专利名称:骨髓素的制备方法
本发明属于药品制备方法，涉及一种可用作肿瘤、白血病放射治疗和化学药物治疗辅助药物，再生障碍性贫血和免疫缺陷症，特别是B细胞免疫缺陷症的治疗药物-骨髓素的制备方法及临床应用。
骨髓素存在于脊椎动物红骨髓中，在七十年代初就有关于骨髓中存在一类生物活性物质，这种生物活性物质可以抑制多能干细胞进入分裂周期，从而保护了多能干细胞免受药物杀伤的报道，但是没有关于这类生物活性物质提取和制备方法的报道。1982年法国Frinde]及Guigon等人发表了一种提取制备方法。(见Cancer Research Vol.42，638，1982)他们从胎牛骨髓中分离到几种组分，其中分子量在3500以下的组分对致死量阿糖胞苷引起的小鼠毒害有保护作用。该篇文章提到的制备方法是将胎牛骨髓在pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中搅拌均匀，在50000×g/小时下离心，取其上清液在软化水中透析一夜，将透析外液冷冻干燥，再在PH＝7.8，浓度为50mM的碳酸氢铵缓冲溶液中溶解，装柱，在Sephadex G-10柱上用相同的缓冲溶液以10毫升/小时的流速淋洗，进行柱层析分离，将洗脱液冷冻干燥，放在-20℃下保存。这种制备方法存在如下缺点1.原料来源不易，成本昂贵;2.没有找到含红骨髓最多的骨髓;3.仅靠透析分析分子量较小的成分，没有破碎细胞的程序，质量不稳定，产率也低;4.引入一些无机盐成分。该文中未涉及这种生物活性物质的临床应用。
本发明的任务是寻求一种来源丰富、价格低廉的原料，提供一种简单、可靠、高产的制备方法，同时用于临床。
本发明是通过下述方案实现的。
通过试验了解到，在动物骨骼中，肋骨所含的红骨髓最多。取经过检疫的活杀动物，如猪、牛、羊、肋骨，在粉碎机中粉碎，用蒸馏水提取，提取液经反复冻融，在低于-15℃的温度下冷冻，再于室温下融化。这样冻而又融的目的是提高产量和保证产品质量。冻融须反复进行直到细胞全部破碎为止。然后进行冷冻干燥，使提取物呈粉末状。冻干粉用蒸馏水溶成浆状，装于半透膜透析袋，进行透析，透析内、外液均用蒸馏水。收集透析外液，按含量进行配液。经除菌漏斗过滤除菌、灌装、再冷冻干燥、焙封就可以得到可供药用的产品。
本发明所得产品是一种多肽物质，能够抑制骨髓多能干细胞进入分裂周期，保护人体造血细胞，使其免受射线和化学药物引起的杀伤。可作为肿瘤、白血病放射治疗及化学药物治疗时的辅助药物，以及再生障碍性贫血、免疫缺陷症，特别是B细胞免疫缺陷症的治疗药物。
作为本发明的一个具体实施例是取15公斤经过检疫的活杀猪的肋骨，在破碎机中破碎，加7000毫升蒸馏水浸泡提取，将提取液在-15℃以下冷冻24小时，然后在室温下融化，反复冻融三次，又在-20℃下冷冻干燥成粉末状，可以得到269克产物。将此冻干粉用1000毫升蒸馏水溶成浆液，装入半透膜透析袋于蒸馏水中透析，获透析外液3000毫升，并连续透析三次，用FOlin酚试剂测其氮含量，按氮含量配成每支含1毫克蛋白/毫升的溶液，经G6除菌漏斗过滤除菌、灌装、冷冻干燥、焙封，可得到6500支成品(每支含1毫克蛋白/毫升)。
本发明所得产品特征为
成品为类白色或微黄色冻干块状物，含蛋白质的量应为标示量的90.0～115%;
酸碱度取本品1支加注射用水1毫升，溶解后依中国药典二部附录检查方法测pH值，应为6.0～7.5;
澄明度取本品1支加注射用水1毫升，溶解后依中国药典二部附录检查，应符合规定;
