专利名称：：由未加工褐藻类的脱氧半乳聚糖制得的多糖硫酸盐，抗凝血剂和抗互补剂，及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及溶解由褐藻类(褐藻门)提取的脱氧半乳聚糖而得到的新的多糖硫酸盐，本发明还涉及它的制备方法，以及新的抗凝血剂和抗凝血酶剂，和新的抗互补剂。其抗凝血作用定义为在血浆中抑制生成活性凝血酶，而抗凝血酶作用定义为抑制生成血栓和/或血栓的生长。实际中使用最多的抗凝血药物是肝素，肝素是一种由葡糖胺单元和葡糖醛酸在1-4位连接所组成的多糖硫酸盐，其中硫酸基团处于葡糖胺的胺官能团上和/或葡糖胺和糖醛酸的醇官能团上。肝素起着血凝结作用，同时协同增强两种血浆抑制剂的抗凝血作用。第一种抑制剂是抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)，它同时起凝血酶(以因子Ⅱa名称同样为人们所熟知)和活化因子X(或因子Xa)的作用;称作肝素的第二辅助因子(HCⅡ)的第二种抑制剂以因子Ⅱa而不以因子Xa起作用。另外，有关防止血栓形成，人们越来越多地使用由解聚作用得到的低分子量的肝素，它的总血凝结作用不大，例如，它们离体在接近卵磷脂高岭上(TCK)时间不起任何作用，这可用内生的方法以总的方式研究血浆的凝结作用，也就是说除因子Ⅶ和血小板因子之外的整个血浆因子;相反地，低分子量肝素能在体内防止试验性的血栓形成。亦已表明，与因子Xa相比，它们能协同增强ATⅢ的抑制活性，并且它们的活性与因子Ⅱa相比要弱。然而，似乎越来越可能由它们很小的残余抗Ⅱa活性在防止血栓形成方面发挥其显著作用。肝素的抗互补性质同样也是公知的。补体系统是一种血浆或膜蛋白质整体，其蛋白质整体在免疫防护机制中起重要作用。它参与机体防护(破坏感染物、消除免疫络合物)，还参与炎症类的病理过程。在血液中它还负责溶血或红血球的溶解。在血清中已发现呈失活状的补体蛋白质，根据两种程序(交替法与经典法)的一定顺序对它们进行活化。其交替法的活化基于认识靶(细菌、病毒、寄生虫、肿瘤细胞)表面的非特定机制。经典法的活化基于由抗体特定认识靶。在交替法中，起始相由C3劈裂产物(C3b)固定和释放C3a(引起炎症反应的过敏毒素)而开始，C3b也通过与该表面的羟基和胺共价连接而固定。连结后，它可固定因子B，并在因子D活化因子B之后，生成交替转化酶。对于经典法来说，起始相由活化C1开始，C1进行活化主要与抗原一抗体络合物相适应。在C1活化后，组分C4和C2在它们周围被活化，在其表面生成酶络合物(C3经典转化酶)。C4活化与C3活化类似，放出C4b和C4a。C4b以共价方式与C3b相同类型的化学基团被固定。肝素通过它与C3转化酶的相互作用起着补体活化抑制剂的作用。亦已表明，这种肝素的抗互补活性与它的抗凝血酶活性是完全无关的，并且这种抗互补活性与胺官能团上硫酸基或乙酰基存在有关，这一点与抗凝血的活性相反，如果胺官能团上的取代基不是硫酸基团，则观察不到抗血凝活性，还表明在糖醛酸的醇官能团上有硫酸基对抗互补活性起着重要的作用(Kazatchine等人，J.Clin.Invest.;67(1981))。其他多糖的抗凝血和/或抗凝血酶性质也是公知的，例如，关于硫酸软骨素B盐的抗凝血活性，与肝素的抗凝血活性相比，它是很小的，但是其抗凝血酶的活性是相当的。它们由于辅助因子HCⅡ的抑制作用的协同增强作用在抑制凝血酶方面起作用;相反地，它们并不由辅助因子ATⅢ的中间体起作用，并且对因子Xa无作用。在防止血栓生成时大量使用的戊聚糖多硫酸盐，在由HCⅡ催化抑制凝血酶方面同样起作用。相反地，这些多糖不具有与肝素的抗互补活性可以相比的这种活性;在前面引用的出版物中，Kazatchine等人指出硫酸软骨素B盐中半乳糖胺之胺官能团被已酰化，而糖醛酸的醇官能团则没有硫酸化，这种硫酸软骨素B盐的活性在这方面比肝素低14倍。脱氧半乳聚糖是硫酸化的多糖，平均分子量高(100-800KDa)，是由褐藻门菌体提取的，是可能含有D-木糖、D-半乳糖和糖醛酸的α-1，2-L-岩藻糖-4-硫酸盐聚合物。与肝素的糖醛酸相反，脱氧半乳聚糖的糖醛酸没有硫酸化。另外，肝素和硫酸软骨素B盐都具有不同的脱氧半乳聚糖，但它们都不含氨基-糖。