藤黄酸联合舒尼替尼在制备肾癌治疗药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及藤黄酸联合舒尼替尼在制备肾癌治疗药物中的应用。


背景技术：

2.肾癌是一种起源于肾小管上皮部位的恶性肿瘤，约占肾脏恶性疾病的80％左右。发病率仅次于前列腺癌和膀胱癌，而且呈现发病率逐年上升的趋势。中晚期肾癌患者以药物治疗为主。《中国肾癌诊疗指南》推荐的一线用药主要是多靶点酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼(1a)、索拉非尼(2a)等。舒尼替尼(sunitinib)被列入全球应用最为广泛的晚期肾癌靶向药物，它能够选择性地靶向针对多种受体酪氨酸激酶，通过阻断肿瘤生长所需的血液和营养物质供给和直接攻击肿瘤细胞这两种作用机制来对抗肿瘤。有证据表明舒尼替尼剂量越高，效果越好。但同时，长期使用高剂量的舒尼替尼也会导致患者的毒副作用越来越明显，甚至可能会增加治疗期间停药的概率，而这种现象在亚洲人群中更为明显。舒尼替尼的不良反应主要包括骨髓抑制、甲状腺功能减退、心功能不全等。因此，寻找一种新的候选药物与舒尼替尼联合治疗肾癌，提高疗效的同时降低毒副作用，对晚期肾癌病人生存期延长及生活质量提升具有重要的意义。
3.多项研究显示天然产物藤黄中提取的藤黄酸(ga)具有显著的抗肿瘤作用，在有效抗肿瘤剂量范围内毒副作用小，不仅对动物正常造血系统和免疫功能没有影响，并对神经、心脏、肝、肺具有保护作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供藤黄酸联合舒尼替尼在制备肾癌治疗药物中的应用。
5.本发明发现藤黄酸(ga)联合舒尼替尼(sunitinib)能显著抑制人肾癌os-rc-2细胞的生长。通过mtt实验验证了较低浓度的藤黄酸可增强舒尼替尼的肾癌生长抑制作用，提示这种联合给药方式在治疗肾细胞癌中的应用潜力。
附图说明
6.图1为舒尼替尼对人肾癌细胞株os-rc-2细胞增殖的影响结果。
7.图2为舒尼替尼联合ga对人肾癌细胞株os-rc-2细胞增殖的影响结果。
具体实施方式
8.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
9.实施例1
10.1、试剂
11.(1)藤黄酸(gambogic acid,c
33h44
o8，分子量：628.7512)由中国药科大学提供，黄色粉末，纯度95％，使用前用二甲亚砜(dmso)将药物粉末配制为0.01m母液，置于-80℃保存。舒尼替尼(sunitinib)粉末购于medchemexpress试剂公司，-20℃避光保存，使用前用无菌水配制为0.01m的母液，-80℃保存，所有试剂临用前用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液配成所需浓度。
12.(2)细胞培养试剂
13.①
培养液：rpmi-1640培养基，购自美国gibco公司。取rpmi-1640粉末10.39g溶于1000ml灭菌三蒸水中，并加入2.0g nahco3，用1m盐酸调ph值至7.0，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素。
14.②
胎牛血清：美国gibco公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。
15.③
pbs缓冲液：称取nacl 8.0g、kcl 0.20g、na2hpo4·
h2o 1.56g、kh2po4.2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
16.(3)细胞生长活力抑制检测相关试剂
17.mtt粉末购自sigma-aldrich公司。
18.(4)细胞株
19.人肾癌细胞株os-rc-2细胞购自国家实验细胞资源共享平台。细胞均用含100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi1640培养液培养。
20.2、实验方法
21.mtt实验
22.mtt溶液能够被活细胞内的线粒体脱氢酶还原为蓝紫色的结晶甲臜，dmso可溶解甲臜，形成的溶液颜色深浅与细胞活力成正比，据此可以检测细胞的活力。将细胞按照合适的细胞密度培养在96孔酶标板内，每孔内的细胞体积为100μl，待细胞贴壁且融合度达50％，吸去培养基，加入100μl指定浓度的ga和舒尼替尼；将给过药物的细胞继续置于孵箱培养48h后，每孔加入20μl mtt溶液；继续孵育4h后将上清液移除，每孔加入100μl dmso，置于微型振荡器振荡，待结晶完全溶解后，使用570nm波长检测其吸光度。将检测后的吸光值整理后按下面的公式计算药物对细胞的生长抑制率：
23.抑制率％＝(1-a
给药组
/a
对照组
)
×
100％。
24.3、实验结果
25.通过mtt实验测定藤黄酸(ga)联合舒尼替尼(sunitinib)处理os-rc-2细胞24h的生长抑制作用。
26.实验结果如图1所示，单用舒尼替尼(0.078-10μm，sunitinib)能显著抑制os-rc-2细胞的生长，且具有浓度依赖性，舒尼替尼单独作用24h的ic50为5.66μm。
27.在此基础上，选择舒尼替尼浓度范围1-5μm，与0.4μm藤黄酸联合使用。实验结果如图2所示，单用组中sunitinib的ic50为5.29μm，联用组中sunitinib的ic50为4.12μm；联合ga能显著提高sunitinib对人肾癌os-rc-2细胞的生长抑制作用。
28.如表1所示，与单用sunitinib相比，当分别联用0.4μm ga与较低剂量sunitinib(1、2和3μm)后，生长抑制率的增幅均呈现显著性差异，显示ga能显著增效较低浓度
sorafenib对人肾癌os-rc-2细胞的生长抑制作用。
29.表1.舒尼替尼联合ga对人肾癌细胞株os-rc-2细胞增殖抑制作用
[0030][0031]
该结果证实了藤黄酸联合多靶点激酶抑制剂舒尼替尼抗肾癌的作用。


技术特征：
1.藤黄酸联合舒尼替尼在制备肾癌治疗药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物中藤黄酸和舒尼替尼的浓度比为0.4：1-3。3.一种肾癌治疗药物，其特征在于：所述药物的活性成分为藤黄酸和舒尼替尼。4.根据权利要求3所述的肾癌治疗药物，其特征在于：所述药物中藤黄酸和舒尼替尼的浓度比为0.4：1-3。

技术总结
本发明公开了藤黄酸联合舒尼替尼在制备肾癌治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明发现藤黄酸（GA）联合舒尼替尼（Sunitinib）能显著抑制人肾癌OS-RC-2细胞的生长。通过MTT实验验证了较低浓度的藤黄酸可增强舒尼替尼的肾癌生长抑制作用，提示这种联合给药方式在治疗肾细胞癌中的应用潜力。合给药方式在治疗肾细胞癌中的应用潜力。合给药方式在治疗肾细胞癌中的应用潜力。


技术研发人员：魏立彬 郭青龙 周煜新 张鑫 王瑞 刘舰
受保护的技术使用者：南京芩康医药科技有限公司
技术研发日：2022.03.21
技术公布日：2022/6/1