干燥失重取本品，以五氧化二磷为干燥剂，减压干燥至恒重，依中国药典二部附录检查，减失重量不超过5.0%;
热原取本品2支加注射用水2毫升，依中国药典二部规定检查，剂量按家兔体重每公斤注射1毫克，结果符合规定;
安全试验取本品1支加注射用水0.25毫升，依中国药典二部规定检查，剂量为每只小白鼠尾静脉注射0.25毫升，结果应符合规定。
本发明所得产品毒理试验如下慢性毒理试验取本品1支加注射用水0.5毫升，取体重为250～350克的健康豚鼠5只，连续3日隔日腹腔注射致敏液0.5毫升。2周后，再自股静脉注射1毫升，注射后15分钟内，观察动物没有连续干咳、连续前爪抓鼻、明显竖毛、四肢发软躺卧、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。
急性毒理试验取小鼠5只，自尾静脉注射本品1支于每只小鼠，相当于人体用量500～1000倍(人体正常用量为2～4毫克/50公斤次)，48小时后观察小鼠没有上述不正常现象。
无菌试验取本品1支加培养液(厌氧、需氧、霉菌)至1毫升，依中国药典二部附录检查，符合规定。
活力测定经实验，骨髓素对多能干细胞有非常显著的抑制作用。
含量测定取本品1支加注射用水1毫升，按Folin酚试剂法测定其蛋白含量。
本发明所得骨髓素用于临床试验结果如下1.骨髓素支持肺癌患者放射治疗和化学药物治疗的效果。
在放射治疗和化学药物治疗开始前一周起用骨髓素，每日肌肉注射1针，每针含2毫克蛋白，除加适量维生素外，不用任何升血药和影响免疫机制的药，直到治疗结束。在放射治疗和化学药物治疗的前期、中期和后期观察白细胞等有关化验指标和脱发、食欲、体重等临床指标，以此作为实验组。
以升血药利血升，鲨肝醇支持肺癌患者放射治疗和化学药物治疗作为对照组。观察指标与实验组同。
实验组观察了10例肺癌患者，除1例在用药第七周出现过敏反应(原因待查)外，其他无不适反应。患者食欲、精神较好，无脱发，无明显的放射治疗和化学药物治疗的副作用，肝、肾功能未见异常。治疗前期白细胞数平均为6400/mm3，治疗中期平均为5850/mm3，治疗后期平均为6100/mm3，其下降程度为8.6～4.7%。
对照组中也观察10例肺癌患者，白细胞数治疗前期平均为9300/mm3，治疗中期平均为7500/mm3，治疗后期平均为5700/mm3，其下降程度为19.4～38.7%。
上述两组肺癌患者治疗过程中白细胞数变化的对比表明，在保护白细胞方面，骨髓素优于利血升和鲨肝醇，而且实验组中5例肺癌患者的血清蛋白电泳γ组分在治疗后期均显著增加，平均由治疗前的17.20%增加到治疗后的21.0%。由此可证实骨髓素对肺癌患者接受放射治疗和化学药物治疗时有保护机体免疫功能，减少骨髓损伤的作用。
2.骨髓素支持对白血病及淋巴骨髓癌患者的治疗效果。
有15例患者，其中急性白血病12例，淋巴瘤2例，多发性骨髓瘤1例。先单独使用化学药物治疗，观察血象等变化作为对照。尔后以同样化学药物加骨髓素4毫克，每日肌肉注射1次，作为治疗组，观察血象变化。
对照治疗时，15例患者经化学药物治疗后均见三类血细胞减少，尤其是白细胞和血小板减少显著，平均血红蛋白减少2.27g/dL，红细胞减少60万/mm3，白细胞减少2513/mm3，血小板减少4.64万/mm3，临床症状如食欲减退，恶心、呕吐等较明显。
治疗组15例中有10例三类血细胞均见增加，白细胞不增加或减少者4例，血小板减少者1例，无变化者1例，红细胞减少者1例，但程度均较轻。平均血红蛋白上升1.7g/dL，红细胞上升56.9万/mm3，白细胞上升1613/mm3，血小板上升5.51万/mm3。
