专利名称:制备活的纯化的marek氏病疫菌的方法
MAREK氏病是一种由乌泡疹病毒，MAREK病病毒感染而引起的鸡的恶性淋巴增殖疾病。此病毒是于1907年识别出来的，现在它仍然是家禽病毒中危害性最大的一种。
本发明涉及制备由MAREK氏病病毒(MDV)株CVⅠ-988分化的一种高免疫原性和非致性病毒制剂，特别是一种抗Marek氏病疫菌的方法。此方法的特点是利用属于乌泡疹病毒血清型-1的Marek氏病毒(MDV)，该克隆接种可以保护用其接种的鸡免以后的强毒力和极强毒力的MAREK氏病(MD)病毒变种感染。该克隆是通过属于乌类泡疹病毒的Marok氏病病毒的传代和噬斑纯化而得到的。用作传代和噬斑纯化起始材料的病毒是具MDV CVⅠ-988特性的病毒，该病毒株是作为通过在细胞培养物中经系列传代使病毒减弱的低毒培养物从健康的实试室用鸡身上得到的。(Rispens等人in Avian Diseases 16，108-125页，126-138页，1972年)。在乌类细胞培养约35代后得到的病毒制剂成功用作制造抗Marek氏病(MD)的鸡的疫苗。开始病毒性减弱是在鸭胚成纤维细胞(DEF)中进行。然而在无特殊病原体(SPF)感染条件下，鸭很难存在。这就需要对每批产品进行广泛的试验，以保证其没有对乌类有致病性的微生物，在SPF条件下，鸡的存养问题较少。再者，因为它们不能将MD疫苗引入与之无关的动物种属的细胞内，故一般选用鸡细胞。因此，在1967-1968年间，即已将MDV CVⅠ-988病毒株在鸡胚成纤维细胞(CEF)中培养，且MDV CVⅠ-988疫苗的制造者们亦已转向在CEF中生产该疫苗。
虽然在实践中，由亲代病毒株MDV CVⅠ-988制取的疫苗已通过肌肉内给药提供了十分满意的结果(MAAS ET al，World poultry Sei 38，163-176页1982年)当用十倍于正常范围的剂量接种时，在高MD敏感性的SPF种的罗得岛红鸡(RHODE ISLAND RED，RIR)身上，也可能引起MD损害(AVIAN PATNOLOGy 6，395-403，1977年)。
其它所用的抗MAREK氏病疫苗有1.一种基于属于乌类泡疹病毒血清型3的火鸡泡疹病毒(HVT FC126)，(Avian Diseases 14，P413-429，1970年)和美国专利3，642，574)号专利。美国3，783，098号专利叙述了以无细胞形式使用这种疫苗的方法。
2.一种由强致病性的MDV病毒株(HPRS-16)经减毒得到的疫苗，所用病毒株属于鸟泡疹病毒血清型1(Journal of Geggnal vizology 4，p557-564，1969年)和美国专利3，674，861号)。
3.一种基于血清型2(SB-1)的MAREK氏病病毒的非致癌性病毒而制得的疫苗(Journal National Cancer Institute 60，p1075-1082，1978年)，和美国专利4，160，024号)。这种疫苗一般作为HVT疫苗的混合物使用是有效的。
本发明提供了一种病毒制剂，特别是一种疫苗，对于家禽，特别是对于鸡具有高度免疫厚性并且是非致病性的。
本发明的病毒制剂是用于属于乌类泡疹病毒血清型-1的克隆制备的，用这种克隆接种可以使鸡免受以后的强毒力和极强毒力MAREK氏病(MD)病毒变种的感染。
根根据本发明，这种克隆是通过属于乌类泡疹病毒血清型-1的Marek氏病病毒在乌类细胞培养中传代和噬斑纯化，再选择免疫原性和非致病性，特别是对MD-高敏感的罗得岛红鸡免疫原性和非致病的克隆。优选的作为起始材料的Marek氏病病毒是MDV CVⅠ-988。优选的克隆是通过在鸭胚成纤维细胞(DEF)中病毒分离株MDV CVⅠ-988的系列传代及在DEP的三十九及四十九代之间经六个噬斑纯化步骤得到的。这个被称作MDV CVⅠ-988克隆C的病毒克隆，因其对RIR鸡有抗原性且是非致病的而得以被筛选。
考虑到对其使用的问题，所研究的这个病毒克隆在疫苗生产中作为种子病毒，是通过其在细胞培养的第52代和63代之间在CEF和DEF中交替病毒传代的方法被接种到CEF中的。在第65代CEF中的这个克隆(MDV CVⅠ-988CEF65克隆C)已于1984年3月28日存放在Phabagen Collection，Vakgreep Moleculaire Biologie，Transitozium 3，Padualaan 8，3584CH Utrecht，tho Netherland(荷兰)，案存号PC PV1。
