专利名称：培养天然牛黄的生产工艺的制作方法
本生产工艺属于一种生物制药方法，它是以牛胆汁或以一定比例的牛、猪混合胆汁作原料，在特制的培养器里模拟牛胆囊结石形成的病理条件而培养出天然牛黄。
牛黄就是牛的胆囊结石，是一种名贵中药材，自古就开始入药，但由于天然牛黄产量极少，所以自古至今从来没有满足过医疗的需要，为此，从50年代起，国内一些研究单位和制药厂通过分析天然牛黄的各种成分及药理作用，研制成功了人工牛黄，并投入了生产。人工牛黄在镇静、抗惊厥、解热等方面，经药理和临床证实与天然牛黄具有相同的作用，但在心、脑血管性疾病、健康长寿以及在治疗癌症的科学研究中天然牛黄已显示出它的特色。为了获得更多的天然牛黄，国内从70年代后期又开始了牛体内培植牛黄的研究，一直到今天已有了突破性进展，但从目前搞的较好的一份报告(即山西省农科院畜牧兽医研究所武骏秀等同志搞的牛体内培植天然牛黄)，最高产量17.6克，最低4克，平均8.6克，时间一年(中药材科技1983年6月第15页)一头牛一年产黄8.6克，价值688元(按每克80元计算)，而一头牛一年的草料费就价值600-800元，所以经济效益不显著。在这种情况下我们发明了体外培养天然牛黄的方法，经中国医学科学院情报研究所进行国内文献检索和专家访问，截止88年5月29日没有发现这方面的报道和研究单位，经中国科技情报研究所进行国际联机检索，检索了六个数据库(九个文档)未见与本发明有关的国外文献资料。
生产工艺大肠杆菌的分离、鉴别与诱变→菌种→接种种子培养基→接种胆汁→离心沉降→干燥→成品。
一、菌种的分离、诱变1、大肠杆菌分离来源(1)从牛、猪、鸡胆汁中直接分离大肠杆菌。
(2)从牛、猪、鸡、人粪便中分离大肠杆菌。
2、诱变鉴别培养基(1)配方a、3DM蛋白胨2克NaCl0.35克琼脂2克乳糖1克1%中性红水溶液0.5毫升蒸馏水70毫升胆汁30毫升b、5DMc、6DM在3DM配方基础上将胆汁含量分别改为50%和60%。
(2)配制方法a、将蛋白胨、NaCl、琼脂加入70毫升水中加热溶解。
b、然后加入乳糖、胆汁。
c、纱布过滤。
d、调PH值7.4-7.6。
e、加1%中性红水溶液0.5毫升。
f、10磅20分钟高压灭菌。
g、冷至50℃倾注成平板。
3、菌种保藏培养基即在6DM基础上除去中性红。
4、分离诱变方法胆汁(牛、猪、鸡) (4000转/分)/(离心) 沉淀物或粪便(牛、猪、鸡、人) (接种)/() 3DM (37℃24小时)/(选红色菌落) 5DM (37℃24小时)/(同时作细菌学鉴定) 6DM→菌种斜面保存。
二、接种种子培养基1、配方蛋白胨1.2克NaCl0.35克牛肉膏0.4克乳糖0.3克蒸馏水70毫升胆汁30毫升2、配制方法(1)将蛋白胨、NaCl、牛肉膏加入70ml水中加热溶解(2)加乳糖、胆汁
(3)纱布过滤(4)调PH值7.4-7.6(5)10磅20分钟高压灭菌3、接种方法从菌种斜面或6DM构取大肠杆菌菌落，接种种子培养基，37℃24小时即可作种子使用。
三、接种胆汁1、胆汁来源(1)活体牛引流胆汁(2)屠宰后的新鲜牛胆汁(3)60%以上牛胆汁与猪胆汁混合(4)羊胆汁亦可2、胆汁质量要求(1)取胆汁要无菌操作(2)新鲜无变质3、牛黄培养罐的材料要求培养罐内壁可用玻璃、陶瓷、乳胶等材料构成。在实验室里可用500或1000毫升的三角瓶代替。
4、添加成份为乳糖、蔗糖、麦芽糖、牛肉膏、CaCl2、MgSO4，其比例随胆汁质量而变，以下为常用比例。
乳糖0.1%牛肉膏0.05%蔗糖 0.05% CaCl20.005%麦芽糖 0.05% MgSO40.003%5、培养温度在15-42℃均能长出牛黄，以34-39℃为最佳。
6、在一个大气压下培养。
7、培养时间接种24小时至26天内均有牛黄产生，以4-13天为佳。
8、PH值控制在6.3-8.0之间。
四、离心沉降一般培养4-16天，当培养罐底牛黄沉淀达一定量后，用离心机离心沉降(4000转/分)。
五、干燥将离心沉降物置于普通干燥箱60℃以下干烤至干(真空干燥更好)，然后研磨成粉末，并除去大的杂质颗粒即得牛黄成品。