上述结果说明骨髓素对血液系统肿瘤的化学药物治疗有保护作用。
3.骨髓素治疗贫血症患者的临床效果22例患者，其中再生障碍性贫血18例，铁粒幼细胞贫血2例，淋巴瘤继发贫血2例，所有患者均有全血细胞减少。以骨髓素4毫克，每日肌肉注射一次，3个月为一疗程，以此作为治疗组。以另10例再生障碍性贫血患者单用雄性激素(丙酸睪丸酮100毫升/日肌肉注射;或康力龙6毫克/次，3次/日)或加中药，一疗程为1～3月，以此作为对照组。在治疗前后观察两组患者的血象变化。
对照组10例中，疗效不甚显著，血红蛋白均有轻度减少;红细胞有3例增加，7例减少;白细胞有3例增加，7例减少;血小板10例均轻度减少。平均血红蛋白减少0.55g/dL;红细胞减少16万/mm3;白细胞减少369/mm3;血小板减少0.82万/mm3。
治疗组22例患者中，血红蛋白有19例增加，3例减少;红细胞有12例增加，4例减少，1例无变化，5例未查;白细胞有16例增加，6例减少;血小板有15例增加，6例减少，1例无变化。平均血红蛋白增加2.4g/dL，红细胞增加89万/mm3，白细胞增加1309/mm3，血小板增加2.73万/mm3。由此可见，用骨髓素治疗贫血症患者能收到明显的效果。而且其中有一例的效果更为突出。该患者再生障碍性贫血入院，入院时血红蛋白仅4g/dL;红细胞168万/mm3;白细胞3400/mm3;血小板1.8万/mm3。经用雄性激素及中药治疗2个月，效果不明显，虽经多次输血，血红蛋白仅5.5g/dL;白细胞、血小板减少。改用骨髓素治疗1个月后，血红蛋白升至8.3g/dL，血小板升至5.1万/mm3，不需再输血。2个月后血红蛋白升至10.9g/dL白细胞升至6400/mm3，血小板升至7.5万/mm3。3个月后出院，此时血红蛋白已升至12g/dL，随访一年仍维持缓解。
权利要求
1.一种能够抑制骨髓多能干细胞进入细胞分裂周期，保护其免受杀伤的药物-骨髓素的制备方法，其特征在于(1)取动物肋骨，如猪、牛、羊肋骨为原料，经粉碎后，用蒸馏水提取；(2)提取物经冻融后，冷冻干燥；(3)用蒸馏水将冷冻干燥产物溶成浆状，进行透析，收集透析外液，按要求配液；(4)过滤除菌、灌装、焙封。
2.根据权利要求
1所述的骨髓素制备方法，其特征在于所说的冻融是在-15℃以下冷冻，然后在室温下融化。
3.根据权利要求
1所述的骨髓素制备方法，其特征在于所说的透析内外液采用蒸馏水。
专利摘要
本发明公开了一种药品——骨髓素的制备方法。本方法所用原料为动物肋骨如猪、牛、羊肋骨，经粉碎后用蒸馏水提取；提取液经冷冻干燥后用蒸馏水溶成浆状进行透析。透析内外液采用蒸馏水，收集透析外液，要求配液。最后经过滤除菌、灌装、培封制成骨髓素药品。本发明所得产品——骨髓素用作肿瘤、白血病放射治疗和化学药物治疗的辅助药物；再生障碍贫血和免疫缺陷症，特别是B细胞免疫缺陷症的治疗药物。
文档编号A61K35/28GK85106322SQ85106322
公开日1987年3月18日 申请日期1985年8月23日
发明者陈濂生, 肖斐亚, 张洪碧, 刘汉民, 陈德明, 李芳芳, 曹照根, 王孟淑, 任时仁, 刘孝峰 申请人:中国人民解放军309医院, 北京大学, 北京市第一生物化学制药厂导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan