1.本发明属于医学美容领域，尤其是涉及一种自体脂肪胶原蛋白的制备方法。
背景技术：
2.皱纹是指皮肤受到外界环境影响，形成游离自由基，自由基破坏正常细胞膜组织内的胶原蛋白、活性物质，氧化细胞而形成的小细纹、皱纹。皱纹的发生归结起来有4个原因：自然老化、地心引力作用、阳光中紫外线照射使皮肤发生光老化与光损伤和面部表情肌过多的收缩。其中面部表情肌过多的收缩产生的皱纹称动力性皱纹，主要表现为眶外侧的鱼尾纹，额头纹和眉间纹、鼻唇沟纹和唇上纹和颈阔肌纹。除皱有许许多多的办法，局部外用各种各样的除皱霜、抗皱霜、防晒霜只能改善外观，它对皱纹的消除不会有较大的作用。
3.胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85％，占动物体内蛋白质总量的25％～30％，ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织，也是水产品加工废弃物（皮、骨和鳞）含量最多的蛋白质，占全部胶原蛋白含量的80%～90%左右，在医学上的应用最为广泛。人体皮肤下层也有致密排布的胶原蛋白存在，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，若能刺激这些细胞生长，就有可能恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。通过自体胶原蛋白注射的方式去除皱纹，能够显著减少医用胶原的过敏反应。
4.然而，富含的i型胶原蛋白在自体脂肪组织中含量不高，除了获取难度大和吸脂器械有特定要求外，还需吸脂外科医生掌握制备自体脂肪胶原的技术。另外，单纯的胶原蛋白注射容易被机体降解，不能根本性的解决皱纹问题。因而，如何解决i型胶原蛋白获取难度大且胶原蛋白容易被机体降解的问题对美容行业具有重要的意义。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明提供了一种自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法。
6.为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：本发明所述的自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，包括以下步骤：s1，将自体脂肪置于含有胰蛋白酶的edta溶液中，于37℃恒温培养10-20min，向培养液中加入含有胎牛血清的edta溶液终止培养；s2，将步骤s1中消化处理后的自体脂肪剪碎打散，离心去除90%的油滴，得成纤维细胞；s3，用低血清细胞培养液将s2得到的成纤维细胞吹悬，然后将其接种至低血清细胞培养液中于37℃、5％co2恒温培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；s4，将静脉血样品置于含有抗凝剂的试管中于600rpm条件下离心分离，用吸管吸取上清液和交界面下3mm高度的液体并转移至新的试管中，离心，试管中的中间层即为富含血小板或生长因子的血浆；s5，待s3中的胶原蛋白培养结束后，将成纤维细胞和胶原蛋白从低血清细胞培养
液中取出，得到纤维细胞和胶原蛋白；将s4得到的富含血小板或生长因子的血浆加入胶原蛋白和纤维细胞中，混匀后得自体脂肪胶原蛋白注射剂。
7.优选地，所述s1中的胰蛋白酶的质量分数为0.05%；fbs的质量分数为10%。
8.优选地，所述s3中成纤维细胞的培养时间为12~36h。
9.优选地，所述s4中静脉血样品的离心分离10min。
10.本发明的优点在于通过除去自体脂肪中90%的无用油滴，并结合离心技术继续除去自体脂肪中支撑性差且存活性低的组份，最终得到了支撑性好且存活性高的胶原蛋白；并将胶原蛋白与富含血小板、生长因子的血浆（即prp）混合在一起，胶原蛋白能够吸收prp中的营养，并大量复制再生胶原蛋白，从而使凹陷部位得到填充，使皮肤变得饱满。
具体实施方式
11.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
12.本发明所述的自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，包括以下步骤：s1，向自体脂肪加入2ml含有胰蛋白酶的edta溶液，37℃恒温培养10min，然后向培养液中加入含有胎牛血清的edta溶液终止培养，实现自体脂肪的消化；其中，胰蛋白酶的质量分数为0.05%；fbs（即胎牛血清）的质量分数为10%；s2，将步骤s1消化处理后的自体脂肪剪碎并用吸管打散，将打散后的脂肪于25℃、1000r/min离心条件下离心5min，弃去90自体脂肪中90%的无用油滴，得成纤维细胞；s3，向步骤s2中的成纤维细胞中加入1ml低血清真皮细胞培养液（美国sierna公司），并将成纤维细胞吹悬；然后将吹悬后的成纤维细胞接种至低血清纸皮细胞培养液中于37℃、5％co2恒温培养12-36h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；s4，将静脉血样品（10ml）置于含有抗凝剂的试管中于600rpm转速下离心10min，用吸管吸取上清液和交界面下3mm高度的液体并转移至新的试管（不含抗凝剂）中，在600rpm转速下离心10min，离心后的血浆为三层，中间层为富含血小板和生长因子（生长因子包括pdgf、vegf、igf-1、egf、tgf-β）的血浆，即为prp；s5，待s3中的胶原蛋白培养结束后，将成纤维细胞和胶原蛋白从低血清细胞培养液中取出，得到纤维细胞和胶原蛋白；将s4得到的富含血小板或生长因子的血浆加入胶原蛋白和纤维细胞中，混匀后得自体脂肪胶原蛋白注射剂。
13.本发明在制备时除去了自体脂肪中90%的无用油滴，结合离心技术继续除去自体脂肪中支撑性差且存活性低的组份，得到了自体脂肪中3%的支撑性好且存活性高的成纤维细胞，经过扩大培养得到支撑性好的胶原蛋白。将其注射到衰老受损的皮下细胞可以使新生的肌肉细胞快速更替老化的肌肉细胞，并使老化的肌肉细胞重新焕发新生活力；本发明向胶原蛋白中添加有富含幼生干细胞、plt（血小板）、生长因（pdgf、vegf、igf-1、egf、tgf-β）的prp，胶原蛋白能大量吸收prp中的营养，并大量复制再生胶原蛋白，从而使凹陷部位得到填充，皮肤变得饱满。
14.本发明将胶原蛋白和prp混合在一起，prp中的生长因子可以增强嗜色素细胞的吞嗜、分解能力，并为转运分解代谢的产生提供能量动力，修复因色素沉着而受损的正常皮肤
组织，从而达到美白淡斑、嫩化皮肤的作用。
技术特征：
1.一种自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，将自体脂肪置于含有胰蛋白酶的edta溶液中，于37℃恒温培养10-20min，向培养液中加入含有胎牛血清的edta溶液终止培养；s2，将步骤s1中消化处理后的自体脂肪剪碎打散，离心去除90%的油滴，得成纤维细胞；s3，用低血清细胞培养液将s2得到的成纤维细胞吹悬，然后将其接种至低血清细胞培养液中于37℃、5％co2恒温培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；s4，将静脉血样品置于含有抗凝剂的试管中于600rpm条件下离心分离，用吸管吸取上清液和交界面下3mm高度的液体并转移至新的试管中，离心，试管中的中间层即为富含血小板或生长因子的血浆；s5，待s3中的胶原蛋白培养结束后，将成纤维细胞和胶原蛋白从低血清细胞培养液中取出，得到纤维细胞和胶原蛋白；将s4得到的富含血小板或生长因子的血浆加入胶原蛋白和纤维细胞中，混匀后得自体脂肪胶原蛋白注射剂。2.根据权利要求1所述的自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于：所述s1中用到的胰蛋白酶的质量分数为0.05%；fbs的质量分数为10%。3.根据权利要求1所述的自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于：所述s3中成纤维细胞的培养时间为12~36h。4.根据权利要求1所述的自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，其特征在于：s4中静脉血样品的离心分离10min。
技术总结
本发明公开了一种自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法，包括：S1，将自体脂肪恒温培养；S2，将S1处理后的自体脂肪剪碎打散，离心去油；S3，将S2的成纤维细胞吹悬，恒温培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白；S4，将静脉血样品置于含有抗凝剂的试管中离心，对上清液离心，得富含血小板和生长因子的血浆；S5，将成纤维细胞、胶原蛋白与S4中的血浆混匀，得自体脂肪胶原蛋白注射剂。本发明通过除去自体脂肪中90%的无用油滴，并结合离心技术继续除去支撑性差且存活性低的组份，最终得到支撑性好且存活性高的胶原蛋白；将胶原蛋白与富含血小板、生长因子的血浆混合在一起，胶原蛋白能够吸收PRP中的营养并大量复制再生，使凹陷部位得到填充，使皮肤变得饱满。肤变得饱满。
技术研发人员：侯强 秦军侠 胡朝军 朱海 高超 李向前
受保护的技术使用者：郑州市金水区蕾娜斯医疗美容门诊部
技术研发日：2022.01.21
技术公布日：2022/4/15