专利名称：抗家禽大肠杆菌败血症疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及保护家禽抗大肠杆菌败血症的疫苗，以及通过投与这种疫苗而抵抗家禽大肠杆菌败血症的方法。
大肠杆菌败血症或大肠杆菌病是一种通常发生于家禽(如小鸡和火鸡)中的疾病，它带来许多重大损失。患有这种疾病的鸟的特征性症状是肺泡炎、心包炎以及肝周炎。对该领域进行的大部分研究表明，在所说的病鸟中遇到的大肠杆菌株有一半以上属于下列三种血清型之一01∶K1，02∶K1，或078∶K80。在美国，也经常遇到血清型035。通常认为，大肠杆菌败血症是继发感染，它是在呼吸道被引起呼吸道疾病的病毒或支原体损伤后，通过它而进入机体的。
对于在家禽大肠杆菌病的发病过程中发挥作用的致病因素几乎不了解。在哺乳动物的感染中发挥作用的大肠杆菌菌株的致病因素包括，例如，粘附菌毛、毒素和铁螯合机制。
许多通常具有高度宿主特异性的不同粘附菌毛已被描述。在腹泻的病人中遇到过CFA菌毛，在腹泻的小猪中遇到过K88菌毛，在腹泻的绵羊、牛犊和小猪中遇到过K99，在尿道感染的人中遇到过P菌毛(包括F11型的菌毛)。另外，也已发现，投与作为疫苗的纯化型所说类型粘附菌毛，在相应类型的动物中产生了保护性免疫应答。但是，对于家禽大肠杆菌病的类似致病因素还未被鉴定。
现已发现一种保护家禽抗大肠杆菌败血症的疫苗。其特征在于，它含有F11型的菌毛或其免疫部分，或含有具有遗传物质的生物体，这种遗传物质为所说的菌毛或其免疫部分的产物以及可能存在的排泄物编码。
尤其是，通过研究已可能表明，从患有大肠杆菌病的小鸡的受影响心脏分离出的大肠杆菌菌株产生出与F11型的菌毛相同的菌毛，此种菌毛也存在于引起人尿道感染的大肠杆菌菌株中。
通过血清学可能证明，绝大多数患有大肠杆菌败血症的鸟类是被含有F11型菌毛的大肠杆菌感染的。
按照SDS-PAGE，这些菌毛含有表现分子量为18.0KD的亚单位蛋白质。
它们可被在37℃培养的固体琼脂培养基上的野生鸟的大肠杆菌菌株产生。但如果大肠杆菌是培养在肉汤中，则未被发现。如果细菌是培养在血琼脂(基质)板(如Oxoid制造的)上，则进行18KD菌毛的最佳表达。Peuassay琼脂板(Difco)也是合适的培养基。在20℃生长时不形成18KD菌毛。
过去已从野生型尿路病原体的大肠杆菌菌株中克隆F11菌毛(见deRec，J.M.等，FEMSMicrobiologyLett.29，91-97，1985)。用含有为F11菌毛编码的基因的pPLL291-15质粒转化无菌毛大肠杆菌K12菌株AM1727，该转化菌株就能够产生F11菌毛。现已按下列参数，将所说的F11菌毛与从大肠杆菌CH4菌株纯化的18KD菌毛进行了比较，该菌株属于经常出现于鸟类中的02∶K1∶H血清型。
a.形态学在电子显微镜下，F11和18KD菌毛表现相同其菌毛大约都是1μm长，但其直径大约都是7nm。
b.分子量通过SDS-PAGE发现，F11和18KD菌毛亚单位的表现分子量均为18KD。
c.免疫化学特异性在酶联免疫吸附检测(ELISA)中，F11和18KD菌毛同样地与抗F11单克隆抗体反应(见J.Clin.Aicrobiol.24，121-125;1986，deRee.J.M.等)，而不与抗FIA、FIC、F7、F72、F8、F9、F12或F13型的菌毛的单克隆抗体反应。
d.氨基酸组成18KD亚单位的氨基酸组成与F11亚单位的组成基本相同(VanDie，I等;D.L.Lark(ed.)，Proteincarbohydrateinteractionsinbiologicalsystems，Academicpress，London，pages38-46，1986)(见表1)。
表1F11和18KD菌毛亚单位氨基酸组成的比较氨基酸 F111)18KD2)Asx1818.6Thr1415.3Ser1211.0Glx1716.5Gly2019.6Ala1920.2Val1312.2Ile65.8Leu1010.3Tyr32.2Phe87.7Lys1110.1Arg00.9His11.4Met1Cys2Pro66.6Total161161
1)按照氨基酸序列(见
图1)计算2)在6NHCl中水解后，使用ultrapac8柱(LKB)通过SODIUM系统测定。
e.氨基末端的氨基酸序列18KD亚单位的氨基末端的前17个氨基酸的序列与已知的F11亚单位的对应序列相同(VanDie，I.et.al.;1986)-图1表示了整个F11亚单位蛋白质的氨基酸序列。实际分子量16.4KD可从其序列计算。