另外，该克隆还于1985年3月19日存放在法国巴黎75015RUE DU DOCTEUR ROUX 28号，巴斯德研究所国家微生物保存中心，存放号为Ⅰ-426。
本发明的一个目的是提供制造一种对一般的家禽和鸡，特别是高敏感的罗德岛红鸡无致病性的Marek氏病病毒制剂的方法。
本发明的另一个目的是提供制造具有高度免疫原性的Marek氏病病毒制品的方法。
本发明的再一个目的是提供制造使接种的鸡免受强致病性或很强致病性Marek氏病病毒株感染的Marek氏病病毒制品的方法。
本发明的一个目的是提供制造由亲代株MDV CVⅠ-988而来，但实质上只有较弱致病性，且抗原性又没有丢失的Marek氏病病毒的方法。
本发明的再一个目的是提供通过在乌类细胞培养物中一系列传代和噬斑纯化的方法得到属于乌泡疹病毒血清型1的Marek氏病病毒克隆家族，从而能从中筛出一种很好结合了非致病性和免疫原性的病毒株。
本发明的再一个目的是提供一个制造能防治很强毒力但不包括血清型2或血清型3成份的MD病毒感染疫苗的方法。
本发明的其它目的在考虑到说明书详细记载和权利要求
之后，是显而易见的。
本发明是有关制备含属于乌类泡疹病毒血清型-1的活Marek氏病病毒克隆的高免疫原性病毒制剂的方法，这种病毒是通过属于乌类泡疹病毒血清型-1的Marek氏病病毒，特别是病毒MDV-998在乌类细胞培养物中系列传代和噬斑纯化得到的，MDV-998克隆能防治接种的鸡被MD病毒及其变种MDVK，MDVGA-5，MDVRB/1B和MDV Tun感染，并对MD高敏感的SPF RIR鸡无致病性。
病毒株的减毒是通过在DEF中51次连续传代包括在DEF的三十九代及四十九代之间的噬斑纯化步骤，在此过程中收集发生实验性疫苗的生产定位细胞病理学变化(病毒噬斑或病灶)的病毒用于接种。克隆C是在最后的噬斑纯化步骤上筛选的。这样，用终点稀释的病毒接种单层细胞，并通过培养基加入0.85%凝胶，将新形成的病毒定位在原位。通过在第五十二代及六十三代之间在CEF及DEF中交替传代，及以后在CEF中的细胞培养的传代，而使病毒克隆株适应于生长在CEF中。根据接种物中的病毒剂量培养3-5天后，特异的细胞病理学改变即可观察到。由胚胎13天的鸭卵，经胰酶消化而得到鸭胚成纤维素细胞，用每毫升含有0.8×106个细胞的细胞悬液接种在培养容器(PETRI培养皿或ROUY瓶)内，细胞培养在37℃及含50%CO2条件下进行。培养介质成份如下脱矿质水 818毫升199培养基(10×浓缩的) 90毫升NaHCO3，1.4% 87毫升小牛血清 60毫升苄基钠青霉素(50，000 I、μ、/ml) 5毫升硫酸链霉素(50，000 I、μ、/ml) 5毫升PIMAFUCIN(0.25%/ml) 5毫升维生素浓缩物(BME，GIBCO) 1毫升谷氨酰胺2.6% 3.8毫升培养两天后形成了单层附着细胞，然后用已经病毒传代感染的细胞悬液接种进行感染。根据细胞病理影响的程度，用每个感染培养物中的细胞再感染4-20份新鲜的细胞培养物。自此时起，维持培养基含有脱水质水 810mlF-10培养基(10×) 50ml
199培养基(10×) 40ml胰化胨磷酸液体培养基 40mlNaHCO3，1.4% 75ml小牛血清 30ml抗生素等，如上述。
用SPF家禽孵化11天的蛋制备单层CEF。培养基成份如上所述。在病毒株没有通过其DEF或CEF中增殖而存活的期间内，将病毒储存于液氮(-196℃)中。感染细胞的冻存是在如上述的生长培养基内进行，培养基内小牛血浓度增加到10%，并含同样百分比的二甲基亚砜(DMSO)。在+20℃到-40℃范围内的冷冻速度是以每分钟1℃的速度自动控制的。通过在CEF中的噬斑分析，来估计病毒滴度。
疫苗重建之后，立即给鸡作肌肉内接种。上述的维持培养基是适合的稀释剂。每支鸡接受0.5毫升含所需剂量与细胞相关的MD病毒的接种物。
商品化的MAREK氏病疫苗是以基本上相似于研究室内的方法生产的。鉴于大批量生产，而用滚瓶系统代替固定的培养瓶(ROUX)瓶。根据一个国际专家小组[国际生物学标准化协会鸟类产品标准化委员会的报告，E、C、HULSE等出版，29-42页，日内瓦，瑞士生物标准(BIO STANDARDS)]制定的规程进行接种物的检查，生产过程中各步骤的检查，并进行终产品有无外来微生物及病毒含量有关MAREK氏病疫苗应符合某些保护性指标的要求。这可描写为在免疫感染之后，予定的期间内患病动物在接种疫苗和未接种疫苗组中所占的百分比。估计病毒制剂的免疫原性质的一个更为准确的方法，包括百分之五十保护剂量分析(PD50)，如JOURNAL OF BIOLGICAL STANDARD IZAT ION9.15-22(1981)中所介绍的。
如在引言中所指出的，当前可用的MD疫苗是由MDV CVⅠ-988病毒株而来，在组织培养物中传到第35代的制品，在农场有满意的保护效果。但这种疫苗对于有高度MD易感性的SPF RIR鸡，则可诱发MD损害。故在SPF RIR鸡身上进行了大量MDV CVⅠ-988克隆致病性的研究。
这些研究的开始是由于早期工作表明MDV CVⅠ-988DEF51克隆C和MDVCV Ⅰ-988 DEF96克隆E对SPF RIR鸡是无致病性的。例1和例2叙述了用MDV CV Ⅰ-988DEF51克隆C，MDV CVⅡ-988CEF59克隆C和MDV CVⅠ-988CEF69克隆C所作的无害性研究。表明依据本发明的病毒克隆已对RIR鸡是非致病性的。例3阐述了MDV CVⅠ-988CEF63克隆C和MDV CVⅠ-988CEF59克隆C所作的无害性研究，其中后两者同是来源于噬斑C，由第49代的DEF的培养物收集的，但其细胞传代史略有不同。这些实验证明，在一只接种克隆A，另一只接种克隆C′的两只鸡内，均观察到了对MAREK氏病特异组织学损伤。
当家禽受到各种已知的强毒性MD病毒株如MDVK和MDV GA-5，以及两种很强毒性病毒株MDVRB/IB和MDV TUN免疫感染时，本发明的病毒克隆C对保护其免MD侵害有很高的效力。
A抗原最初是在被MD病毒感染的细胞提取物及其培养液中用免疫扩散分析法(J、GEN、VIROL、4，557-564，1969)测到的。现认为“A”抗原是由分子量54K到70K的糖蛋白组成的(J、GEN、VIROL64，2597-2610，1983)。
用来检测存在“A”抗原的各批MDV CVⅠ-988的细胞传代历史，按首字缩写标示如下-MDV CVⅠ-988CEF37(DEF1-4，CEF/DEF5-14，CEF15-17)。
-MDV CVⅠ-988CEF65克隆C(DEF1-51，CEF/DEF52-57，CEF58-59，DEF/CEF60-65，空斑纯化步骤在39和49代之间)。
-MDV CVⅠ-988DEF99克隆E(DEF1-99，空斑纯化步骤在87和94代之间。
-MDV CVⅠ-988DEF166(DEF1-166)。
对MDVCVⅠ-988 CEF37，MDV CVⅠ-988CEF65克隆C，MDV CVⅠ-988DEF99克隆E和MDV CVⅠ-988DEF166，通过免疫沉淀研究检测其“A”抗原的存在，使用免抗MDV-gp54/70血清(由美国LANSING，MI的L、VELICER博士提供)。
在MDV CVⅠ-988DEF166上清液中没有测到“A”抗原，但产生于用35，65，99代感染的细胞培养物中。在一系列细胞培养传代和噬纯化期间，观察到了所产生的“A”抗原量逐渐减少。粗略估计由MDV CVⅠ-988CEF65克隆C产生的量，大约为MDV CVⅠ-988CEF37表达的“A”抗原量的90%以下。
因为本发明的病毒制品(MDV CVⅠ-988CEF65克隆C)被认为可能是充分减毒的，就其对高度易感的RIR鸡的致病性来说，有理由得出这样的结论MDV减毒并不总是同“A”抗原表达的完全丧失相关的。
例ⅠMDV CVⅠ-988DEF51克隆C的对RIR鸡的致病性是通过比较它与HVTFC126和MDV CVⅠ-988CEF35的致病性而确定的。
试验是用霍顿家禽研究站(英格兰)的SPF RIR鸡作的。鸡被放在改良的HORSTALL-BAUER隔离笼内，饲以加了LIBITUM的各种谷糠食物。对一天令的鸡接种含于0.5ml组织培养基中的10000 FFμ病毒，这相当于可用剂量的十倍。在24周内每天检查MD临床综合征的出现。所有疫苗制剂均含有细胞相关形式的病毒。
一组20只RIR鸡接种MDV CVⅠ-988CEF35商品疫苗。另一组20只RIR鸡接种本发明病毒制品(MDV CVⅠ-988DEF51克隆C)。一组43只RIR鸡接种HVT FC126。