对未加工的脱氧半乳聚糖进行处理，可由同样的未经加工的提取物分离出不同的脱氧半乳聚糖亚群，一方面同它们的平均分子量，另一方面用它们的物理化学性质将一部分与另一部分区分开来。事实上，使用不使脱氧半乳聚糖分子的多糖骨架降解的非腐蚀性的分极分离方法进行这种处理，证明天然的脱氧半乳聚糖亚群的存在。未经加工的脱氧半乳聚糖的抗凝血性质已于1957年由Springer等人证明，并且自此以许多其他作者也予以证实(Bernardi和Springer，TheJournalofBiologicalChemisfry，237.1(1962);Mori等人，MarineAlageinPharmaceuticalscience，2，1982)。根据未加工脱氧半乳聚糖对凝血作用的机制，发明人进行的研究证明未加工的脱氧半乳聚糖延长脑磷脂高岭土时间(TCK)，尤其是凝血酶的时间(TT)(它探测在凝血酶的影响下纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝块，凝血作用的最后相)。该研究还证明，未加工的脱氧半乳聚糖通过凝血酶准排他地起作用，主要在于抑制剂HCⅡ的协同增效作用(在与肝素相同浓度的条件下)，以及抗凝血酶Ⅲ的协同增效作用(其浓度高于肝素浓度的30倍)。相反地，与肝素相比，脱氧半乳聚糖没有任何的抗-Xa的活性。其他作用也作了类似的观察(Church等人，TheJournalofBiologicalChemistry;264.6(1989))，他们也研究了未加工脱氧半乳聚糖的性质。这些作者进一步证明未加工的脱氧半乳聚糖对ATⅢ抑制凝血酶的催化作用很弱，对HCⅡ抑制凝血酶的催化作用很强。那么脱氧半乳聚糖构成了一种独创的抗凝血的药物种类，而它们的作用机制与已知的抗凝血剂的作用是不同的。事实上，它们协同增强HCⅡ的抑制活性，对于凝血酶它们也协同增强ATⅢ的抑制活性，这与硫酸软骨素B盐不同，后者专门协同增强HCⅡ的抑制活性。相反地，脱氧半乳聚糖，如同硫酸软骨素B盐并与肝素相反，对因子Xa的抑制作用没有任何的影响;它们是凝血酶的专一抑制剂。本发明人还以意料不到的方式证明脱氧半乳聚糖，尽管它们不含(与肝素相反)氨基糖和糖醛酸O-硫酸酯，但它们具有抑制补体活化的性质。补体活化抑制剂在防止排斥移植物现象中起作用，其也用于肾渗析与心肌梗塞恢复期治疗。对于抑制体外循环装置中补体的活化作用也可利用抗互补活性。尽管它们的抗凝血性质已知道多年，但未加工的脱氧半乳聚糖还未用于治疗，一方面是因为它们的残留的蛋白质含量相当高，这很可能导致免疫现象，另一方面是因为它的分子量高，这造成溶解度低，于是大大限制它们在高浓度下的应用。然而，直到现在研究工作都是根据脱氧半乳聚糖的抗血凝作用进行的，尤其是涉及由分离未加工脱氧半乳聚糖而得到各种亚群脱氧半乳聚糖的抗凝血活性，这些研究工作认为其抗凝血活性与大分子的脱氧半乳聚糖正好相关联。某些研究小组得出结论，抗凝血活性与高分子量相关(Usui等人，Agr.Biol.Chem.，44-8(1980))。其他研究工作商定证明存在下限20KDa，低于该下限任何有意义的抗凝血活性都未观察到。例如，英国专利890207已描述得到七种不同的组分，其分子量在5-50000之间排列，它是由未加工脱氧半乳聚糖在乙醇中分步沉淀得到的。根据该专利，在这些组分中，分子量超过20000的单单一个组分具有有意义的抗血凝活性。Nishino等人(CarbohydrateResearch，186(1989)，119-129)研究过由非降解脱氧半乳聚糖得到的组分的抗血凝性质，同样证明该下限为20KDa;另外，在他们发表的文章中叙述的经纯化的组分作用机制与对未经加工的脱氧半乳聚糖所描述的不一样，虽然如同后者，因为在血凝酶的情况下比在因子Xa的情况下似乎更能使它们活化，它们的作用主要表现出与血凝作用的总机制相应，这表现为脑磷脂高岭土时间(TCK)的延长;相反地，它们只对血凝酶时间很少的影响，并且与血凝作用的最后相相适应，那么表现出活化较差。那么，看来直到那时由非降解分离未加工脱氧半乳聚糖而得到作的多糖亚群，是一种亚群到另一亚群不稳定血凝作用，并且可能是(似乎是)在未加工脱氧半乳聚糖情况下所观察到的情况不一样;另一方面，直到现在由进行的研究工作得到分子量低于20KDa的组分，这时它们的溶解度是特别有利的，这些低分子量组分对血凝作用几乎是无活性的。本发明人提出假设，在使未加工脱氧半乳聚多糖长链断裂时，有可能得到低分子量的组分;然而，脱氧半乳聚糖分子的多糖骨架断裂需要使用溶解法，由于引起它们性能的消失，因此这种方法必须能控制脱氧半聚糖不能过分降解。从这个意义上来讲，已经进行的试验还不能制定出降解脱氧半乳聚糖，得到中等分子量组分的方法，事实上，所使用的方法或者达到不充分降解，得到的组分的分子量超过40KDa，或者近于全部降解，得到的组分缺乏抗凝血的活性(V.Colliec等人，IvemesJourneesd′hemostadwsetdethromlose，Paris，Mars1988)，(Fischer等人，InternationalCongressonthrombosis(Athens)，Mai，1988)，(Colliec等人，PolymersinMedicine，Varsovie，Octobre1988)。因此，本发明的目的在于，由褐藻门的脱氧半乳聚糖经溶解而得到分子量相当低的多糖组分;本发明的目的还在于提供特别有意义的抗凝血剂和抗凝血酶剂，它们的活性表现为因子Ⅱa的抑制作用，并且它们不具有抗Xa活性，还由于高分子量和未加工脱氧半乳聚糖的残余蛋白质含量高而没有第二作用，另外，它是由褐藻门制得的，而褐藻门是很容易大量使用的原料。本发明的目的还在于提供一种由褐藻属的脱氧半乳聚糖得到的新抗互补剂。本发明的内容在于由褐藻类的脱氧半乳聚糖制得多糖硫酸盐，其特征在于与多糖标准相比，由凝胶过滤测定它们的分子量高于5KDa而低于40KDa，还在于多糖硫酸盐的硫含量高于原来脱氧半乳聚糖的含量，多糖硫酸盐中蛋白质杂质含量低于0.15%，它们比原来脱氧半乳聚糖溶解度更大，并且有抗凝血和抗凝血酶性质。本发明的多糖硫酸盐能由褐藻属提取的未加工的脱氧半乳聚糖经溶解而制得。根据本发明多糖硫酸盐的优选实施方式，它们的平均分子量低于或等于20KDa。根据本发明多糖硫酸盐的另外优选实施方式，它们的平均分子量是在20-35KDa之间。根据本发明多糖硫酸盐同样的优选实施方式，它们的硫含量比原始脱氧半乳聚糖含量高2-20%。根据该实施方式的特别有利的方案，由Fucusvesiculosus提取的脱氯半乳聚糖经酸解而得到多糖硫酸盐，其硫的含量比原始脱氧半乳聚糖高约15-20%，蛋白质含量则低0.05%。根据该实施方式的另一特别有利的方案，由Ascophyllumnodosum提取的脱氧半乳聚糖经酸解而得到多糖硫酸盐，其硫的含量比原始脱氧半乳聚糖高约2-5%，其蛋白质含量低于0.05%。根据该实施方式的另一个特别有利的方案，由Pelvetiacanalicculata提取的脱氧半乳聚糖经酸解而得到多糖硫酸盐，其硫的含量比原始脱氧半乳聚糖高约15-20%，其蛋白质含量低于0.05%。根据该实施方式的另一个特别有利的方案，由Undariapinnatifida提取的脱氧半乳聚糖经酸解而得到多糖硫酸盐，其硫的含量比原始脱氧半乳聚糖高约10-15%，其蛋白质含量低于0.05%。本发明人论证了离体和体内本发明多糖硫酸盐都同时具有抗凝血和抗凝血酶的性质。与Nishinu等人描述的低分子量多糖亚群相反，本发明的多糖，与血凝作用的最后相适应而起重要作用。本
发明内容还在于像体内一样，离体也有很好活性的抗凝血与抗凝血酶剂、辅助因子HCⅡ和ATⅢ活化剂，其特征在于，它至少含有如前面定义的一种多糖硫酸盐。另外，本发明的内容还在于制备如前面定义的多糖硫酸盐的方法，其特征在于，由褐藻类得到的未加工的脱氧半乳聚糖进行溶解，其特征还在于，用凝胶过滤分离所得到的溶解产物，其特征还在于，回收分子量高于5而低于40KDa的组分。根据本发明方式优选的实施方式，由酸解进行脱氧半乳聚糖的溶解。根据本实施方式特别有利的方案，酸解是用0.5-1NH2SO4于温度40-50℃进行1-4小时。根据本发明方法优选的另一种实施方式，脱氧半乳聚糖溶解可由辐射法进行，让脱氧半乳聚糖受到辐射，特别是r射线的辐射。根据本发明方法另一种优选实施方式，用酶解法溶解脱氧半乳聚糖。该实施方式包含至少一种酶(如α-1-2-岩藻糖苷酶)能断裂脱氧半乳聚糖的含有碳和氢的骨架;酶的混合物，例如它们由海洋软体动物的消化液或由海洋软体动物制得的消化液，或者还有降解海藻的细菌中含有的酶所组成，这些酶的混合物也可以使用。根据本发明方法另一种优选实施方式，可用物理方法，尤其可用声处理方法溶解脱氧半乳聚糖。根据本发明方法的一种有利的实施方式，所回收的组分的分子量低于或等于20KDa。本发明多糖硫酸盐的分子量允许其多糖硫酸盐在血浆中与注射液中有溶解作用，甚至在高浓度也是如此。另外，与本加工的脱氧半乳聚糖相比，它含有蛋白质百分含量低。因此有可能利用这些产品作为人体的药品。这种产品在本发明多糖硫酸盐抗凝血酶的性质的某些应用是特别有利的，尤其在抗凝血酶皮下注射防止静脉血栓形成方面的应用更有利。这种应用要求使用相当浓的溶液，这对于有未分离的脱氧半乳聚糖是不可能的。同样可以想你用口服与皮下注射都可使用本发明的多糖硫酸盐。由脱氧半乳聚糖得到的分子量为5-100KDa的组分，还具有抗互补活性，其活性与未分离的脱氧半乳聚糖的活性相等或超过。那么，本发明还有一个内容在于补体活化抑制剂，其特征在于它含有由褐藻类和/或它们的组分提取的脱氧半乳聚糖。根据本发明的补体活化抑制剂的优选实施方式，它包含由褐藻类提取的脱氧半乳聚糖得到的分子量超过50KDa的组分。根据本发明补体活化抑制剂的优选实施方式，它包含平均分子量为5-50KDa的组分，其组分是由褐藻类提取的脱氧半乳聚糖制得的。根据本发明补体活化抑制剂的另一个优选实施方式，它包含如前面所定义的多糖硫酸盐。本发明还包含有下面要叙述的补体助剂，并可参看由不同褐藻门提取的脱氧半乳聚糖制备本发明的多糖硫酸盐实施例，还包含这些多糖活性的论证。然而，很明显，这些实例只是说明本发明的目的，并不以任何方式构成一种限制。Ⅰ、本发明多糖硫酸盐组分的制备实例1脱氧半乳聚糖的分离与制备出的组分的纯化A)由褐藻门提取脱氧半乳聚糖用经典的有机提取方法由褐藻门的菌体部分物料提取脱氧半乳聚糖。该方法是由Black等人的方法(J.sci.FoodAgric(1952))衍生而来的。提取方案可概述如下其菌体在含5%(重量)甲醇的纯乙醇溶液中研磨。所得研磨物经第一次用含5%(重量)甲醇的95%乙醇提取，然后用丙酮/甲苯＝2∶1(体积/体积)混合物进行第二次提取。在烘箱烘干以后，所得物料再用含2%(重量)CaCl2的0.01MHCl进行一次或多次提取。在用苏打中和之后，在N-十六烷基吡啶氯化物中处理酸性提取物，前者与脱氧半乳聚糖最多的硫酸盐生成络合物，并因此能使该制剂浓缩在该硫酸盐中。制得的沉淀再溶于3MCaCl2溶液中，然后冻干。B)提取的脱氧半乳聚糖第一步粗提取物的降解a)用酸解法酸提取物以10mg/ml溶于1NH2SO4溶液中，并将温度固定在45℃。在脱氧半乳聚糖完全降解之前，加入苏打(1MNaOH)使用粘度测定法连续降解(Ubbelohde型粘度计的流出毛细管直径为0.5mm)中止。在降解过程中，每隔30分钟计算降低的比粘度(ηspec./c)。降解的酸提取物溶液浓缩、使用边界极限为1000道尔顿的膜超过滤，最后冻干。b)辐射用60000C600Ci源辐照进行辐射化学分解。未加工的脱氧半乳聚糖以2081rad/分剂量率于室温下辐射92小时，对于所有试样其辐照剂量为11.5Mrads。C)酶降解用鲍(Haliotistuberculata)消化液和海兔(Aplysiacalifornica)消化液的未加工提取物，酶降解Pelvetiacanaliculata未加工提取物按如下进行将未加工的脱氧半乳聚糖溶于柠檬酸盐磷酸盐缓冲液中，其浓度为10mg/ml;PH5.8(柠檬酸＝0.1MC6H8O7，磷酸氢二钠＝Na2HPO4·2H2O，0.2M)脱氧半乳聚糖溶液加热到37℃，在整个时间里加入200μl消化提取液以保证活性酶的浓度恒定。接着用粘度测定法降解，计算不同提取时降低的比粘度(ηsp)/c。加入0.2MNa2CO3溶液使该反应停止。第二步制备分离已降解的未加工提取物a)实验室规模将5ml0.2MNaCl并含有500mg干冻物的溶液放入分离凝胶柱(柱高35-45cm，直径4.8cm，SephacryS-200或S-300)。线流速为3.33cm/小时。用差示折射计和UV检测器于280nm在柱出口进行双次测定。用多糖标样校准该柱。用双路记录仪记录其信号。色谱研究之后在柱出口得到的不同镏分(5ml)合并成3或4份，每份经浓缩、在边界极限为10000道尔顿的膜上超过滤部分作为第一份边界极限为1000道尔顿的膜上部分为另一份，并冻干。b)中间试验规模将125ml0.2MNaCl溶液有30克冻干物放到SephacrylS-200柱上(柱高60cm×直径11.3cm)，线流速为15cm/小时。用差示折射仪和UV检测器于280mm在柱出口进行双次测定。用双路记录仪记录其信号。色谱研究之后，在其柱出口收集得到的不同镏分(30ml)合并成3或4份，每份经浓缩、在这界极限为10000道尔顿的膜上超过滤部分为第一份，而边界极限为1000道尔顿的膜上部分为第二份，并冻干。图1表示凝胶SephacrylS-200(分离范围250×103-5×103道尔顿)制备分离用1NH2SO4于45℃降解脱氧半乳聚糖的酸提取物Al＝第1份(PM＞20KDa);A2＝第2份(20KDa＞PM＞10KDa);A3＝第3份(PM＜10KDa);Vm＝死体积，Vt＝总体积。虚线曲线(┈)表示由差示折射法测定的淋出物质的量。实线曲线(-)表示由UV吸收(于280mm)测得的蛋白质的量。实例2制取的馏分物理化学馏定红外光谱图2是由Fucnsvesiculosus壁提取的未加工脱氧半乳聚糖(2a)的红外光谱，和由这种酸提取物经酸解而得到的平均分子量为13×103馏分A2(2b)的红外光谱。于1240cm-1峰是磺酰基的特征峰。于850cm-1峰表明硫酸基团大多数处于L-岩藻糖C4上;然而一部分这种硫酸基团处于C6，如图于820cm-1肩部所示。大部分羧基官能团呈非编合的形式，如图于1720cm-1峰所示，与此相比在1420cm-1肩部弱峰是缔合形式的羧基官能团。分子量的测定用液体高效分析色谱(HPLC)测定脱氧半乳聚糖馏分的分子量(g/mol)，其柱为Si-Dio1500(分离范围5000-106道尔顿)，注入量为50μl标准多糖(PullulanedesLaboratoiresPotymerLaboratooriesLtd.)或所研究的脱氧半乳聚糖馏分，其浓度为在0.2MNaCl中2mg/ml，流量为1ml/分，用折射仪进行测定。收集其色谱图，再用具有GPC程序的微处理机进行分析(可渗透凝胶立体排除色谱)，Chromafographied′exclusionsteriguesurgelpeameable)，其结果在打字机上记录下来。S和N的含量脱氧半乳聚糖馏分中S和N的含量用元素分析法以%(以纯产品重量计)给出。蛋白质的含量蛋白质的含量是以牛蛋白作参比用Bradford比色法以%(按纯产品重量计)估算的。表Ⅰ对未加工的脱氧半乳聚糖的物理化学性质，即未分离的酸提取物(EA)的物理化学性质，与本发明的多糖硫酸盐的物理化学性质能进行比较，其多糖硫酸盐是以四种褐藻门(Ascophyllumnodosum(An)、Fucusresiculosus(Fr)、Pelretiacanaliculata(Pc)、Undariapinnatifida(Up))提取的粗脱氧半乳聚糖经酸解而得到的A2馏分为代表。表Ⅰ表Ⅱ对未分离的酸提取物的物理化学性质与本发明的多糖硫酸盐的物理化学性质之间能进行比较，其多糖硫酸盐是以三种褐藻门(Ascophyllumnodosum(An)、Fucusvesiculosus(Fr)、Pelvetiacanaliculata(Pc))的脱氧半乳聚糖经辐解而得到的馏分A2为代表。表Ⅱ</tables>Ⅱ、未加工脱氧半乳聚糖生物活性与由溶解其物而得到的馏分的生物活性之间的比较实例3离体抗凝血活性非降解的脱氧半乳聚糖的抗凝血活性与分子量为10-20KDa的已降解脱氧半乳聚糖馏分的抗凝血活性可用卵磷脂-高岭土(TCK)时间评定。其活性由下述关系式以每毫克产品国际单位(UI/mg)给出(与脱氧半乳聚糖馏分相关的直线斜率/与标准肝素相关的直线斜率)X标准肝素的活性(UI/mg，laboratoiresCHOAY的肝素H108)。其斜率是由凝血时间(以秒计)对数与以抗凝血剂的浓度为函数所得到的直线而计算出的(肝素浓度为0.5-1μg/ml血浆，脱氧半乳聚糖的浓度为10-50μg/ml)。表Ⅲ可对酸提取物(EA)的抗凝血活性(或未加工脱氧半乳聚糖的抗凝血活性)与褐藻门(Ascophyllumnodosum(An)、Fucusvesiculosus(Fv)、Pelvetiacanaliculata(Pc)和Undariapinnatifida(Up))A2馏分(由酸解得到)的抗凝血活性之间进行比较。表Ⅲ抗凝血活化，UI/mgEA(An)4.5A2(An)6.6EA(Fv)5.0A2(Fv)5.8EA(Pc)4.0A2(Pc)2.0EA(Up)-A2(Up)1.3＊以标准肝素H108，其活性为173UI/mg为参比测定抗凝血活性。表Ⅳ可更准确地分析本发明的多糖硫酸盐的抗凝血作用，同时可以根据馏分A2与肝素的奎克时间(TQ，LetempsdeQuick)、卵磷脂高岭土时间(TCK)、凝血酶时间(TT)以及毒蛇凝血酶时间(TR)对各这表明本发明的多糖硫酸盐对凝血酶时间很灵敏。实例4体内的抗凝血活性，本发明多糖硫酸盐对血凝结作用参数的影响使用雄兔评价本发明多糖馏分的抗凝血的活性。将按照实例1中描述的酸解法制备平均分子量为15000Da的馏分注射剂3Kg雄兔中。在规定的时间间隔从雄兔中取血，并测定抽取血的凝血酶时间(TT)和卵磷脂高岭土时间(TCK)以评定血凝结的参数。表V表明注射0.5ml、浓度为100mg/ml、40mg/ml、30mg/ml的本发明多糖硫酸盐(由酸解得到的Ascopyllumnodosum馏分A2)，与作为对比注射浓度为2mg/ml肝素之后，其血凝结参数随时间的变化关系。实例5体内抗凝血酶活性，实验血栓生长1、操作方式使用的实验血栓模型是雄兔身上的Wessler和Hauptmann模型(StanfordWessler，StanleyM.Reimer和MindelC.Sheps-J.Appl.Physiol(1959)14P943-946)，这里使用因子Xa(J.Hauptmann，B.Kaiser，F.Markwardt和G.Nouak，Thromb.Haemo-stairsStuttg.43(1980)P118-123)作血栓生成清除剂。如实例1所叙述的、用未加工的脱氧半乳聚糖酸解所得到的平均分子量为20000±2000的多糖馏分进行实验。在诱导血栓生成前10分钟，以0.150、0.625、1.25、2.5和5mg/Kg剂量作静脉注射，每个剂量用5只雄兔试验。用对数递减法测定抗凝血的DE50(有效剂量50，相应于生成的血栓重量减少50%时的剂量)，表明平均值为0.40mg/Kg(在0.23-0.66mg/Kg之间)。刚出现静脉囊就作静脉内注射，其后10分钟抽取血液。每个剂量所得平均结果汇于表Ⅵ。a)卵磷脂高岭土时间b)凝血酶时间c)奎克时间这些结果证实离体观察的结果和实例3和表Ⅳ所列出的结果。本表还列出接受试验血栓生成方案但只收回馏分A2溶剂的实验对照雄兔的观察结果。表Ⅶ列出剂量为0.15、0.625、1.25和5mg/Kg时在相反一侧静脉中提取的潮湿血栓的平均重量。实例6测定脱氧半乳聚糖及其馏分的总抗互补活性抗互补活性以CH50(溶血补体50)剂量在脱氧半乳聚糖存在或不存在下测定。这个试验是测定能引起一定数量的绵羊红血球有50%溶解的最少量立刻可回收的人体血清，其绵羊红血球是由雄兔抗体以最佳方式使绵羊红抗球蛋白敏化的(ES＝敏化红细胞)。补体系统的标准血管的蛋白质识别这些红血球作为外来成分，并且对于对这些红血球的反应由相继劈裂而被活化，这就引起该蛋白质的溶解。有可能测定聚合物的抑制性质，如肝素或脱氧半乳聚糖，同时定量确定聚合物存在下CH50。其抑制能力由以每毫升人体血清的聚合物毫克数表示的浓度确定，其人体血清稀释到1/4倍，它能抑制50%细胞溶解，同时确定细胞溶解同聚合物浓度函数关系的剂量、反应曲线。溶解越小，则聚合物的抗互补活性越重要。为测定脱氧半乳聚糖的抗互补活性，曾使用酸提取物(未加工的脱氧半乳聚糖)以及由所述未加工的脱氧半乳聚糖酸解而得到的不同分子量的馏分。其实验条件如下50μl纯SHN(标准的人体血清)与50μl不同浓度(0.2-0.5mg/ml)的脱氧半乳聚糖混合，在37℃培育30分钟后，加入4900μl标准VBS++，得到溶液A。另一方面，将0.3-0.8ml标准VBS++混入0-0.5ml溶液A，得到总体积为0.8ml，再将0.2ml敏化红血球混入该混合物。在37℃培育45分钟后，其混合物在1300g和4℃下离心10分钟，再于414nm读出DO。标准VBS++的组成NaCl42.5g巴比酮(二乙基-巴比妥钠盐)1.875g二乙基-巴比妥类酸2.85g蒸馏水qsp1000ml其PH调整到7.4，将此溶液20ml混入80ml蒸馏水中添加0.5ml0.03MCaCl2和0.5ml0.01MMgCl2所得结果列于表Ⅷ(第二栏)。脱氧半乳聚糖的馏分活性比在相同条件分析的肝素H108高3-100倍。这些活性与抗凝血活性无关。表Ⅷ馏分DI50DI50DI50(CH50)C3aC4amg/mlmg/mlmg/mlEAAn0.035-0.160.14A1An0.260.070A2An1-1.370.100.11A3An0.200.1750.024A1Pc0.036A2Pc0.60A2Fv1.95A2Up1.26肝素40.150.05还表明，未加工的脱氧半乳聚糖以及平均分子量为5-100KDa的馏分完全抑制补体的活化，并且其抗互补活性超过肝素的抗互补活性，事实上，使用肝素的情况下，4mg/ml聚合物才抑制50%溶解细胞，而要达到同样的效果，只使用0.035-1.95mg/ml(根据平均分子量)未加工的或经分离的脱氧半乳聚糖。还观察到，如实例1描述的方法制备的平均分子量为18000KDa馏分抑制50%细胞溶解，其浓度为1.3mg/ml，而平均分子量为5-10KDa的馏分，抑制50%细胞溶解，其浓度为0.2mg/ml。实例7由放射免疫分析法测定C3a和C4a由放射免疫分析法测定C3a和C4a由放射免疫分析定量测定上清液中活化过程流体相的自由蛋白质C3a和C4a的浓度。用放射免疫分析箱C3a-desarg125I按下述方法进行分析。50μl纯SHN经Sephadex活化，与50μl标准VBS++和100μl不同浓度(0.1-5mg/ml)的脱氧半乳聚糖混合，其混合物在37℃培养30分钟，然后在1700g条件下离心5分钟。提取160μl上清液，再往里加入10μlEDTA(8.66×10-2m)(它阻止补体的活化)，然后是170μl沉淀剂(随分析箱一起配备的);在室温下培养5分钟后，其混合物在10000克条件下离心2分钟，其上清液在RIA定量测定前应稀释(1/4-1/512)。标准活性(DT50)表示为在1mlSHN(稀释到1/4倍)中正常产生的C3a量，抑制其中50%所需要的脱氧半乳聚糖的量。这个抑制剂量以脱氧半乳聚糖毫克数/SHN稀释到1/4倍的毫升数来表示。其结果列于表Ⅷ(第3栏)。在稀释到1/4倍的SHN中，0.21mg/mlA2(An)溶液能使C3的活化作用减少到SHN自生的活化作用以下。另外，0.5mg同样的馏分足以完全抑制在1ml经稀释到1/4倍的SHN中所含有的C3的活化作用，并且其C3受到活化剂(Sephadex，它在15mg/ml浓度下使补体完全活化)作用，其活化剂的量高于补体完全活化所必需的量。表Ⅷ也列出与C4a有关的结果(第4栏)。如前面所述，以最清楚方式所描述的实施方式，实例和应用毫不限制本发明，相反，只要不离开也不超出本发明的范围，本发明还包含技术人员构思的其他所有变型。权利要求1.由褐藻类提取的脱氧半乳聚糖制备多糖硫酸盐，其特征在于，与多糖标准相比，由凝胶过滤测定它们的分子量超过5KDa而低于40KDa，其特征还在于，它们硫的含量超过原始脱氧半乳聚糖的含量，其特征也在于，它们含有的蛋白质杂质低于0.15%，并且比原始脱氧半乳聚糖更易溶，以及具有抗凝血和抗凝血酶的性质。2.根据权利要求1的多糖硫酸盐，其特征在于，它们能由褐藻类提取的未加工的脱氧半乳聚糖经溶解而得到。3.根据权利要求1或2中任何一个权利要求所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们的平均分子量低于或等于20KDa。4.根据权利要求1或2中任何一个权利要求所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们的平均分子量在20KDa与35KDa之间。5.根据权利要求1至4中任何一个权利要求所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们硫的含量比原始脱氧半乳聚糖高2-20%。6.根据权利要求5所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们是由Fucusvesiculosus提取的脱氧半乳聚糖经酸解而制得的，其特征还在于，它们硫含量比原始脱氧半乳聚糖的含量高约15-20%，以及它们的蛋白质含量低于0.05%。7.根据权利要求5所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们是由Ascophyllumnodosum提取的脱氧半乳聚糖经酸解制得，其特征还在于，它们的硫含量比原始脱氧半乳聚糖高约2-5%，以及它们的蛋白质含量低于0.05%。8.根据权利要求5所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们是由PelvetiaCanaliculata提取的脱氧半乳聚糖经酸解而制得的，其特征还在于，它们的硫含量比原始脱氧半乳聚糖高约15%-20%，以及它们的蛋白质含量低于0.05%。9.根据权利要求5所述的多糖硫酸盐，其特征在于，它们是由Undariapinnatifida提取的脱氧半乳聚糖经酸解而制得的，其特征还在于，它们的硫含量比原始脱氧半乳聚糖高约10%-15%，以及它们的蛋白质含量低于0.05%。10.根据权利要求1-9中任何一个权利要求，离体或体内活性抗凝血剂和抗凝血酶剂，辅助因子HCⅡ和ATⅢ的活化剂，其特征在于，它含有至少一种多糖硫酸盐。11.根据权利要求2所述的多糖硫酸盐的制备方法，其特征在于，由褐藻类得到的未加工脱氧半乳聚糖进行溶解，其特征还在于，用凝胶过滤分离得到的溶解物，以及回收分子量高于5KDa而低于40KDa馏分。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，用酸解法溶解脱氧半乳聚糖。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，酸解是用0.5N-1NH2SO4于温度40-50℃下作用1-4小时。14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，用辐射法溶解脱氧半乳聚糖，使脱氧半乳聚糖受到辐射作用，尤其是用r射线辐射。15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，用酶解法溶解脱氧半乳聚糖。16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，用物理方法，尤其是声处理方法溶解脱氧半乳聚糖。17.根据权利要求11-16中任何一个权利要求所述的方法，其特征在于，回收的分子量低于或等于20KDa的馏分。18.补体活化作用的抑制剂，其特征在于，它含有褐藻类提取的脱氧半乳聚糖和/或它们的馏分。19.根据权利要求18所述的补体活化作用的抑制剂，其特征在于，它含有由褐藻类提取的脱氧半乳聚糖而制得的，分子量高于50KDa的馏分。20.根据权利要求18所述的补体活化作用的抑制剂，其特征在于，它含有由褐藻类提取的脱氧半乳聚糖而制得的、平均分子量为5-50KDa的馏分。21.根据权利要求1-9中任何一个权利要求所述的补体活化作用抑制剂，其特征在于，它含有多糖硫酸盐。全文摘要由褐藻类提取的脱氧半乳聚糖制备多糖硫酸盐，其特征在于，与多糖标准相比，由凝胶过滤测定它们的分子量超过5KDa而低于40KDa，其特征还在于，它们硫的含量超过原始脱氧半乳聚糖的含量，其特征也在于，它们含有的蛋白质杂质低于0.15％，并且比原始脱氧半乳聚糖更易溶。以及具有抗凝血和抗凝血酶的性质。文档编号A61K31/737GK1051564SQ9010492公开日1991年5月22日申请日期1990年6月13日优先权日1989年6月14日发明者西尔维娅·库里斯,亚库林·布里陶迪尔,帕里克·杜兰德,安尼-马里·菲沙,亚库林·约瑟福维茨,伯纳德·克劳里,凯瑟里·维达尔申请人:依福来梅海洋勘探研究院