在c步骤中的羧甲基壳聚糖/明胶混合溶液中浸提，在50℃的条件下以10cm/min的速度浸提，然后在50℃的条件下干燥60min；得到表面覆盖凝胶涂层的锌金属片；
47.e、离子凝胶涂层的制备：将表面覆盖凝胶涂层的锌金属片在c步骤中的锌离子/载体药物混合溶液中浸提，在50℃的条件下以10cm/min的速度浸提，然后再50℃的条件下干燥30min，得到表面覆盖离子凝胶涂层的锌金属片；
48.f、依次重复d、e两步骤5次后，在锌金属表面制得离子凝胶载药涂层。
49.本例制备的涂层表面形貌如图1所示，表明：经过打磨后的锌金属片表面有着整齐的划痕，而改性后，涂层完整的覆盖了锌金属片表面，呈现出球状的结构。
50.实验例1
51.本例将实施例1制备的离子凝胶载药涂层的样品，通过反射法进行红外光谱测试。
52.红外光谱测试结果如图2所示。在1260cm-1
处，涂层出现了n-h的特征峰，来源于明胶，表明明胶成功的构建在了涂层中。在1346cm-1
处，涂层出现了c-h的特征峰，来源于羧甲基壳聚糖，表明羧甲基壳聚糖成功的构建在了涂层中。在1747cm-1
处，涂层和阿司匹林粉末中都出现了-o-co的特征峰，说明阿司匹林药物被负载在了涂层中。
53.实验例2
54.本例在打磨好的锌片和实施例1制得的构建了涂层的锌片表面涂上导电银胶，使其与导线链接，再用硅橡胶将样品除涂层面外的其他部分封住，最后将处理好的样品放入以hank’s溶液为电解液的三通管中，其中以样品为工作电极，以金属铂为对电极，以保护甘汞电极为参比电极，利用im6电化学工作站来对样品进行动电位极化曲线测试。
55.本例样品极化曲线如图3所示。如图所示，涂层改性后样品自腐蚀电位e
corr
更正，自腐蚀电流i
corr
减小，表明涂层可以减缓锌基底腐蚀。
56.实验例3
57.本例先将2.32mm nh4h2po4，3.87mm cacl2，50mm nacl在25℃的条件下配置成磷酸钙溶液，再用50mm tris溶液将磷酸钙溶液ph调制7.2，最后得到饱和磷酸钙溶液。
58.本例将实施例1制备涂层的样品和未制备涂层的样品都先放入上述的饱和磷酸钙溶液中10s，然后取出置于70℃的真空干燥箱中干燥30min；重复上述的步骤10次后，将样品重新放入饱和磷酸钙溶液中，在37.5℃的条件下保温10h，取出洗净，干燥备用。
59.图4为钙磷盐沉积后样品的扫描电镜观察图。如图4所示，改性前的锌片，表面只有很稀少的钙磷盐覆盖，而改性后的样品表面则被大量的钙磷盐很好的覆盖住了，这是因为凝胶涂层中的羧甲基壳聚糖，明胶等成分为钙磷盐的沉积提供了非常多的活性位点。
60.图5为钙磷盐沉积后样品的x-射线衍射图，也表明改性后的样品，表面会出现大量羟基磷灰石和磷酸锌钙的特征峰，进一步证明改性后的样品能促进钙磷盐的沉积。
61.实验例4
62.本例使用实施例1制得的样品的浸提液来对成骨细胞进行培养，从而评价其生物相容性。
63.本实验选用的细胞为mc3t3-e1小鼠前成骨细胞(atcc,crl-2594,美国)，用含有10％的胎牛血清和1％的青霉素/链霉素的α-mem培养基，在5％co2浓度的37℃细胞孵箱中培养。
64.样品浸提液的制备依据iso 10993-12：2012标准，将紫外灭菌的样品按照1.25cm2/ml的比例加入培养基中浸泡24h。以正常培养基做为阴性对照组，含10％二甲基亚枫的培养基做为阳性对照组。首先，将浓度为1
×
104cell/ml的mc3t3-e1细胞种在24孔板种培养24h至贴壁。接着析出培养基，加入25％的浸提液和75％的正常培养基，分别培养一天和三天。其中，每组样品准备3个平行样以减小实验误差。
65.cck-8活性测试：将细胞培养基吸出，加入等量的10％的cck-8的培养基，避光培养2-4h。然后将上清液取出，转移至新的96孔板，利用酶标仪测量450nm处的od值。细胞活性的计算公式如下：
66.细胞活性＝[(od样品-od阳性)/(od阴性-od阳性)]
×
100％
[0067]
细胞染色观察：待cck-8活性测试结束后，吸出其中液体，用生理盐水清洗3次，加入2.5％的戊二醛固定3h，之后吸出2.5％的戊二醛，再用生理水清洗三次，最后每孔加入80ul的罗丹明染色10min，然后利用荧光显微镜观察细胞形态。
[0068]
图6为表面改性前后的成骨细胞间接培养荧光染色图，如图6所示，培养一天的时候，未改性的锌片的间接培养的细胞不仅数量不多，而且细胞的铺展形态也不怎么好，而改性后的样品的间接培养的细胞数量明显多了很多，而且细胞的铺展形态也与阴性对照组相似。培养三天的时候，未改性组的细胞出现很多死亡，而改性后的样品细胞密度已经和阴性对照组一样了。这是因为涂层中羧甲基壳聚糖，明胶，阿司匹林的共同作用，明显促进了成骨细胞的增殖与生长。
[0069]
图7为改性前后的成骨细胞的间接培养的细胞活性统计图，如图所示，改性后的样品相较于改性前，细胞活性有着显著提升，而且在3天时，改性组的细胞活性达到了100％。
[0070]
实验例5
[0071]
本例通过对实施例1制得的样品进行巨噬细胞的直接培养，来评价其生物功能。
[0072]