用本生产工艺生产出来的产品为橙黄色或棕黄色疏松粉末，味先苦后甜，按中药鉴定学(任仁安主编)1986年版显微鉴别于天然牛黄组织特征相同，按中国药典(1985年版)与天然牛黄对照检验，挂甲试验，糠醛-硫酸反应;氯仿-硫酸-过氧化氢反应均与天然牛黄一致。薄层层析，与胆酸、去氧胆酸、胆红素对照品的相应位置上显相同颜色的斑点，与天然牛黄一致。
本发明的目的就是为了生产更多的天然牛黄，以满足医疗和科研的需要，同时也是脱贫致富的一条门路，用一头牛通过胆囊或总胆管与十二指肠体外接桥手术取胆汁，平均每头每天可取胆汁700毫升，可连续取100天(3个月以上)，每1000毫升胆汁可产牛黄1克(平均值)，目前我们的最高产量已达到1000毫升胆汁产3.85克牛黄(质量合格)，这样一头牛一次手术应用3个月可产牛黄70克，3个月后将此牛卖掉再换新牛，一年可轮换三头牛，即同样消耗一头牛一年的草料，用体外培养可得到210克牛黄，而牛体内培植一年仅得8.6克，其年经济效益是牛体内培植牛黄的24.4倍。活体引流胆汁连续使用3个月，对牛健康没有明显的影响，吃喝正常，体重有增有减，与饲养管理相关，胆汁的质量与饲养管理也相关，使用后的牛卖价与买价基本相同。
实施例菌种 (接种)/() 100毫升种子培基(三角瓶) (37℃)/(24小时) 接种1000毫升牛胆汁(乳糖1克;蔗糖0.5克;麦芽糖0.5克;牛肉膏0.5克;CaCl20.05克;MgSO40.03克) (37℃)/(6天) 离心沉降并放于白的确良布上，放在普通干燥箱里55℃干燥至干，研磨成粉末即可。
权利要求
1.一种培养天然牛黄的生产工艺，其特征是在牛体外用牛、猪、羊胆汁模拟牛胆囊结石形成的病理条件而培养生产出天然牛黄。
2.根据权利要求1所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于用大肠杆菌接种于胆汁进行培养而生产天然牛黄。
3.根据权利要求2所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于所用的胆汁中添加了乳糖、蔗糖、麦芽糖、牛肉膏、CaCl2、MgSO4。
4.根据权利要求3所述的培养的生产工艺，其特征在于胆汁中添加的物质重量比分别是乳糖0.1%、蔗糖0.05%、麦芽糖0.05%、牛肉膏0.05%、CaCl20.005%、MgSO40.003%。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于完成牛黄培养后采取离心沉降，提取天然牛黄。
6.根据权利要求1、2、3、4所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于培养温度在15-42℃。
7.根据权利要求1、2、3、4所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征是培养时气压为一个大气压。
8.根据权利要求1、2、3、4所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于胆汁的PH值为6.3-8.0。
9.根据权利要求1、2、3、4所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于大肠杆菌菌种的培养基中含有乳糖和胆汁。
10.根据权利要求9所述的培养天然牛黄的生产工艺，其特征在于大肠杆菌的菌种培养基配方为蛋白胨 1.2克 NaCl 0.35克牛肉膏 0.4克 乳糖 0.3克蒸馏水 70毫升 胆汁 30毫升
全文摘要
本发明是在体外培养天然牛黄，它是以牛胆汁或一定比例的牛、猪混合胆汁为原料，在一个特制的培养器里模拟牛胆囊结石形成的病理条件而培养出天然牛黄，其产品符合中国药典(85年版)的规定，其性状、成分和药理作用等均与天然牛黄类同。用牛活体取胆汁来体外培养天然牛黄，其年经济效益是牛体内培植天然牛黄的24.4倍。
文档编号A61K35/413GK1041105SQ88106429
公开日1990年4月11日 申请日期1988年9月12日 优先权日1988年9月12日
发明者郝满良, 王志君, 周世贞, 陈富海, 李铁栓 申请人:河北农业大学