P菌毛的粘附特性，家F11一样，可通过人红血球甘露糖抗性血凝反应(MRHA)而被观察到。这种甘露糖抗性血凝反应可通过在甘露糖存在的情况下，将表达足够量所说P菌毛的大肠杆菌与人红血球混合而显示。
足够P菌毛粘附于人红血球的最小受体结构已被鉴定为二糖Galα1→4Galβ(Kallenius，G.等，Lancetⅱ.604-6;1981)。这种二糖与乳胶颗粒偶联产生一种工具，它通过乳胶凝聚而特异性地证明细菌上的P菌毛(deMan，P.等，J.Clin.Microbiol.25，401-6;1987)。
最近已表明，负责粘附的不是F11菌毛本身，而是与菌毛相关的特定粘附蛋白(也称作“微成分”)(VanDie，I.等，MicrobiolPathogenesis1，51-56;1986)。
表2显示了F11菌毛的表达与尿路病原性大肠杆菌菌株的吸附特性的相互关系，比较了产生F11菌毛的重组克隆和一些从患有大肠杆菌病的小鸡的受害心脏分离出的大肠杆菌菌株。从这一表中得知，从小鸡中分离出的大肠杆菌的F11菌毛至少象人大肠杆菌的F11菌毛一样识别同样的受体。
表2F11菌毛的表达，血凝反应及P-受体识别菌株数a)在下列检测中测得的在下列试验中测得的(血清型)F11菌毛的表达粘附ELISAb)Westernc)MRHA P-受体印迹试验d)试验e)H291(01∶K1)＞4.7+++++++AM1727----AM1727/pPIL291-15＞4.7+++++++++++CH2(078∶K80)3.0+++CH4(02∶K1)＞4.7++++++CH5(02∶K1)2.7---CH6(01∶K1)＞4.7++++++CH7(015∶K14)----CH96(078∶K80)3.2++++CH139(02∶K1)＜4.7++++++++
a)H291为人大肠杆菌，F11参照菌株C1976;AM1727/pPIL291-15为少菌毛K12菌株AM1727的产生F11菌毛的重组克隆;
b)用抗F11血清进行的整个细菌酶联免疫吸附检测;10log滴度被定为具有至少两倍于本底值的A540值的最高血清稀释度。
c)带有抗F11血清的粗菌毛制品的Western印迹。
d)用人红血球进行的甘露糖抗性血凝反应。
e)被Galαl→4Galβ包裹的乳胶颗粒的凝聚。
符号的含义-在上面提到的试验中无反应性;
+→++++在上面提到的试验中反应程度的逐级增加。
本发明的疫苗也可能含有，与F11菌毛一起或取代F11菌毛，F11菌毛的致免疫部分。这种致免疫部分可被理解为意味着18KD亚单位，其聚集物，或其片断或为F11菌毛、其聚集物或片段所特有的粘附蛋白。18KD亚单位的这一片联或所指类型的F11粘附蛋白可能是一种多肽，它含有能够刺激抗家禽F11型大肠杆菌的保护性抗体的一个或多个抗原决定基。
通过已知技术本身，可发现18KD亚单位的合适多肽片段或F11粘附蛋白。通过测定氨基酸链的连续片段的平均亲水性的这样一种技术已由T.P.Hopp和K.R.Woods描述(Predictionofproteinantigentcideterminantsfromaminoacidsequences;Proc.Natl.Acad.Sci.78，3824-3828;1981)。这种测定的结果显示于图2。在该图中，描绘了基于已知氨基酸序列的F11亚单位的亲水性外观。其中绘制的外形显示了每7个氨基酸的亲水性平均值渐次加重。具有最明显亲水性的区域被认为是可能组成抗原决定基的区域。在图2中，这些区域用黑块标明，它们对应于氨基酸序列24-33Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Ala-Asp-Gln-Ser-Ile45-57Ala-Gly-Gly-Thr-Ser-Lys-Pro-Met-Asp-Leu-Asp-Ile-Glu67-78Lys-Gln-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Asn-Gly-Lys-Val-Gln87-95Thr-Gly-Gln-Ala-Glu-Glu-Leu-Ala-Thr123-130Pro-Leu-Lys-Asp-Gly-Asp-Asn-Val136-142Leu-Val-Lys-Lys-Ala-Asn-Gly.
