专利名称:一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防动物狂犬病的重组疫苗。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒感染引起的致死性人畜共患传染病，以侵犯中枢神经系统为特征。狂犬病广泛发生于世界各地，我国是狂犬病的高发区。用狂犬病毒疫苗进行预防注射是预防和控制狂犬病发生的有效途径。狂犬病毒疫苗由早期的神经组织疫苗逐步发展，目前广泛采用原代细胞培养疫苗和传代细胞精制纯化疫苗，这些疫苗具有较好的免疫效果，但受生产成本昂贵，运输和贮存必须依赖于低温″冷链″，给药方式等因素限制，不便应用于狂犬病毒的储存宿主即犬、狐狸等各种野生或家养动物的免疫接种。有效免疫接种狂犬病毒的传染源，切断其传播途径有赖于发展新一代的基因工程重组疫苗。联合缺失腺病毒早期区基因E1和E3的重组复制缺陷型腺病毒具有宿主范围广，对外界环境有一定的抵抗能力，可口服诱导免疫等优点，具有作为基因工程狂犬病毒疫苗的优良载体的潜力。而且，这种E1和E3联合缺失的重组复制缺陷型腺病毒还具有一个突出优点由于E1和E3区编码多种与对抗机体免疫防卫有关的蛋白质，联合缺失这两个区域的重组病毒疫苗可望更有效地刺激免疫应答，并成功地克服在新生动物中可能存在的来自于母体的免疫干扰。研究和开发基于复制缺陷型腺病毒的重组狂犬病毒疫苗将有望有效预防，控制甚至根除我国狂犬病的发生。
狂犬病毒共有5种结构蛋白，其中包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)由于能有效激发机体产生保护性免疫反应而被作为保护性抗原运用于亚单位狂犬病毒基因工程疫苗的研究中。由于单负链RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校对功能，加之体内免疫选择压力，GP蛋白具有较高的突变率，而不少研究提示狂犬病毒疫苗毒株的选择与其免疫保护效果有关。国际上常用ERA株(Evelyn Rockitniki Abelseth strain)来源的糖蛋白基因作为亚单位狂犬病毒基因工程疫苗的保护性抗原，ERA株是早期分离的兽用疫苗株。而我国尚未有成熟的亚单位狂犬病毒基因工程疫苗，而采用aG株组织培养疫苗，这一毒株经过多年传代培养与目前的狂犬病毒野毒株(街毒)基因差异较大。CVS-N2c狂犬病毒是狂犬病毒CVS24株在小鼠脑内或成神经细胞瘤细胞中传代培养中的优势变种(variant)，具有强神经毒力。但CVS-N2c狂犬病毒GP蛋白在神经元细胞中仅为低水平表达，其引起病理变化及作为亚单位疫苗用以预防和控制狂犬病的效力尚不明确。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防动物狂犬病的重组疫苗，这种疫苗是以强神经毒力的狂犬病毒株CVS-N2c糖蛋白GP作为保护性抗原的E1，E3联合缺失的复制缺陷型重组腺病毒rAdCVSGP。
本发明提供了一种用于预防动物狂犬病的重组疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在E1区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行表达的元件，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因具有SEQ ID NO1所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。
本发明的疫苗以人腺病毒为载体。人腺病毒有多个血清型，本发明载体可以是采用5型人腺病毒(ATCC VR-5)。将其缺失部分早期基因表达E1编码区(Δ481～3533bp)和E3编码区(Δ28130～30820bp)，外源GP基因可通过大肠杆菌内同源重组过程整合入E1区(He TC，Zhou S，daCosta LT，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1998，95(5)2509-2514)。在本发明的疫苗中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白，来源于强神经毒力CVS-N2c株GP基因全长cDNA，也可为编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或其部分编码序列如膜外区(58-1375bp)或膜外区部分抗原决定簇序列。在本发明的疫苗中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因可以用任何已知的可引导外源基因在真核细胞中表达的调控元件进行调控，例如，该GP基因序列前人工可以加入Kozak高效翻译调控核心序列ACC(ATGG)，GP基因可以处于外源CMV启动子及SV40加尾信号转录元件的控制之下。rAdCVSGP在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因GP，其基因组在连续传代过程中保持稳定。
本发明构建的表达CVS-N2c包膜糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒rAdCVSGP的293细胞病毒培养物已根据布达佩斯条约，于2001年7月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏。保藏中心地址为中国北京中关村北一条11号，保藏号为CGMCC0597。
本发明所采用的狂犬病毒保护性抗原是从昆明鼠脑组织中克隆的强神经毒力CVS-N2c糖蛋白基因。为保证CVS-N2c GP基因在真核细胞内的高效表达，还在克隆位点后加入了Kozak保守序列ACC(ATGG)[Kozak M.Proc Natl Acad Sci USA.1990，878301-8305]。如上文所述，复制缺陷型重组腺病毒缺失部分早期基因表达E1编码区(Δ481～3533bp)和E3编码区(Δ28130～30820bp)，在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因，狂犬病毒保护性包膜糖蛋白基因及表达调控元件被插入E1区。
本发明的重组病毒的基本特性a透射电镜观察到所得的重组腺病毒直径约为70nm，具有较为典型的腺病毒形态；b酶切图谱鉴定表明在连续传代培养过程中，重组腺病毒基因组稳定；c重组病毒在293细胞中滴度至少可达约107-109pfu/ml。dWestern blot实验表明表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清所特异性识别，表达的GP蛋白分子量约为66Kd，与天然GP的分子量相仿。
以CVS-N2c GP基因为特异性保护抗原的重组复制缺陷型腺病毒rAdCVSGP有很好的免疫保护作用约1.0×108pfu rAdCVSGP腹腔免疫小鼠在35.8LD50或38.0LD50毒力的直接脑内致死性攻击实验中其免疫小鼠存活率分别为100％和87.5％，单次皮下免疫接种1.0×109pfurAdCVSGP可使100％受试小鼠在68.0LD50的脑内攻击下存活。与肌肉外周攻击等其它方法相比，这种高剂量的脑内攻毒实验条件更为严格，结果更有说服力。实验表明rAdCVSGP接种对小鼠脑内高剂量病毒的致死性攻击具有很好的免疫保护效果。
接种rAdCVSGP能诱导Beagle犬产生高滴度的中和抗体。Beagle犬皮下多点接种1.0×1011pfu重组rAdCVSGP病毒，以快速荧光灶抑制实验(Rapid Flourescent Focus Inhibition Test，RFFIT)检测中和抗体滴度。接种后一周即可诱导产生具有保护作用的狂犬病特异性中和抗体，抗体滴度在4周左右上升到最高峰，可达800IU/ml，之后缓慢下降，在检测期(21周)内远远高于保护性抗体水平(0.5IU/ml)。
附图的简要说明
图1为本发明狂犬病毒CVS-N2c GP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建示意图。
A狂犬病毒CVS-N2c GP基因被亚克隆于pAdShuttle-CMV，获得pAdShuttle-CMV/GP与骨架载体pAdEasy-1一起共转化大肠杆菌BJ5183。
B在大肠杆菌BJ5183细胞中，发生同源重组。
C同源重组的结果是获得了以环状质粒形式存在的重组腺病毒质粒pAdCVSGPD用PacI酶切线形化重组腺病毒质粒pAdCVSGP，使其成为感染性核酸，转染293细胞即可得到复制缺陷型重组腺病毒。
图2 E1，E3联合缺失的复制缺陷型腺病毒rAdCVSGP结构特征。
重组复制缺陷型病毒rAdCVSGP缺失部分E1编码区(Δ481～3533bp)和E3编码区(Δ28130～30820bp)，E1和E3区基因产物对于病毒对抗机体免疫至关重要。连接有Kozak翻译调控序列的全长CVS-N2c糖蛋白基因处于CMV启动子和SV40polyA信号的控制之下，插入缺失的E1区中。
图3为重组病毒rAdCVSGP基因组在传代过程中的稳定性。
1-5分别示以XbaI酶切第2，4，6，8，10代rAdCVSGP重组病毒基因组DNA后，各代病毒均显示一致的酶切图谱，表明重组病毒基因组在连续传代过程中稳定。
图4为Western blot印迹分析，示本发明的重组病毒rAdCVSGP有效表达免疫原CVS GP蛋白。
重组病毒感染的293细胞能表达CVSN2cGP蛋白，经SDS-PAGE分离，特异抗血清识别，主要集中于66Kda左右，如泳道1所示，泳道2为阳性对照，泳道3为阴性对照。
图5为rAdCVSGP单次皮下免疫接种Beagle犬后，用RFFIT方法测定的血清中和抗体滴度。
快速荧光灶抑制实验(Rapid Flourescent Focus Inhibition Test，RFFIT)检测中和抗体滴度，抗体滴度在4～5周左右达到最高峰，之后缓慢下降，在检测期(21周)内远远高于保护性抗体水平(0.5IU/ml)。
以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述。
实施例1本发明狂犬病毒CVS-N2c GP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建A.免疫原取有典型狂犬病症状的昆明小鼠脑组织，加入Trizol试剂(Gibco BRL)提取总RNA，逆转录聚合酶链反应获得狂犬病毒GP基因cDNA，将其克隆入载体pUC18并进行双链DNA测序，测得其序列，参见序列表SEQID NO1。