本实验选用的巨噬细胞为小鼠巨噬细胞样细胞系raw264.7，使用含10％fbs的高糖mem培养基，在5％co2浓度的37℃细胞孵箱中培养。以316不锈钢片做为阴性对照。首先，将灭菌好的样品放入24孔板中，之后，浓度为1
×
104cell/ml的mc3t3-e1细胞种在24孔板中，分别培养一天和三天。其中，每组样品准备3个平行样以减小实验误差。
[0073]
巨噬细胞炎症因子测试：tnf-α时炎症反应中的重要的细胞因子，与巨噬细胞的激活有关，而且阿司匹林降低炎症反应的机理就是通过降低tnf-α的浓度来实现的。本实验采用培养3天后的巨噬细胞培养液，通过elisa试剂盒测量两种因子的浓度，具体步骤如下：
[0074]
1.加样：标准品设定5个浓度点10个孔，每个浓度设定平行孔，加入50ul不同浓度的标准品，空白孔设定1个孔加入50ul蒸馏水、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中
先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动摇匀；
[0075]
2.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
[0076]
3.配液：将30倍的浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；
[0077]
4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；
[0078]
5.加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白板除外；
[0079]
6.温育：操作同2
[0080]
7.洗涤：操作同4
[0081]
8.显色：每孔先加入显色剂a50ul，再加入显色剂b50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
[0082]
9.终止：每孔加终止液50ul，终止反应。
[0083]
10.测定:以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od)值。
[0084]
11.计算：以标准孔的od值为横坐标，标准品浓度为横坐标，拟合得到od值与浓度的标准曲线，进而通过样品的od值，得出个样品中tnf-α的浓度。
[0085]
图8为改性前后样品的tnf-α的浓度统计图，如图所示，我们可以改性后，加入了阿司匹林的样品组的tnf-α的浓度显著下降。说明阿司匹林在涂层中发挥了生物功能。
[0086]
实验例6
[0087]
本例在实施例1的基础上，考察不同浓度的羧甲基壳聚糖溶液、不同浓度的锌离子溶液和不同浓度的阿司匹林溶液对本发明所制备的涂层及性能的影响。具体过程如下：
[0088]
先筛选羧甲基壳聚糖的浓度。控制明胶溶液的浓度为10g/l不变，然后明胶溶液加入不同质量的羧甲基壳聚糖，从而制得浓度为5g/l，10g/l，20g/l的羧甲基壳聚糖的溶液。将经过实验例1中锌片的预处理和锌片的磷酸化的样品，在上述不同浓度的溶液中进行浸提，在50℃的条件下以10cm/min的速度浸提，然后在50℃的条件下干燥60min；得到三种浓度下的表面覆盖凝胶涂层的锌金属片，然后将样品在光学显微镜中进行观察。
[0089]
图9为不同羧甲基壳聚糖浓度的凝胶涂层的光镜图，如图所示，5g/l的凝胶涂层覆盖的不够完整，20g/l的凝胶涂层不够均匀，相较之下，10g/l的凝胶涂层均匀又能完整覆盖基底表面。
[0090]
接下来筛选锌离子的浓度。控制明胶和羧甲基壳聚糖的浓度都为10g/l不变，制备不同浓度的锌离子溶液。将样品按照实验例1中的方式进行制备，得到三种离子浓度下的表面覆盖离子凝胶涂层的锌金属片，然后将样品在光学显微镜中进行观察。
[0091]
图10为不同锌离子浓度的离子凝胶涂层的光镜图，如图所示，0.004mol/l的锌离子溶液制备的离子凝胶涂层，涂层不够致密。0.1mol/l的锌离子溶液制备的离子凝胶涂层，涂层明显又不够均匀。相较之下，0.02mol/l的离子凝胶涂层均匀又致密。
[0092]
最后为筛选阿司匹林的浓度，控制明胶和羧甲基壳聚糖的浓度都为10g/l不变，控制锌离子的浓度为0.02mol/l不变，在离子溶液中加入不同浓度的阿司匹林，制得不同阿司匹林浓度的离子溶液。将样品按照实验例1中的方式进行制备，得到三种阿司匹林浓度下的表面覆盖离子凝胶涂层的锌金属片。然后将样品按照实验例4的步骤来用样品浸提液对成骨细胞进行培养，最后将成骨细胞染色后，用荧光显微镜观察其生长状况。
[0093]
图11，为不同阿司匹林浓度的离子凝胶涂层的成骨细胞间接培养荧光染色图，如图所示，阿司匹林浓度为0.01mg/ml的样品组的成骨细胞的生长状况要明显好于0.002mg/ml和0.05mg/ml的样品组。
[0094]
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。