本发明属于软骨缺损修复治疗的生物制剂、制备方法和应用，尤其涉及一种mrna剂型的关节软骨缺损修复制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、软骨缺损是骨科常见疾病，尤其是运动员，且软骨损伤通常合并了软骨下骨损伤。患者常有关节肿胀、疼痛，活动受限，影响日常生活与工作，给社会造成较大经济负担。软骨内无血管、无神经、无淋巴，损伤后自行修复能力差，治疗困难，一直是骨科的难题。而目前临床治疗手段如微骨折、骨软骨柱移植、软骨细胞移植等没有涉及骨软骨损伤的联合治疗，新生的软骨组织常常为纤维软骨而非透明软骨。纤维软骨力学性能差，无法承受膝关节日常活动中产生的巨大应力，易退变与磨损，因此无法保证远期疗效。
技术实现思路
1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明是提供了一种用于关节软骨缺损修复的mrna剂型生物制剂及其制备方法和应用，所述mrna序列为seq idno：1，所述生物制剂具有刺激骨髓间充质干细胞(bmscs)成软骨分化标志物表达，增强细胞外基质合成能力，体内实验证实其增强了软骨基质修复，从而达到治疗软骨缺损的目的。
2、本发明构建一种化学修饰mrna剂型的生物制剂，为组织工程修复提供了新的思路，通过化学修饰的mrna增强了稳定性，降低免疫原性并增加表达效果。
3、为了构建组织工程支架，本发明采用的技术方案：
4、一、一种用于关节软骨缺损修复的mrna剂型生物制剂：
5、包括活性成分mrna和阳离子脂质体，所述活性成分mrna为seq id no：1或者为与seq id no：1所示序列相似度达90％以上的序列。
6、所述生物制剂为液体制剂，为软骨缺损修复药物制剂。
7、所述mrna的5’端经帽子结构和5’utr连接；所述mrna的3’端经3’utr和多聚a尾连接。
8、所述foxo1的mrna中的尿嘧啶替换为pseudo utp。
9、所述软骨缺损修复制剂为注射制剂。
10、5、根据权利要求4所述的软骨缺损修复制剂，其特征在于，
11、所述活性成分mrna加入溶剂pbs中配置成溶液，活性成分mrna在溶液中的浓度为0.5-20μg/μl。
12、二、一种软骨缺损修复制剂的制备方法，方法包括以下步骤：
13、1)合成转录所述软骨缺损修复制剂中的活性成分mrna对应的dna片段，将所述dna片段克隆至表达质粒获得重组质粒；
14、2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，对重组细胞进行扩繁，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，以提取获得的质粒为模板进行pcr扩增获得体外表达mrna的dna模板；
15、3)利用dna模板构建包括所述dna模板的rna体外合成体系并进行rna体外合成获得所述活性成分mrna。
16、所述rna体外合成体系以1600μl计，包括以下组分：
17、rnase-free水440μl；
18、7.5mm的atp 160μl；
19、7.5mm的utp或者pseudo utp 160μl；
20、7.5mm的ctp 160μl；
21、7.5mm的gtp 160μl；
22、7.5mm的m7g(2’omea)pg 160μl；
23、150ng/μl的dna模板40μl；
24、10×buffer 160μl；
25、enzyme mix 160μl。
26、所述rna体外合成的条件为36～38℃，8～12h。
27、三、一种mrna剂型生物制剂和应用：
28、所述mrna剂型生物制剂由所述制备方法制备而成。
29、所述的mrna剂型生物制剂在用于软骨基质修复、软骨缺损修复的制药中的应用。
30、所述制剂中还包括递送材料；
31、优选地，所述递送材料包括但不限于pei、pamam、多聚赖氨酸、壳聚糖、脂质体、脂质纳米颗粒；
32、优选地，所述递送材料是pei。
33、本发明的有益效果：
34、本发明使用体外转录法合成化学修饰的foxo1 mrna基因，将制剂注射于关节软骨缺损处，能促进内源性间充质干细胞成软骨分化；其生物活性优良，在组织工程中具有应用价值。
35、本发明提供的mrna剂型的软骨缺损修复制剂，包括具有刺激软骨再生的蛋白转录因子mrna，将所述软骨缺损修复制剂导入靶细胞后能够促进bmscs成软骨分化；所述软骨缺损修复制剂的制备简单、快速、表达量高、免疫原性低，能够快速高效促进软骨细胞外基质合成，从而达到治疗软骨缺损的目的。
36、根据实施例的记载，本发明提供的具有刺激软骨再生的转录因子mrna能够在细胞内特异性的高水平表达；本发明提供的mrna进行关节腔注射后，大鼠血清中tnfα未明显升高，说明本发明提供的mrna剂型的软骨缺损修复制剂免疫原性更低，安全性好。
1.一种用于关节软骨缺损修复的mrna剂型生物制剂，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的mrna剂型生物制剂，其特征在于，
3.根据权利要求1或2所述的mrna剂型生物制剂，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的mrna剂型生物制剂，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的mrna剂型生物制剂，其特征在于，
6.权利要求1-5任意一项所述mrna剂型生物制剂的制备方法，其特征在于：方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述rna体外合成的条件为36～38℃，8～12h。
9.一种mrna剂型生物制剂，其特征在于：所述mrna剂型生物制剂由权利要求7所述制备方法制备而成。
10.一种权利要求1-5任一所述mrna剂型生物制剂或者由权利要求6所述制备方法制备而成的mrna剂型生物制剂的应用，其特征在于：所述的mrna剂型生物制剂在用于软骨基质修复、软骨缺损修复的制药中的应用。