B.构建过程CVS-N2c株GP基因从其克隆载体上亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdShuttle-CMV，获得重组穿梭质粒，如图1(A)。以酶切图谱分析确认其插入有正向单拷贝外源基因。随后，此重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒一起电击共转化RecA+大肠杆菌BJ5183，如图1(B)，以分子量测定和酶切图谱鉴定从近百个经初筛的重组腺病毒质粒候选克隆中，获得所需要的重组腺病毒质粒克隆，并利用自行设计合成的寡核苷酸引物以重组腺病毒质粒为模板，对其进行了测序验证如图1(C)。最后，经PacI酶切释放病毒反转末端重复序列(Inverted terminal region，ITR)为自由末端，以此重组感染性腺病毒基因组DNA转染293包装细胞后可得到重组腺病毒如图1(D)。
C重组病毒的基本特性重组腺病毒基因组稳定性Hirt法快提病毒DNA按常规方法培养293细胞，取重组病毒rAdCVSGP以m.o.i＝5病毒量感染细胞，待细胞病变达75-100％时收获。沉淀细胞加蛋白酶K(20μg/μl)7μl和50μl 10％SDS，37℃孵育1h，再加150μl 5M NaCl置于4℃2h。13000rpm离心30min，转移上清，用等体积酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次，上清加入1/10体积2.5M的乙酸钠(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，置-20℃过夜。次日13000rpm离心10min，弃上清，75％乙醇洗两遍，于室温晾干后，每个1.5ml离心管加50μl TE和RNAase 6μl溶解，作酶切分析，如图3。
Westrn Blot分析重组病毒rAdCVSGP的表达接种重组病毒293细胞，病变80％左右时收获感染细胞，用含1％NP-40及100μg/ml PMSF的蛋白裂解液裂解细胞。在标准条件下进行SDS-PAGE电泳和电转移，将分离的蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜上。用10％脱脂奶/PBST(含0.05％Tween20的PBS)溶液将硝酸纤维素膜封闭2h，用1∶200兔抗狂犬病毒VeroRAB血清和膜孵育1h，PBST洗涤5次，以1∶2000 HRP标记的山羊抗兔IgG(Jackson公司)与膜继续孵育1h，PBST洗涤6次。用ECL系统(Amershia Pharmacia公司)曝光显迹，如图4。
实施例2 rAdCVSGP的增殖与纯化293细胞长至90％饱和时，以感染复数m.o.i＝5～10接种重组病毒rAdCVSGP。3-4d后，当细胞病变达到70～90％时，收集细胞液于离心管中，以2000rpm离心15min收获细胞，上清冻存备用。将细胞于干冰/37℃水浴冻化裂解4次，5000rpm离心15min，将裂解液上清加入到CsCl密度梯度离心液上层。35000rpm离心分离2h。用吸管小心吸出病毒带，加入透析带中对PBS搅拌透析。透析完全后，冻于-20℃。
实施例3小鼠脑内攻击-免疫保护实验12-14g清洁或普通级昆明小鼠以CsCl密度梯度离心所得纯化病毒进行腹腔或皮下免疫接种。单次免疫方案仅在第0天一次接种重组病毒，而初次/加强免疫方案分别在第0，7天进行免疫接种。实验组接种小鼠与对照组小鼠均在接种后一定时间(14或21天)后，以致死剂量进行脑内攻击，在14天的观察期后计算其死亡/生存率如表1。
表1 rAdCVSGP腹腔或皮下免疫接种小鼠后，直接脑内攻击-免疫保护的效果基础 加强 死亡率脑内攻击剂量免疫剂量pfu 免疫剂量pfu (死亡数/小鼠总数)1.0×1081.0×10835.8 LD50at 0/62.0×1072.0×107day 21 3/64.0×1064.0×1067/78.0×1058.0×1056/61.1×1081.1×10838.0LD50at 2/162.2×1072.2×107day 14 14/164.4×1064.4×10615/168.8×1058.8×10514/16*9.0×1080/16*1.8×10868.0LD50at 10/16*3.6×107day 14 13/16*7.2×10613/16
其中*单次皮下免疫接种组。余为腹腔免疫组。攻击病毒为CVS。**阴性对照Ad5免疫组受到致死剂量的狂犬病毒脑内攻击后全部死亡。小鼠接受rAdCVSGP腹腔或皮下免疫后，产生对狂犬病毒的特异免疫。一定剂量的重组病毒可保护87.5％～100％的免疫小鼠。
实施例4接种rAdCVSGP能诱导Beagle犬产生高滴度的中和抗体Beagle犬皮下多点接种1.0×1011pfu重组rAdCVSGP病毒，以快速荧光灶抑制实验(Rapid Flourescent Focus Inhibition Test，RFFIT)检测中和抗体滴度。接种后一周即可诱导产生具有保护作用的狂犬病特异性中和抗体，抗体滴度在4周左右达到最高峰，之后缓慢下降，并能在远高于保护性抗体水平维持至少21周，如图5。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗<130>I2001172<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1575<212>DNA<213>狂犬病毒<400>1atggttcctc aggttctttt gtttgtactc cttctgggtt tttcgttgtg tttcgggaag 60ttccccattt acacgatacc agacgaactt ggtccctgga gccctattga catacaccat 120ctcagctgtc caaataacct ggttgtggag gatgaaggat gtaccaacct gtccgagttc 180tcctacatgg aactcaaagt gggatacatc tcagccatca aagtgaacgg gttcacttgc 240acaggtgttg tgacagaggc agagacctac accaactttg ttggttatgt cacaaccaca 300ttcaagagaa agcatttccg ccccacccca gacgcatgta gagccgcgta taactggaag 360atggccggtg accccagata tgaagagtcc ctacacaatc cataccccga ctaccactgg 420cttcgaactg taagaaccac caaagagtcc ctcattatca tatccccaag tgtgacagat 480ttggacccat atgacaaatc ccttcactca agggtcttcc ctggcggaaa gtgctcagga 540ataacggtgt cctctaccta ctgctcaact aaccatgatt acaccatttg gatgcccgag 600aatccgagac caaggacacc ttgtgacatt tttaccaata gcagagggaa gagagcatcc 660aacgggaaca agacttgcgg ctttgtggat gaaagaggcc tgtataagtc tctaaaagga 720gcatgcaggc tcaagttatg tggagttctt ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc 780gcgatgcaaa catcagatga gaccaaatgg tgccctccag atcagttggt gaatttgcac 840gactttcgct cagacgagat tgagcatctc gttgtggagg agttagtcaa gaaaagagag 900gaatgtctgg atgcattaga gtccatcatg accaccaagt cagtaagttt cagacgtctc 960
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权利要求
1.一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型5型人腺病毒为载体，在E1区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行表达的元件，其中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因具有SEQ ID NO1所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。
2.按照权利要求
1所述的疫苗，其中，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因来自于CVS-N2c强神经毒力病毒株。
3.按照权利要求
1所述的疫苗，其中，所述的调控狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因进行表达的元件包括Kozak高效翻译调控核心序列ACC(ATGG)。
4.按照权利要求
3所述的疫苗，其中，所述的调控元件还包括CMV启动子和SV40多聚腺苷酸加尾信号。
5.按照权利要求
4所述的疫苗，其293细胞病毒培养物保藏号为CGMCC 0597。
专利摘要
本发明提供了一种重组复制缺陷型腺病毒载体狂犬病毒基因工程疫苗，它是以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在E1区携带有狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因及调控其进行高效表达的元件，所述的狂犬病毒包膜糖蛋白编码基因来自强神经毒力CVS-N2c狂犬病毒株，具有SEQ ID NO1所示的序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。
文档编号C12N15/09GKCN1164330SQ01120639
公开日2004年9月1日 申请日期2001年7月19日
发明者王树惠, 李文辉 申请人:中国医学科学院基础医学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan