专利名称：用作钙通路阻滞剂的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及存在棚蛛属aperta蜘蛛毒液中的多肽并涉及具有与所述的多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的活性的多肽。这些多肽和它们的可做药用的盐可阻滞在细胞中包括各种组织(包括无脊椎动物和脊椎动物的各种组织)的神经原细胞和肌肉细胞中的钙通路。本发明也涉及在细胞中(如在一种器官的神经和肌肉系统本身的细胞中)阻滞钙通路时;在处理由乳动物钙通路引起的疾病或状态时;以及在抑制无脊椎动物害虫中应用所说的多肽和它们的盐。另外，本发明还涉及含有所说的多肽和它们的盐的组合物。
已经有棚蛛属aperta蜘蛛的毒液中含有至少两种能影响钙流通的毒素的报告(Jackson，H.，等人，Soc.Neu.Sci.Abstr.121078，1987)。其作者公开了一种在文献中称为AG2的毒素，它的分子量低于1，000道尔顿，看来可在组织的一个大的范围内抑制钙流通。此外，Jackson，H，等人(Soc.Neu.Sci.Abstr.12730，1986)报告了含有由棚蛛属aperta取得的、其组分的分子量约为6，000的另一种毒素。据报告，这种毒素影响突触前阻滞的传递并提示毒素阻滞钙通路伴随着神经传递质的释放。
在1989年4月28日提出的编号为07/346，181的美国专利申请公开了所发现的存在于棚蛛属aperta蜘蛛的毒液中的某些多肽，在此申请中公开了这些多肽是作为在细胞中的钙通路阻滞剂，并叙述了所发现的以下成分
成份G氨基末端的氨基酸序列包括H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-；根据FAB MS整个多肽的分子量为7267成份HH2N-ala-cys-val-gly-glu-asn-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-arg-asn-asn-asn-CONH2；根据FAB MS整个多肽的分子量为4198成份H氨基末端的氨基酸序列包括H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-pro-lys-gly-his-phe-thr-gly-glu-；根据FAB MS整个多肽的分子量为5494成份I
H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2；FABMS:4158.
成份J氨基末端的氨基酸顺序包括H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-thr-his-pro-asp-asp-ala-；根据FAB MS整个多肽的分子量为5505成份K氨基末端的氨基酸顺序包括H2N-glu-asp-asn-cys-ile-ala-glu-asp-tyr-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys-cys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg-cys-ser-met-ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-ser-phe-ala-CONH2；FABMS:5274.
成份L氨基末端的氨基酸顺序包括H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asP-；整个多肽的分子量约为20，000成分L具有下述鉴别特性的多肽
(a)存在于一种得自棚蛛属aperta蜘蛛粗毒液的成分中，该成份是应用C-18 Vydac 22mm×250mm，300 孔径，10μ粒度的柱，应用一种应用5%→20% B，95%→80% A〔0→30分钟〕然后是20%→70% B，80%→30% A〔30→55分钟〕的线性梯度程序的溶剂系统(其中A是0.1%TFA水溶液和B是乙腈)流速为3.5ml/分钟约用43分钟洗脱出;和(b)存在于上述在(a)中所述的成份的一种成份中，该成分是应用C-18 Vydac 10mm×250mm，300 孔径，5μ粒度的柱，应用一种应用25%→40% B，75%→60% A〔0→30分钟〕的线性梯度程序的溶剂系统(其中A是三氟乙酸而B是乙腈)流速为3.5ml/分钟，约用22.5分钟洗脱出。
成份M一种氨基末端氨基酸序列包括H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-set-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-；整个多肽大约的分子量，约为80，000为作钙拮抗物的化合物具有多种用途。钙拮抗物可临床应用于治疗疾病如咽峡炎、高血压、心肌病、室上的心律不齐、aesophogeal弛缓不能、早产、尤其是雷诺氏病。参阅W.G.Nayler，钙拮抗剂，Acadimic Press，Harcourt Brace Javanovich Publishers，New York，NY1988，之中所述在此已收入作参考。再者，在研究细胞(如神经原和肌肉细胞)的生理学中和在抑制无脊椎动物害虫中，这些化合物是有用的。
本发明涉及发现存在于棚蛛属aperta蜘蛛的毒液中的多肽。本发明的多肽和根据本发明在其中存在的成分如下成分Q;
(a)存在于未自棚蛛属aperta蜘蛛粗毒液的成分，它从C-18 Vydac 22mm×250mm，300 孔度，10μ粒度的柱中，应用15ml/分钟流速和一种应用5%→20% B〔0→30分钟〕然后为20%→70% B〔30→55分钟〕线性梯度程序的一种溶剂系统(其中A是0.1%的三氟乙酸(TFA)水溶液而B是乙腈)，约用41.5分钟洗脱出;
(b)存在于上述(a)中所述的成份中的一种成分，它从C-18 Vydac 10mm×250mm，300 孔度，5μ粒度的柱中用3.5ml/分钟的流速和一种应用70% A，30% B的均等效率系统(isocratic system)的溶剂系统，(其中A是0.1% TFA水溶液而B是乙腈)用7.5分钟洗脱出;
(c)一种氨基末端的氨基酸序列包括H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
本发明的多肽在细胞中阻滞钙通路。因此，所说的多肽在细胞本身中阻滞钙通路有效，所说的多肽在控制无脊椎动物的害虫方面和在处理于细胞中由钙通路功能引起的哺乳动物疾病和健康状态也是有效的。
属于本发明的范围内的还有具有与以上所述的多肽基本上相同的氨基酸序列和具有与以上所述的多肽基本上相同的钙通路阻滞活性的多肽。
通过根据本专业技术人员所熟知的标准方法用电刺激抽取的方法，从棚蛛属aperta蜘蛛取得毒液、所用的较好方法是一种防止污染由腹部流出的或血液的全毒液的方法。这些方法对于本专业的技术人员是熟知的。将如此得到的全毒液在约-78℃的冰冻状态下贮存直到用于如下所述的纯化作用为止。
得自全毒液的组份的纯化作用是在多种制备型和半制备型的柱如C-4和C-18 Vydac 柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Woburn Massachusetts 01801)上的逆相高效液体色谱完成的。峰检测是单色地在220-230nm处进行。液分的进一步分析可用例如以一种Waters 990二极管阵列检测器(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)收集的多色紫外光数据来完成。用已知的方法例如通过用一种ISCO/“FOXY”液分收集器和一种ISCO 2159峰检测器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)来收集来自色谱柱的液份。将液份收集在适当大小的容器如无菌的聚乙烯实验室器皿中。然后用冻干法蒸发洗提液再用冻干法蒸发水份以实现液分的浓缩作用。然后可用一种有梯度系统的分析柱进行色谱分析以测定所得到的组成成分的纯度，这种梯度系统比在液分最后的纯化作用中所应用的系统更具有均等效率。
由各个成分所包含的结构可根据已知的方析方法如质谱法和核磁共振法来测定。根据已知的方法将成分Q的多肽定序。例如在研究时多肽的胱氨酸残基的S-吡啶基乙基化可在溶液中进行，然后进行多肽的氨基酸定序。下面是用于S-吡啶乙基化作用的一种方法。将1至10μg多肽溶解或稀释在50μl缓冲溶液中，该缓冲液由1份含有4mM EDTA，pH8.5的1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液和3份8M的盐酸奎尼定混合而成。然后，加入2.5μl 10%2-巯基乙醇水溶液，再将此混合物于室温，在黑暗下并在氩气氛中培育两小时。在培育之后再加入2μl 4-乙烯基吡啶(在-20℃及氩气下贮存的新鲜试剂)，并将此混合物在室温及氩气氛下于黑暗中下再培育两小时。然后将此混合物脱盐，较好是用一短的逆相色谱柱。然后根据已知的方法将此回复成烷基化的多肽定序。
在实施本发明并应用上面综述的一般步骤时，已发现适合于初步分离毒液的柱是C-18 Vydac 22mm×250MM、300 孔度、10μ粒度的柱，洗脱这种柱应用的流速是15ml/min、应用95%→80% A，5%→20% B〔0→30分钟〕然后是80%→30% A，20%→70% B〔30→55分钟〕的线性梯度程序其中A是0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液和B是乙腈。各部分就是用如上所述的方法收集的。将如此得到的标示为Q的一个部分，选出作进一步的纯化作用。成分Q的洗脱时间约为41.5分钟。
应用C-18 Vydac 10mm×250mm、300 孔度5.0μ粒度的柱并应用70%的0.1% TFA水溶液、30%乙腈的均等效率系统以7.5ml/分钟的流速进一步纯化成分Q。如以上所述收集各个部分，成分Q约在7.5分钟洗脱，并已发现约在8.3分钟洗脱的部分含有在编号为07/346，181的美国专利申请中所叙述的多肽作为K成分。
成分Q包含一种多肽，这种多肽所具有的氨基末端氨基酸序列包括H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
假使在此公开了有关存在于得自棚蛛属aperta的毒液的Q部分中的化合物有好处的话，现在有可能不用通过从全毒液中分离/纯化的方法得到所说的化合物。应用重组体DNA技术通过用于所说的多肽或它的各部分的编码序列的克隆可生产出本发明的多肽。例如根据本专业技术人员所熟知的方法，可应用采用了现有已知所说的多肽的氨基酸序列信息优点的杂化探查物以克隆整个多肽的编码序列。将重组体DNA技术与在体外的蛋白质合成作用相结合也可用于生产本发明的多肽。这些在体外的合成蛋白质的方法包括(但并不限于)应用一种采用了本专业熟练的技术人员熟知的标准Merrifield化学原理或其他的固相化学原理的ABI430A固相肽合成器(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，California 94404)。
在技术上已熟知某些氨基酸的取代作用可在多肽中完成而不影响或不在实质上影响所说的多肽的功能。有可能发生的恰当的取代作用随多肽之间的转变而变化。可允许的取代作用的确定是根据本专业的技术人员所熟知的方法来实现的。因此，所有基本上具有相同的氨基酸序列的和基本上具有相同的钙通路阻塞活性的所有多肽都属于本发明的范围。
具有不可逆地阻滞钙通路的本发明的多肽存在于多种细胞中如在无脊椎动物和脊椎动物的神经和肌肉系统的细胞中。
本发明的多肽的阻滞钙通路的能力可由以下的方法显示出来。小脑的颗粒细胞是用8天大的大鼠脑制成的(Wilkin，G.P.等人，Brain Res115181-199，1976)。将Aclar的方形物(1cm)(Proplastics Inc.，5033 Industrial Ave.，Wall，N.J.，07719)用聚-L-赖氨酸包裹并放在12-穴的盘中，其中含有1ml Eagles Basal培养基。将细胞分离并将含6.25×10细胞的各等分加到含有Aclar的方形物的各穴中。浸覆24小时后，加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(终浓度为10μM)。在培养了6、7和8天的时后将这些细胞用作fura2分析。将这些连接到Aclar方形物上的细胞转移到装有1ml在HEPES缓冲液(含有0.01%牛血清白蛋白、0.01%右旋糖，pH7.4，无镁)中的2μMfura2/AM(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR，97402)。在37℃将这些细胞培育40分钟，移去含有缓冲液的fura2/AM并以1ml 无fura2/AM的同一种缓冲液取代之。在一个石英小杯中加入2.0ml预热(37℃)的缓冲液。将在Aclar方形物上的细胞放入小杯中，将小杯插入一装在磁搅拌器的恒温(37℃)容器中并用萤光分光光度计(Biochemical Instrunent Group，University of Pennsylvania)测定其萤光。使萤光信号保持稳定约2分钟。然后将所研究的化合物在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)所配成的贮备液5-20μl以适当的浓度加小杯中。在完成每次试验时应用Nemeth等人，J.Biol.Chem.2625188(1987)已确定的方法校准萤光信号和进行fura2/AM渗漏修正，最大萤光值(Fmax)由加入ionomycin(35μm)来测定而最小萤光值(Fmin)由后来加入EDTA(12μmM)与钙螯合来测定。使用上述方法在加入主题化合物时萤光的降低显示出发生了由主题化合物引起的钙通路阻塞。
本发明的化合物作为在细胞本身的钙通路阻滞剂是有效的。正因如此，这些化合物在防治无脊椎有害动物时和在处理动物细胞由于钙通路功能引起的疾病和健康状况如咽峡炎、高血压心肌病、室上的心律不齐，aesophogenl弛缓不能、早产和雷诺氏病时是有效的。再者，在细胞(包括神经系统的和肌肉系统的细胞，但并不限于这些细胞)的生理研究中也有用。
也属于本发明的范围之内的是可作药用的本发明的多肽的盐。这些盐是应用本专业技术人员熟悉的方法制成的。例如可根据常规的方法制成这些多肽与碱成的盐。
在将本发明的一种多肽施用于一种哺乳动物时，根据标准的药物实践可以单独施用或与可用于药物的载体或稀释剂混合成药物组合物施用。可将这些多肽以口服的或非肠道的形式施用而对于多肽则以非肠道途径施用较好。非肠道施用包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下的和局部的施用。
将本发明的多肽用于口服时，可将这种化合物以片剂或胶囊剂，或者以水溶液或悬浮液的形式施用。在口服的片剂施用的情况下，通常使用的载体包括乳糖、玉米淀粉，通常加入的润滑剂为硬脂酸镁。如以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂是乳糖和干的玉米淀粉。当需用口服用的水悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如有需要时，可加入某些甜味剂和/或香味剂。
在用于肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内时通常制备成活性成份的无菌溶液，而溶液的pH应适当地调节和缓冲。用于静脉时，应控制溶质总浓度成为等渗制剂。
在将本发明的多肽及其盐用于人类时，通常的日剂量由医嘱决定。而且，剂量将根据年龄、体重和个别病人的反应、以及病人症状的严重程度和施用的具体化合物的潜能而改变。
在将本发明的多肽及其盐用于防治无脊椎害虫时，可将所说的多肽直接施用于所说的无脊椎动物或施用于所说的无脊椎害虫的环境中。例如，可将本发明的一种化合物的溶液喷布于所说的无脊椎动物上。用于防治所说的脊椎动物所必需的化合物量将根据无脊椎动物和环境条件而改变并将由施用该化合物的人决定。
在将本发明的多肽或其盐用于细胞的生理研究时，是根据本专业熟练的技术人员所熟知的方法将所说的多肽施用于细胞，例如，可将所说的多肽施用于在适当的生理缓冲液中的细胞。用于这些研究的本发明的化合物的适当浓度是100μM。然而，用于这些研究的所说的多肽的浓度可以大于或小于100μM。施用该化合物的量将根据已熟知的方法由本专业熟练的技术人员决定。
以下的实例是作说明用而不能认为是对本发明范围的限制。
实例1棚蛛属aperta的全毒液的初步分离将得自天然产物科学公司(Natural Product Sciences Inc.，Salt Lake City Uath 84108)已在约-78℃在冰冻状态下贮存过的棚蛛属aperta的全毒液解冻并取出10至60μl稀释至200μl，然后装到C-18 Vydac (22mm×250mm，300 孔径，10μ粒度)柱上应用5%→20% B，95%→80% A〔0→30分钟〕然后为20%→70% B，80%→30% A〔30→55分钟〕的线性梯度程序的溶剂系统(其中A是0.1% TFA水溶液而B是乙腈)并以流速为15ml/分进行洗脱。用单色在220-230nm处进行峰检测，并用ISCO/“FOXY”液份收集器及ISCO 2159峰检测器收集各液分。各液分是在20分钟至60分钟中内收集。液分Q的收集时间是约41.5分钟。
实例2液分Q的细分离和其中的结构测定将得自所述的实例1的液份Q装于C-18 Vydac (10mm×250mm，300 孔径，5μ粒径)柱上，以流速为3.5ml/分钟用70%A、30%B的均等效能的溶剂系统(其中A是0.1% TFA水溶液而B是乙腈)从其中洗提。用一Water 990二极阵列检测器来完成峰检测、按实例1所述来完成液分的收集，得到下列两种液分。
液分 洗提时间Q 约7.5分钟K 约8.3分钟然后根据已熟知的方法先冻干蒸发洗提液再冻干蒸发水份来制成含有多肽的液份Q和K以用于定序。
根据制造商的说明书应用Waters Pico-Tag方法完成对液份Q和K的烷基化多肽的氨基酸分析。从应用生物系统公司型号为407A的蛋白质/肽定序器(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，California 94404)和TFA水溶液常规收集定序数据。使用应用生物系统公司型号为120A PTH的分析器对所得到的乙内酰苯硫脲氨基酸直接完成分析或不直接完成分析则在DuPont Zorbax PTH柱(Biomedical Product Depontment，Chromatography Products，E.I.duPont de Nemours and Co.，Inc.，1007 Market Street，Wilmington，Delaware 19898)上进行。
作为氨基酸分析的一个结果测定出的含于液份Q的多肽的氨基末端氨基酸顺序如下
H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-.
作为氨基酸分析的一个结果，也测定了含有上述液分K的多肽的液分K，并公开于美国专利申请编号07/346，181的文献中。
权利要求
1.一种制备基本上纯的多肽的方法，这种多肽具有以下的鉴别特征(a)存在于得自棚蛛属aperta蜘蛛的粗毒液的一种成分中，该成分是从C-18Vydac 22mm×250mm、300 孔度、10μ粒度的柱应用15ml/分钟的流速和一种应用5%→20%B，95%→80%A
然后为20%→70%B，80%→30%A[30→55分钟]的线性梯度程序的溶剂系统(其中A是0.1%三氟乙酸水溶液而B是乙腈)洗脱出的，洗脱时间约为41.5分钟；(b)存在于在上述(a)所述的成分中的一种成分中，该成分是从C-18Vydac 10mm×250mm，300 孔度、5μ粒度的柱应用3.5ml/分钟流速和一种20%A、30%B的均等效率溶液系统(其中A是0.1%三氟乙酸水溶液而B是乙腈)洗脱出的，洗脱时间约为7.5分钟洗；和(c)氨基末端氨基酸顺序包括H2N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr-gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys-arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu-gly-leu-；一种具有与所说的多肽和它的可作药用的盐类的氨基酸顺序基本上相同和钙通路阻滞活性基本上相同的多肽，该方法的特征在于将棚蛛属aperta蜘蛛的全毒液从C-18Vydac 22mm×250mm、300 孔径、10μ粒度的柱应用15ml/分钟的流速和一种应用5%→20%乙腈、95%→80%的0.1三氟乙酸水溶液
然后是20%→70%乙腈、80%→30%的0.1%三氟乙酸水溶液[30→55分钟]的线性梯度程序的溶剂系统洗脱出而单色的峰检测则在220-230nm，收集约41.5分钟洗提出的液分，将它装到C-18Vydac 10mm×250mm、300 孔度、5μ粒度柱上并用3.5ml/分钟的流速和一种70%的0.1%三氟乙酸水溶液和30%乙腈的均等效率溶剂系统洗脱而峰的检测则在220-230nm处，收集约7.5分钟洗提出的液份并任意选择地冻干，再悬浮于水中和冻干这种液份；或者，用另一种办法，即用本身已知的方法合成所说的肽；并在需要具有基本上与所说的肽有相同的氨基酸顺序的肽时，用本身已知的方法合成这种肽或这些肽；和任意选择地用本身已知的方法将所说明的肽转化成它们的可作药用的盐。
全文摘要
本发明涉及发现存在于棚蛛属aperta蜘蛛毒液中的多肽并涉及具有与所说的多肽基本上相同的氨基酸顺序和基本上相同活性的多肽。本发明的多肽和它们的盐类在多种器官的细胞中阻滞钙通路并对在细胞本身中阻滞所说的钙通路；在处理由钙通路引起的疾病、状态和在控制无脊椎动物害虫时有用。本发明也涉及包括所说的肽和它们的盐类的组合物。
文档编号A61P3/14GK1051182SQ9010813
公开日1991年5月8日 申请日期1990年9月28日 优先权日1989年9月29日
发明者道格拉斯·菲利普斯, 尼古拉斯·A·萨科曼诺, 罗伯特·A·沃尔克曼 申请人:美国辉瑞有限公司, 自然产品科学有限公司