据推测，F11菌毛的18KD亚单位的抗原决定基也位于这些区域。对于F11菌毛，I.VanDie，W.Hoekstra及H.Bergmans使用同样的模式也得出了类似的结论。
利用专利申请WO84/03506所述的方法(所谓的蛋白扫描法)，也能够发现18KD亚单位或F11粘附蛋白的适当免疫化学活性多肽片段，其中合成了一系列部分重叠的多肽，它们与所研究的蛋白质的部分序列相对应，但研究了它们与抗体的反应性。
为了增加致免疫性质，也可将这种多肽片段选择性结合到一载体上。
F11菌毛或其致免疫部分可通过采用已知方式从F11型野生型大肠杆菌株或其衍变物分离菌毛，或者通过选择性分离其致免疫部分而制得。
F11菌毛或其致免疫部分也可从被重组DNA转化的细胞开始产生，这种重组DNA含有为F11菌毛或其致免疫部分的产生及选择性的分泌而编码的遗传物质。
另外，尤其在多肽片段较小的情况下，也可以通过人工合成的方法完整地制备它们，例如，利用Merrifield的方法(它利用了一种固相)。
本发明的疫苗也可能含有一种生物体，这种生物体中有为F菌毛或其致免疫部分的产生和/或分泌编码的遗传物质。
它最好涉及非致病生物体。
这些生物体就其本质能够产生所说的抗原物质，或具有为所需的抗原物质编码的重组多核苷酸。
尤其可以使用病毒或细菌作为这种重组生物体。所说的重组机体本身能够产生所需的抗原物质，并选择性将其分泌。
本发明的疫苗最好通过非肠道，例如通过皮下或肌内投与。按这种方式投给疫苗可使接种过的鸟产生主动免疫，也可以投给下蛋的鸟，使其后代产生被动免疫。在被免疫的下蛋鸡中产生的抗体当然会进入其卵黄中，因而以后也就存在于孵化的小鸡中。
本发明的疫苗也可通过口内、鼻内方式给与，也可通过吸入气雾剂给药-在这种情况下，该疫苗最好含有活的非致病生物体，它具有为F11菌毛或其免疫部分的产生和分泌编码的遗传物质。
本发明的疫苗也可通过象上面所述的那样，首先为蛋白质，或从其获得的多肽，或F11菌毛的产物，或含有这些F11菌毛的微生物提供蛋白质或多肽而制备。
在后一种情况下，从大肠杆菌获得菌毛是最佳实施方案。一般是，在培养带有F11菌毛的大肠杆菌后，通过机械分离(剪切)和/或加热，然后除去细胞(通过离心和/或(超)耍酉妇蟹掷氤鯢11菌毛。然后，通过超过滤、柱层析或特定沉淀(使用硫酸铵或其它盐，或通过改变pH值至菌毛的等电点)等手段，除去来自培养基和/或细菌膜的污染物，进一步纯化菌毛。
对于非肠道接种，通常将存在于水溶性溶液或悬浮液中的活性成分与其它的组成成分混合，以增强活性或货架寿命。这些成分包括盐、福尔马林、pH缓冲剂、以及改善免疫应答的乳化剂和佐剂。合适的佐剂包括矿物油、胞壁酰基二肽、氢氧化铝、皂草苷、聚阴离子和两亲物质。
疫苗的组成和接种系统都是可以变化的，它是根据所保护的鸟的类型、鸟的年令及重量、所需要的保护期限及投与的方式以及希望产生主动免疫还是借助于母体抗体的被动免疫而定。对于非肠道接种，每一剂中活性成分的有效量大约为10-100μg。
上面所述的抗具有F11菌毛的大肠杆菌的主动免疫主要在健康鸟类中作为保护性处理而加以应用。它并不是说已被具有F11菌毛的大肠杆菌感染的鸟类适合于用抗F11菌毛、其部分或其聚集物的抗体来治疗。
实施例1菌毛的纯化为了纯化菌毛，将三株野生型大肠杆菌于37℃在血琼脂基质(Oxoid)板上培养一夜。为此，使用了大肠杆菌CH2(078∶K80∶H4)、CH4(02∶K1∶H-)和CH6(01∶K1∶H)菌株，它们都是从患有大肠杆菌病的(小)鸡的受损心脏分离的。F11菌毛克隆AM1727-p P IL291-15(De Rec等，1985)也在Biostat 发酵罐(Braun)的“Brain Heart Infusion”肉汤中培养16小时，该肉汤含有50μg/ml氨苄青霉素。培养是在37℃恒温、pH7.4以及近似40%的氧气饱和度的条件下进行。
将细菌收集在pH值为7.5的10mMTris-HCl缓冲液中。
通过在Sorval全向混合器中将细菌置于冰上1分钟连续处理15次，或在65℃将细菌加热15分钟，或将上述两种方法结合对细菌进行处理，使菌毛从细菌上释放。
然后通过离心和过滤除去细菌，浓缩粗菌毛溶液，且在带有YM100过滤器的Amicon容器中充分洗涤菌毛。
接着用经过某些改进的由Korhonen等描述的方法(Infect.Immun.27，568-575，1980)纯化菌毛，亦即用硫酸铵沉淀菌毛，用脱氧胆酸钠溶解菌毛，然后在蔗糖梯度中将其离心。
以这种方式纯化的菌毛制品在电子显微镜下显示出同样的菌毛结构(如VandenBosch，J.F.等所述，Infert.Immun.29，226-233，1980)。所有菌毛制品在SDS-PAGE(如Lugtenberg，B.等所述，FEBS.Lrtt.58，254-258，1975)的18KD处都显示一个单一条带，且在Westem印迹(如Muilerman，H.G等所述，见Anal.Biochem.120，46-51，1982)中都与抗各种菌毛的所有血清发生反应。
实施例2A.含有本发明的菌毛的疫苗，以一种油包水乳剂来制备。以含有多山梨醇酯80和山梨聚糖单油酸的矿物油(低粘度石蜡)作为乳化剂。
B.象实施例2A一样制备一种疫苗，它含有50μg/ml从野生型CH4(02∶K1∶H-)大肠杆菌纯化的F11菌毛。
C.象实施例2A一样制备一种疫苗，它含有从克隆AM1727-pPIL291-15纯化的F11菌毛50μg/ml。该克隆的样品于1987年10月19日保藏于巴黎巴斯德研究所的微生物培养物收藏中心(theColloctionNationaledeCulturesdeMicroorgnismes)，编号为I-709。
实施例3主动免疫为了主动免疫实验，将按实施例2的方法制备的疫苗通过肌肉注射的方式注射进所研究的鸟中，然后利用酶联免疫吸附检测法，测定专抗菌毛的血清抗体滴度的发展。
A.酶联免疫吸附检测为了进行酶联免疫吸附检测，将装有100μl按实施1的方法制备的纯化菌毛溶液的微滴定板在室温下保温一液。在该平板的每孔中，每毫升0.04MPBS(pH7.2)中含有2.5μg菌毛。
然后向每孔中加入200μl含5%BSA的PBS溶液，于37℃保温20分钟，用水洗涤后在空气中干燥。
通过向每孔中加入100μl存在于缓冲液(pH7.4，0.2M Na2HPO4，0.2M Na Cl，0.1%BSA和0.05% Tween 80)中的血清系列稀释液，然后于37℃保温一小时而对抗菌毛血清进行研究。
洗涤之后，向每孔中加入100μl经稀释的结合物(兔抗小鸡IgG/PO(H+L)，Nordic)，然后再次洗涤。
向每孔中加入100μl酶底物溶液(含有15ml蒸馏水，1.5ml存在于乙酸钠/柠檬酸缓冲液(pH5.5)中的0.14%过氧化脲溶液，以及0.2ml存在于DMSO中的0.6%TMB溶液)，通过比色法测定抗体活性。
酶促反应在暗处进行。10分钟之后通过向酶孔中加入50μl 4N H2SO4而终止反应，然后在Microelisa Reader(Organon Teknika)上于450nm(A450)处测定吸收值。
血清的第一次稀释度为1∶50。
通过将接种前获得的且以1∶50稀释的血清结合到至少8个孔中而测得每孔的本底。
抗体滴度被定为产生至少1.5倍于平均A450本底的A450的最大血清稀释度。
B.对SPF小鸡接种通过肌内注射的方式给6周龄的SPF小鸡(GezodheidienstVoorPluimvee(PoultryHealthService)，Doorn，Netherlands)接种1ml按实施例2B制备的疫苗，4周之后，用同样材料进行加强注射。结果见表3。
表3给6周龄小鸡接种后血清抗体的产生;ELISA滴度的对数第一次注射后的周数小鸡编号024＊681＜1.73.24.44.14.72＜1.73.84.44.14.73＜1.73.2＞4.74.74.74＜1.74.4＞4.7＞4.7＞4.75＜1.74.4＞4.7＞4.7＞4.7＊加强注射
C.对繁育小鸡的母鸡接种将20周龄繁育小鸡的母鸡(Euribrid，Boxmeer，Netherlands)分成每组8只的两组，通过肌肉注射的方式分别注 ml按实施例2B和2C制备的疫苗。第一次注射6周之后，用同样的疫苗对应地进行加强注射。从表4可看出，在繁育小鸡的母鸡血清中大量产生抗体，同时伴随着抗体向卵黄和孵出的小鸡的血清中转移。
表4给20周龄繁育小鸡的母鸡接种后抗体的产生在繁育母鸡的血清、卵黄以及孵出小鸡的血清中ELISA滴度(±SD)的平均对数从菌株纯繁育小鸡的卵黄2)孵出小鸡的化的菌毛母鸡血清1)血清3)CH4(02∶K1∶H-)4.58±0.505.29±0.393.98±0.27AM1727-pPIL291-155.48±0.215.14±0.474.16±0.391)第一次注射后10周收集的血清样品2)第一次注射11周收集的8个卵的平均值3)第一次注射12周后从卵孵出的5个一周龄小鸡的平均值。
用CH4菌株和AM1727-pPIL291-15克隆的F11菌毛接种，也得到相同的结果。在酶联免疫吸附检测中发现这两个制品之间发生完全交叉反应。
实施例4通过给繁育小鸡的母鸡接种而保护小鸡用自AM1727-pPIL291-15克隆纯化的F11菌毛(见实施例3C)接种于繁育小鸡的母鸡。
从这些已接种繁殖母鸡和非接种对照母鸡孵出的小鸡，在3周龄时通过向其右后胸肺泡注射0.2ml细菌悬浮液而进行攻击。所使用的细菌株都是自患有大肠杆菌病的小鸡的受损心脏分离的。将其在血琼脂基质板(Oxoid
)上培养过夜，悬浮于PBS中至适当浓度。小鸡关在随意摄取食物和水的减压隔离器中。
如表5所示，良好的保护作用从接种过的繁殖母鸡转移至孵出的小鸡。与未接种的对照相比，对所有菌株放在一起来说，用F11菌毛接种的保护效力为85%。
令人惊奇的是，这种保护作用也能够抗CH7菌株攻击，而这种菌株在体外似乎不表达F11菌毛。这可能是因为，该菌株实际上在体内表达了F11菌毛，而在体外时的表达低于所用方法能够检测的限度。
表5自接种了F11菌毛的繁育母鸡孵出的小鸡的抗大肠杆菌攻击的保护作用
1)对每一菌株的血清型，F11表达以及攻击剂量都有表示2)在攻击后7天内死亡的小鸡数/总攻击数3)卡方试验P＜0.0001
实施例5通过被动免疫保护小鸡通过用纯化的F11菌毛接种兔子，然后在56℃灭活30分钟而制备出抗血清。
通过静脉将1ml这种未稀释的F11抗血清注射给三周龄的小鸡(Euribeid，Boxmeer，Netherlands)。
在用抗血清进行静脉注射后1小时内，通过向右后胸肺泡注射0.2ml细菌悬浮液而感染小鸡。在对照中，用同样剂量的细菌感染投与抗血清的小鸡。所用的细菌全是从患有大肠杆菌病的小鸡的受损心脏分离的。将细菌在血琼脂基质板(Oxoid )上培养一夜，然后悬浮于PBS中，且稀释至适当浓度。
小鸡是关在随意摄取食物和水的减压隔离器中。
从这些实验可明显看出，F11菌毛抗血清为小鸡提供了良好的保护作用，它能够抗用于感染的6个大肠杆菌菌株的5个(表6)。抗CH6菌株感染的保护作用非常低，尽管安也产生F11菌毛。可能是由于该菌株除产生F11菌毛外，还产生一种或多种其他强力毒性因子。但也可能是由于产生的抗体水平太低，不能达到抗该细菌株的保护作用。
一个令人惊奇的性质是，甚至达到了抗CH7菌株的显著保护作用，而该菌株本身似乎不产生任何F11菌毛。这可能是由于该菌株在体内实际上产生了F11菌毛，但在体外产生的F11菌毛浓度对所用检测方法来说太低。
表6通过用F11菌毛抗血清进行被动免疫而产生抗大肠杆菌感染小鸡的保护作用感染菌株的代号血清型剂量投与抗-感染后7天p＜0.05＊F11抗内死亡的小血清鸡数/总数CH2078∶K80∶H4∶F11+5×10+2/17+CH25×10-15/17CH502∶K1∶H7∶F11+10+0/8+CH510-6/9CH601∶K1∶H-∶F11+10+13/24CH610-19/29CH7015∶K14∶H10∶F11-2×10+1/8CH72×10-6/9CH245035∶K-∶H？∶F11+5×10+2/17CH2455×10-11/19＊卡方试验
权利要求
1.保护家禽抗大肠杆菌败血症的疫苗，其特征在于所说的疫苗含有F11型菌毛，或其致免疫部分，或者是具有遗传物质的生物体，这些遗传物质为所说的菌毛或其致免疫部分的产生以及选择性分泌编码。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所说的疫苗含有致免疫多肽(如所提到的致免疫部分)，该多肽具有与F11菌毛亚单位蛋白质的氨基致序列的一部分相对应的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所说的疫苗也含有一种佐剂。
4.保护家禽抗大肠杆菌败血症的成分，以所述疫苗为特征，含有抗F11型的菌毛或其部分或其聚集物的抗体。
5.保护家禽抗大肠杆菌败血症的方法，其特征是投与如权利要求1-3的一种疫苗或权利要求4的一种成分。
6.F11型的菌毛、其致免疫部分或具有遗传物质(为所说的菌毛或其致免疫部分的产生，以及选择性分泌编码)的生物体在生产一种有效地保护家禽抵抗大肠杆菌败血症的疫苗中的用途。
全文摘要
本发明涉及一些有效地保护家禽抵抗大肠杆菌败血症的疫苗，它们含有F11型菌毛或其致免疫部分，或能够引起F11菌毛及其免疫部分的产生，或含有抗这些物质的抗体。
文档编号A61P31/04GK1033008SQ8810735
公开日1989年5月24日 申请日期1988年10月25日 优先权日1987年10月26日
发明者约翰·弗兰西斯科·凡登布什 申请人:阿克佐公司