取出死亡和频死的鸡并尸检。取组织作显微镜检查。最后将所有剩余的鸡均杀死并作肉眼和显微镜检查。神经损害如炎症性(B型)损害和淋巴样瘤(A型)损害一样，按PAYNE和BIGGS(JOURNAL OF THE NATIONAL CANCER INSTITUTE 39，281-302(1967))的分类原则进行分类。内脏器官中增加了淋巴渗透和淋巴细胞的增生如看作是MAREK氏病的征兆。调整鸡的总数，以便计算孵出后21天内的非特异死亡率。
结果如表1所示。表中所示肉眼所见病理改变和/或有显微镜下可见的MD征兆病理改变的鸡数对受试鸡总数的比例。接种商品疫苗(MDV CVⅠ-988CEF35)的RIR鸡，8只中5只诱发了麻痹。麻痹是伴随外周神经丛的神经内炎症CB型损害而出现的。另两只鸡是当其濒死时被取出的，这些鸡也表现了外周神经的B型损害。一只在试验期间死亡的鸡，没有显现任何MAREK氏病征兆。在前两周内，12只鸡因意外原因死亡。
在接种了本发明疫苗制剂的RIR实验组中，即没有肉眼可见的病变，也没有显微镜可见的损伤。然而，有一只接种了HVT FC126的RIR鸡，只有麻痹症状，显微镜检查外周神经，显示如神经内淋巴小损伤特征。最后显微镜检查发现有了只接种了HVT FC126的鸡有外周神经的B型损伤。一只有临床麻痹的鸡，显示有非特异性神经炎。
例Ⅱ相似于如例Ⅰ所述之使用RIR鸡的试验，只是用了本发明的两种制剂。(MDV CVⅠ-988CEF65克隆C和MDV CVⅠ-988CEF59克隆C)MDV CVⅠ-988CEF65克隆C由得自WICHHAM实验室的SPF RIR卵孵化的RIR鸡计20只，孵出后立即肌肉内接种10.000FFD。将这些鸡养在改良的HOR SEFALL-BAUEK隔离器内。接种后10周，将6只鸡(5只雄性，1只雌性)由隔离笼内取出，并作尸体解剖，对胸腺、法氏囊(bursa of Fabricius)、脾、迷走和肋间神经、气管和坐骨神经，以及来自两侧的神经丛作组织学检查。
观察24周后，对剩余的10只雌性鸡作尸检。选作组织学检查的组织同上。
在所有16只被观察的鸡中，无论是临床还是放大镜检查，均未见有MAREK氏病征状或与MD有关的组织学损害。
MDV CVⅠ-988CEF59克隆C由得自WICKHAM实验室的SPF RIR卵孵出的13只鸡孵出后立即肌肉内接种10.000FFD。将这些鸡圈养在改良好的HORSEFALL-BAUER隔离笼内。
两只鸡死于非特异性原因。观察24周后，将保留下的11只鸡(5只雄性的和6只雌性)作尸检，这11只鸡均未观察到临床或放大镜检查可见的MAREK氏病征。
对胸腺、法氏囊、脾、肝、迷走和肋间神经、气管、神经和坐骨神经、以及来自两侧的神经丛。观察到其中一只鸡的肝脏中有淋巴增生。因观察到与法氏囊有关的滤泡结构，故不认为损害是恶性的。
例Ⅲ
对均来源于48代MDV CVⅠ-988DEF的克隆A、B和C′，按例Ⅰ和Ⅲ所述相似方法，使用RIR鸡作无害性试验。(克隆C′和克隆C均来源于49代DEF中的同一噬斑)。另外增加了对克隆D的试验。
MDV CVⅠ-988CEF63克隆A由得自WICKHAM实验室的SPF RIR卵孵出的16只RIR鸡，孵出后立即肌肉内接种10.000FFU。实验程序与例Ⅱ相似。
没有观察到MAREK氏病的临床或放大镜可见征象。但当对24周作尸检的10只鸡进行组织为炎症损害检查时，见有一只的神经丛有符合PAYNE和BIGGS(J NATI CANCER INSTITUTE39，231-302(1967))分类标准的B型损害。MDV CVⅠ-988CEF62克隆B由得自WICKHAM实验室的SPF RIR卵孵出的18只，肌肉内接种10.000FFU克隆B。试验方法相似于例Ⅱ。18只受试鸡中，无论是临床观察还是放大检查，均未见有MAREK氏病征或与MD有关的组织学损害。MDV CVⅠ-988CEF67克隆C′由得自WICKHAM实验室的SPF RIR卵孵出的RIR鸡14只，肌肉接种克隆C′10.000FFU，此克隆在DEF中经历细胞传代达54代。试验方法相似于例Ⅱ的方法。14只受试鸡，没有见到MAREK氏病的临床或放大镜可见的征象，也未观察到与MD有关的组织学损害。
MDV CVⅠ-988CEF59克隆C′由得自WICKHAM实验室的SPF RIR卵孵出的RIR鸡13只，孵出后立即肌肉内接种10.000FFU。
观察24周之后，解剖受试动物。三只死于非特异原因，对剩余10只(6只雌性，4只雄性)作尸检。所有10只鸡均未见有MAREK氏病的临床或放大镜可见的特征。
取胸腺、法氏囊、肝、迷走和肋间神经、气管和坐骨神经，以及两侧的神经丛，作组织学检查。其中一只鸡(雌性)的坐骨神经中见有炎症性B型损害。MDV CVⅠ-988CEF97克隆D由得自霍顿家禽研究站(英格兰)的SPF RIR卵孵出的RIR鸡20只，肌肉内接种克隆D10.000FFU。如克隆E一样，这个克隆D只在DEF上经历细胞培养传代，噬斑纯化步骤是在87和94代之间进行的。两只鸡死于非特异原因。试验方法与例Ⅰ的方法相似。所有18只受试鸡，无论是临床还是放大镜检查，均未见MAREK氏病征象，作组织学检查，亦未见有与MD有关的组织学损害。
疫苗制剂的免疫学性质，最准确的测定方法是50%保护剂量(PD50)分析法(JOURNAL OF BIOLOGICAL STANDARD IZATION 912-22，1981)。
PD50定义为在体外试验中检测的，保护一组SPF鸡中MD易感鸡，使其中50%免于MAREK氏病的临床综合征和损害所必须的噬斑或病灶形成单位(FFU)的数目。于生后第九天肌肉注射强毒力MDV，进行免疫攻击;所用剂量已知是可在未接种疫苗鸡中，于10周观察期间内使70%鸡出现MD损害的量。所得到的结果，可用UCLA卫生科学计算设备服务部(BMDO3S，1964年7月1日版的修订)建立的计算程序进行统计学处理。有关这种统计学方法的使用的详细资料，见于JOURNAL OF BIOLOGICAL STAND ARDIZATION 915-22，1981。该计算机程序可作试验结果的概率分析，并确定概率回归曲线的斜率。PD50是基于具有MD感性的试验动物的病理学现象来计算的。天然抵抗力表现在对照组中。
用各种得自病株MDV CVⅠ-988的病毒克隆(不是克隆C)，肌肉内给药，作保护效能研究，得到如下结果MDV CVⅠ-988CEF55克隆A克隆A的保护效能很差。PD50试验产生一平直的剂量反应曲线，给予的病毒剂量分别为100和500FFU，结果40只受试鸡中各有19和7只免受MDV-4感染。MDV CVⅠ-988CEF55克隆BPD50试验使用克隆B制剂适应的CEF，所得PD50估计值为31.9FFU，此数值明显高于用MDV CVⅠ-988CEF59克隆C所得到的PD50估计值(PC0.05)。MDV CVⅠ-988CEF59克隆C′用适应了克隆C′制剂的CEF进行PD50试验，得到PD50大约为41.6FFU，明显高于对MDV CVⅠ-988CEF59克隆试验所得到的PD50估计值(P＞0.05)。MDV CVⅠ-988DEF97克隆D此克隆D证明为过度减毒的。有较少的鸡得以免受MDV-K感染。基于无害性和保护效能研究，可作出结论MDV CVⅠ-988克隆C是开发MAREK氏病疫苗的最好待选病毒株。
依据本发明的病毒克隆的防护效能，在例Ⅳ中阐明。
例Ⅳ通过与MDV CVⅠ-988CEF35和HVTFC126免疫原性的比较来确定MDV CVI DEF51克隆C的免疫原性。
在本试验中，将依据本发明的病毒制剂MDV CVⅠ-988DEF51克隆C的免疫原性，同广泛实用的两种制剂，即MDV CVⅠ-988CEF35和HVT FC126相比较。为此须测定PD50，PD50定义保护一组MD易感鸡中50%免于出现MD的临床综合征和或放大镜可见损害所需要的FFU数。
生后第九天的鸡用强毒力的MDV克隆GA-5(JOURNAL OF THE NATIONAL CANCER INSTITUTE51，929-939(1973))进行感染。
所用SPF鸡，为白色来杭鸡A系(WLA)。将各组试验鸡关在改良的HORSEFALL-BAUER隔离。将每个剂量组的鸡分为两个隔离笼。饲以加了LIBITUM的各种谷糠类食物。
接种后，要将病毒制剂在CEF或DEF中测噬斑滴度。观察受试鸡的MD综合征。将此期间死亡或患病的鸡由隔离笼内取出。对所有余留的鸡检查有无MD综合征。
表2示出表现有临床综合征和/或有放大镜可见的MD损害的鸡数，以及每个剂量组受试鸡的总数。每种被试病毒试剂都对MDV GA-5的肌肉内感染有保护作用，以最高的病毒剂量为最有效。对得自三个试验的数据的概率分析，算得PD50值在14和33FFU之间。三种被试病毒制剂的PD50值，未见显著差异。
表2用MDV CVⅠ-988DEF51克隆C，MDV CVⅠ-988CEF33和HVTFC126所作的三种PD50测定的比较疫苗 MDV CVⅠ-988 MDVCⅠ-988 HVTFC126DEF51克隆 CEF35感染用的病毒 GA-5 GA-5 GA-5最高剂量FFU 1000 500 500各步骤中的系列稀释度 1∶1 1∶5 1∶5被保护数总数 28/30 24/27 30/31最高剂量 29/32 21/24 30/3225/31 18/26 21/31最低剂量 12/32 9/23 8/329/32未给疫苗 3/32 5/22 4/28PD50＊ 33 14 14.7PD50的95%置信度区间 16.5-66 4.4-44.9 6.7-32.1概率单位回归线的斜率 1.07 0.87 1.50斜率的标准误差 0.18 0.23 0.27＊保护50%MD与感鸡所需要的FFU数。
例Ⅴ用依据本发明的病毒制剂MDV CVⅠ-988DEF54克隆C′和-CEF54克隆C;作与例Ⅳ同样的试验，同MDV CVⅠ-988CEF35和HVTFC126+MDVSB-1混合物进行比较。同强毒力的MDVK作感染。
结果在表3中示出。
表3用MDV CVⅠ-988DEF54克隆C′MDV CVⅠ-988CEF54克隆C，MDV CVⅠ-988CEF35和HVIFC126+MDVSB-1作的4种PD50测定的比较疫苗 MDVCVI MDVCVI MDVCVI HVTFC-988 -988 -988 126DEF54 CEF54 CEF35 +MDVSB克隆C′ 克隆C -1作感染用的病毒 K K K K最高剂量FFU 500 500 500 500各步骤中的系列稀释度 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5被保护数总数最高剂量组 28/30 29/29 30/30 27/2717/30 26/29 25/29 26/2913/30 25/30 22/29 24/29最低剂量组 12/30 18/28 14/30 22/29未给疫苗 10/28 15/29 7/30 12/29PD50＊ 26.5 12.9 10.3 6.4PD50的95%置信度区间 10.8-64.8 3.4-48.5 3.3-32.1 0.48-85.4概率单位回归线的斜率 1.24 1.22 1.20 0.79斜率的标准误 0.34 0.42 0.29 0.30＊保护50%MD与感所需要的FFU数。
例Ⅵ用依据本发明的三种病毒制剂MDV CVⅠ-988DEF54克隆C′，MDV CVⅠ-988CEF54克隆C和MDV CVⅠ-988CEF65克隆C进行与例Ⅳ和Ⅴ相同的PD50检定，与前面制剂MDV CVⅠ-988CEF35所作结果比较。用MDVRB/1B进行感染，此种病毒是从美国一些有问题的家禽群中毒力很强的MD分离株的一个代表。这种特殊的分离株是在美国从一种HVT病毒疫苗接种的产蛋鸡群中发现的系纽约州Ithaca市的K、A、Schat博士提供。
各项分析中每对PD50估计值之间的差异显著性，用自对数似然比试验所推导的计算机程序测定[Kendall和StuartAdvanced Theory of Statistics，VOL.2，3rd edifien Charles Griffin & Co.Ltd London 24234-272(1973)]。如果使用同一种系实验鸡，并且只通过肉眼检查MD综合症和损害，感染又是用一种强毒力MDV或一种很强毒力MDV，则各项PD50分析才是可比较的。如果相比较的概率单位回归线的斜率和两组对MD产生的天然抗性没有明显差异，这个统计学的计算才是可用的。
表4用MDV CVⅠ-988DEF54克隆C′，MDV CVⅠ-988CEF54克隆C，MDV CVⅠ-988CEF65克隆C和MDV CVⅠ-988CEF35所作四组PD50分析的比较疫苗 MDVCVI MDVCVI MDVCVI MDVCVI-988 -988 -988 -988DEF54 CEF54 CEF65 CEF35克隆C′ 克隆C 克隆C攻击注射 RB/IB RB/IB RB/IB RB/IB最高剂量FFU 2500 2500 560 2500各步骤中的系列稀释度 1∶5 1∶5 1∶5 1∶5保护数总数 23/23 21/21 40/41 20/20最高剂量组 23/24 17/20 39/40 20/2019/24 20/20 33/41 15/20最低剂量组 9/24 16/19 17/38 9/20未注射疫苗 0/25 0/18 4/38 2/20PD50＊ 31.6 ＊＊ 6.5＊＊ 34.3PD50的95%置信度区间 6.9-144 2.0-21.5 5.6-211概率单位回归线的斜率 1.53 1.19 1.73斜率的标准误 0.34 0.22 0.48＊保护50%MD易感鸡所需要的FFU数。
＊＊由于剂量反应曲线的不规则进程，PD50值不能计算。
＊＊＊MDV-988CEF65克隆C的PD50估计值明显不同于其它两个PD50估计值(P＜0.01)。
例ⅦPD50试验是依据本发明的MDV CVⅠ-988CEF59克隆C所采用的病毒制剂CEF进行的。结果载于表5中。以例Ⅶ所述条件为基础的这个分析，其结果与列于表2和3(这些结果此外再次列出)中的由MDV CVⅠ-988CEF35所作的两次PD50分析的结果在统计学上是可比较的。
表5用MDV CVⅠ-988CEF59克隆D所作PC50分析同用MDV CVⅠ-988CEF35苗接种所作两组分析结果的统计学比较疫苗 MDVCVⅠ-988 MDVCVⅠ-988 MDVCVⅠ-988CEF59克隆C CEF35 CEF35攻击病毒 K K K最高剂量FFU 500 500 500各步骤中的系列稀释度 1∶5 1∶5 1∶5被保护数总数最高剂量组 35/36 24/27 30/3039/39 21/24 25/2927/36 18/26 22/29最低剂量组 24/40 9/23 14/30未给疫苗 5/38 5/22 7/30PD50＊ 3.6 14＊＊ 10.3PD50的95%置信度区间 0.7-19 4.4-44.9 3.3-32.1概率单位回归线的斜率 1.06 0.87 1.20斜率的标准误 0.23 0.23 0.29＊保护50%MD易感鸡所需要的FFU数。
＊＊明显地高于CEF59克隆的PD50(P＜0.05)。
也进行了用MDV CVⅠ-988CEF59克隆C所作PD50分析同用MDV CVⅠ-988CEF35所作六组分析的统计学比较。后者的PD50试验已在J、Biol、Standardization 915-22(1981)中有述及。
表6在大约细胞培养第35代的MDV CVⅠ-988和MDV CVⅠ-988CEF59克隆C的六组PD50分析的比较试验号 CEF59 1 2 3 4 5 6克隆C攻击病毒 K K K K K K最高剂量FFU 500 250 690 690 5/20 276 433各步骤中系列稀释度 1∶5 1∶5 1∶10 1∶4 1∶4 1∶4 1∶4保护数总数最高剂量组35/36 29/29 36/39 10/10 22/22 15/2139/39 19/26 28/30 9/10 21/21 14/19 14/2127/36 15/31 13/43 6/10 22/22 7/19 3/20最低剂量组24/40 9/21 9/32 2/10 20/22 5/20 1/2212/20 2/21 1/229/22 4/22未给疫苗 5/38 7/26 17/44 3/20 4/22 5/41 0/30PD50＊ 3.6 35+ 70+ 44+ 16＊＊ 54＊＊ 75+PD50的95%置信度区间0.7-19 3.4-359 16-299 17-118 1.8-133 6.0-483概率单位回归线的斜率 1.06 2.44 1.38 2.22 1.72 0.98 1.41斜率的标准0.23 1.64 0.30 0.80 0.47 0.27 0.23＊保护50%MD易感鸡所需的FFU数。
＊＊PD50估计值明显高于CEF59克隆C的PD50估计值(试验Ⅳ P＜0.05，试验Ⅴ P＜0.01)。
+因为概率单位回归线斜率的不同(试验Ⅰ和Ⅲ)或天然保护百分率的不同(试验Ⅱ和Ⅵ)，故PD50估计值间差异的统计学计算并不合用。
对例Ⅵ和Ⅶ的分析结果可作出如下总结-对九对PD50分析试验结果进行了统计学比较。其中接种疫苗组是用MDV CVⅠ-988CEF35或MDV CVⅠ-988克隆C作的。
-CEF59克隆C或CEF65克隆C制剂的PD50估计值均低于用MDV CVⅠ-988CEF35作得到的PD50估计值。
-有四对比较组的PD50值间差异显著(2×P＜0.01，2×P＜0.05)。有一对的差异不显著。因为相比较的概率单位回归线斜率之间的差异或未注射疫苗组天然抗性的差异，故有四对的估计值间差异的统计学计算不合用。
-当应用于SPF鸡时，MDV CVⅠ-988克隆C的保护效能高于MDV CVⅠ-988CEF35。
例Ⅷ在突尼斯，由HVT FC125疫苗接种的家禽群中，分离出一组有代表性的很强毒力MD病毒。观察到在这个原始鸡群中，MD发病率为29%。此分离株(MDV)表现了极强的毒力，用几组9天令未接种鸡，在10周标准观察期间内，在每个感染的SPF鸡中只产生100个细胞。用肉眼观察，可看到MD病降低70%以上。在两组PD50试验中，使用上述有代表性的很强毒力MD病毒作感染病毒，比较此试验中MDV CVⅠ-988CEF65克隆C和HVTFC126的保护效能。试验结果如表7所示。
表7MDV CVⅠ-988CEF65克隆C和HVTFC126抗MDVTUN感染所表现之保护效能的比较疫苗 MDVCVⅠ-988 HVTFC126CEF65克隆C感染病毒 MDVTUN MDVTUN最高剂量(FFU) 268 500各步骤中系列稀释度 1∶5 1∶5被保护数总数最高剂量 38/38 37/4138/38 30/4128/40 18/39最低剂量 19/40 9/41未注射疫苗组 8/38 11/39PD50＊ 5.2＊＊ 60.8PD50的95%置信度区间 1.6-16.4 27.3-136概率单位回归线的斜率 1.75 1.35斜率的标准误 0.43 0.27＊保护50%MD易感鸡所需要的FFU数。
＊＊MDV CVⅠ-988CEF65克隆C的PD50估计值与HVTFC126 PD50值差异性显著(P＜0.01)。
据此，有理由得出结论依据本发明的病毒制品对MDVTUN感染要比HVT疫苗有更好的保护效能。
权利要求
1.制备防治Marek氏病的病毒制剂如疫苗的方法，其特征在于用属于乌类泡疫病毒血清型-1的Marek氏病活的病毒克隆，该克隆能保护用其接种的鸡免受以后的强毒力和极强毒力Marek氏病(MD)病毒变化的感染。
2.根据权利要求
1所述方法，其特征在于用对MD高敏感的无特异性(SPF)罗得岛红鸡(RIR)基本上无致病性的。
3.根据权利要求
1或2所述的方法，其中所用病毒的克隆是具有MDV CVⅠ-988特点的病毒的衍生物。
4.根据权利要求
3所述的方法，其中所用的病毒克隆具有MDV CVⅠ-988，克隆C的特点。
5.根据权利要求
1所述的方法，其中所用的病毒克隆是高度免疫原性的并赋予一个广谱的保护。
6.根据权利要求
1所述的方法，其中所用病毒克隆是以统计以上明显低于所用HVTFC126的剂量能保护50%接种了该制剂的DM敏感鸡在受到病毒MDT Tun感染后，免受肉眼可见的MD危害。
7.根据权利要求
1-6所述任何方法之一，其中所用病毒克隆是MDV CVⅠ-988C克隆，在CEF中传代的第65代克隆PC PV1及贮存在巴斯德研究所的CNCMⅠ-426克隆，或它们的任何衍生物或该克隆或其衍生物的任何重组体。
8.根据权利要求
1所述的方法，其中属于乌类泡疫血清型-1的Marek氏病病毒是经过在乌类细胞培养物中系列传代和噬斑纯化得到的，选择免疫原性的和非致病的克隆，特别是对MD高敏感的罗德岛红鸡(RIR)选择免疫原性和非致病的克隆，再制备选择克隆的乌类细胞培养物。
9.根据权利要求
8所述方法，其中用作为起始材料的Marek氏病病毒是具有MDV CVⅠ-988特性的病毒。
10.根据权利要求
8所述方法，其中选择的克隆是具有MDV CVⅠ-988C克隆特性的克隆。
11.根据权利要求
10所述方法，其中所用病毒克隆是MDV CVⅠ-988克隆，在CEF中传代的第65代克隆PCPV1及贮存在巴斯德研究所的CNCMⅠ-426克隆，或它们的任何衍生物或该克隆或其衍生物的任何重组体。
专利摘要
本发明涉及一种由属于鸟类疱疹病毒血清型1的Marek氏病病毒株，经在鸟类细胞培养中系列传代和六次噬斑纯化步骤以逐步减毒而得到的高免疫性病毒制品的方法。其原始病毒MDV CVI-988里从健康鸡身上回收的。经这样获得的Marek氏病活性疫苗，对于无特异性病原体的罗得岛红鸡是无毒性的，而这种鸡是极易长Marek氏病变肿瘤的。依据本发明的这种单价病毒制品，经过基于同样病毒株的目前在较低传代水平上使用的Marek氏病疫苗相比，证明它对两种典型的强毒力Marek氏病毒的免疫性感染，具有更好的保护效能。
文档编号A61K39/245GK85103413SQ85103413
公开日1986年12月31日 申请日期1985年5月23日
发明者哥本·弗佩德·波尔 申请人:中央俄根尼斯肯蒂格研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan