专利名称：细胞密度信号分子的鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生长及分化功能的治疗和调节。特别是涉及由成纤维细胞(如腱细胞)产生的细胞密度信号分子，识别这些分子的抗体，以及这些分子在治疗和修复结缔组织损伤中以及在调节细胞增殖中的应用。
溶胶原(procollagen)表达的水平、培养物中某些成纤维细胞的分化功能，都是处在几种环境因子之调节下的，其中之一就是细胞密度。早在60年代初，研究人员就已观察到胶原蛋白产生量的增加依赖于细胞密度的增大;但尽管经过了很长时间，迄今有关允许细胞识别其邻近成员之存在，并将这一信息转译成增加胶原蛋白合成量的信号发生机制仍所知甚少。
当置于细胞培养物中时，大多数在体内自然表达溶胶原的细胞会渐渐失去这一能力。然而，当在允许高水平表达溶胶原的细胞培养环境中生长时，初级鸟腱细胞(PAT)则可保留高水平表达溶胶原的能力，就这一点来说，也证明了其对细胞培养密度的敏感性。PAT细胞溶胶原生产能力的增加(从占总蛋白质合成量的不足10%增加到大约50%)，与细胞密度有直接关系(如参见Schwarz，R.I.and M.J.Bissell，Pro.Nat.Acad.Sci.(1977)744453-4457)。
培养中的细胞的增殖能力也受细胞密度的影响。但是，因为细胞增殖受许多细胞培养参数的影响，而细胞密度只是其中之一，所以很难弄清确切的相互关系。
例如，很难将密度本身的影响同细胞密度改变是细胞营养需求之子集合这一可能性区分开来。相似地，当细胞上复盖细胞外基质时会使之减少对生长因子的利用，可以解释细胞密度效应。已显示改变培养基足可以刺激细胞分裂。甚至振荡细胞上方的培养基也能刺激细胞分裂(Stoker，M.and D.Piggott，Cell(1974)3207-215)。
如根据脱落到培养基中的膜成分可抑制细胞增殖这一事实所证明的，细胞接触也起到一定的作用。
因此，一方面是细胞密度与细胞增殖之间的相互关系，另一方面是细胞密度与分化功能的表达(在PAT细胞的情况下是溶胶原基因的表达)间相互关系，已成了很难于设计明确的实验来证实的复杂问题。
尽管这样，仍有一些出版物描述了据称可影响密度依赖性细胞生长的蛋白质。例如Harel，L.，et al.，J.Cell.Physiol.(1984)119101-106;Harel，L.，et al.，J.，Cell.Physiol.(1985)123139-143;Blat，C.，et al.，J.Cell.Physiol.(1987)130416-419中已描述了从小鼠3T3细胞中分离的40-45KD密度依赖性生长抑制因子(缩写为IPF-45)。
Lipkin，G.等人(Cancer Res.(1978)38635-643)和Fass，E.等人(J.Invest.Dermitol.(1986)87309-312)描述了一种从仓鼠黑色素细胞中分离的接触抑制因子，它能使密度依赖性生长达到黑素瘤细胞生长的程度。
Yaoi，Y和K.Motohashi(GANN Monograph on Cancer Res.(1980)2529-39)介绍了一种从鸡胚成纤维细胞之细胞表面上分离的低分子量(6-8KD)生长抑制因子。
本发明公开了一种本质为蛋白质的细胞密度信号分子，其表现分子量为至少25KD到至多35KD且最好为大约30KD，该分子1)首先在培养中与PAT细胞的细胞外基质结合;2)短暂地刺激这些细胞的增殖;3)进而刺激溶胶原基因表达。
现已找到了一种蛋白质细胞密度信号(CDS)分子。CDS能够暂时刺激培养中的成纤维细胞的增殖，进而促进分化的基因表达。CDS可以由成纤维细胞如腱细胞分泌，并可在没有这些细胞的情况下得到。必要时可进一步纯化之。
这种新的多肽是由成纤维细胞如腱细胞分泌的，并为细胞自身调节其增殖和分化功能的表达提供了一种工具。CDS和其抗体对于诊断和治疗结缔组织特别是肌腱的损伤及病变有着重要价值。
更具体地说，天然存在的鸟CDS是一种分子量为25-35KD的生长多肽，它是由培养的初级鸟(鸡)腱细胞表达的，据信它可以很快结合到由这些细胞产生的细胞外基质(ECM)上。据信这种快速结合可限制CDS的扩散，并因而利于限制这种分子的细胞增殖效应。
有时，当CDS结合到ECM上之后，尚可发生某些目前尚不明瞭的过程，以致使CDS的活性发生改变，并变为对溶胶原的表达、鸟腱细胞的分化功能有刺激活性。
经缓慢搅拌腱细胞培养物，从中收获CDS。这一处理方法可由细胞层除去大部分CDS，且经过如此处理的细胞表现降低了溶胶原的表达水平。当将所收获的CDS加回静止的腱细胞培养物中时，其可显示出生长刺激活性。这种令人惊奇的和独特的性质-即由腱细胞培养物中除去后再加入该培养物中便呈现生长刺激活性-是鉴别这种多肽的一大特征。
发现按上述方法收获的CDS在培养基中是作为多分子复合物存在的，其表现分子量至少在30KD以上，通常大于60KD，更常见的是大约100KD。在用二硫键裂解剂如DTT处理后，可鉴定出大约30KD的CDS单体分子。
本发明的一个方面涉及分离、纯化天然产生的CDS，及其仍保留CDS生物学特性的片段、突变及修饰形式。
本发明的另一方面涉及对CDS特异的抗体。
本发明的再一个方面是得到、分离和纯化CDS的方法。
本发明的再一个方面是使用CDS治疗结缔组织特别是肌腱之损伤和疾病的方法。
图1显示对初级鸟腱细胞之蛋白质的层析分离结果。实线箭头表示DTT处理前的CDS活性分布范围，虚线箭头表示DTT处理后CDS活性的分布范围。
图2是用放射活性氨基酸标记12小时后，细胞高和低分子量部分之SDS-PAGE的放射照相图谱。泳道A是DTT处理后＞30KD的部分;泳道B是＜30KD的部分。凝胶对放射敏感胶片曝光1个月，由此证明泳道B中不存在其他标记的带。
Ⅰ、定义“自生的”是指衍生于同一个体、衍生于来自一个个体的细胞培养物、衍生于多个纯系个体，或衍生于得自多个纯系个体的培养物。
“分化基因表达”或“分化功能”的表达是涉及结构基因的转录和翻译，而不是与细胞分裂或存活性相关联的概念。如此表达的多肽使分化的细胞呈现与不成熟细胞或“胚”细胞完全不同的特征。
“细胞外基质”(ECM)是细胞赖以在其上或其内生存的大分子网络。细胞基质包括但不只限于胶原蛋白、Laminin、fibronectin、葡糖氨基聚糖、蛋白聚糖等。在体内，ECM是由基质内细胞或外周细胞产生的，并且是基质组织的必要部分。在培养物中，许多类型的细胞为表达适当的分化特性均需要ECM。
“功能上同源的”是指表现出相同功能特征的蛋白质分子。例如，从一个种的生物得到的酶与从另一个种生物得到酶均能催化同一反应，则它们是功能上同源的。因此，如果得自不同种的蛋白质CDS分子对培养的相应生性成纤维细胞的生长和分化功能表现出相同的双亲调节作用，则它们就应是功能上同源的。
“多肽”包括天然产生的多肽，及其保留天然存在之多肽的生物学活性的所有片段、其缺失、加入、取代、突变及修饰产物。糖基化或另外修饰的多肽也包括在本文所述多肽的范围内，并且更具体地是指蛋白聚糖、糖肽或糖蛋白。蛋白质分子即包括了多肽。
“细胞的初级培养物”得自体内组织并且是未经传代的。原则可根据核型的保留(所说的核型基本上相同于由其中得到培养物之组织中的核型)，以及细胞对环境变换的反应(这些反应基本上相似于体内反应)，将初级培养物同细胞株及已确定的培养物区分开。
“非补给性基本生长培养基”是一种没有添加血清或其他生长补充剂的细胞培养物生长培养基。
Ⅱ、完成本发明的方式已知培养的正常细胞通过改变其增殖速度及其蛋白质表达模式而对细胞密度起反应。得自鸡胚的初级鸟腱(PAT)细胞仍是一个恰当的例证，在高细胞浓度时其溶胶原产率增加大约10倍，而增殖速率则接近零。在本申请中，已显示有关细胞增殖和溶胶原表达的信号发生机制具有与表现SDS凝胶迁移大小约为25KD至35KD的蛋白质分子密切相关的特性。
这种称为细胞密度信号(CDS)的分子是由成纤维细胞产生的，并可以由这些细胞培养物的培养基中分离到。为此，一般说来，可按下述方法制得CDS分子a)制备得自动物如鸟类和哺乳动物细胞，包括得自这些来源之胚胎细胞的，包括腱细胞的成纤维细胞培养物;
b)在适当的环境条件下，如37-42℃、高湿度及较高CO2浓度条件下，在添加了抗坏血酸盐和血清的组织培养基如F-12培养基中培养1至5天，以使初级培养物达到高细胞浓度;
c)从培养的细胞中除去细胞生长培养基，并换成适于以高密度维持细胞生长的培养基;
d)搅动培养的细胞并至少过1天，较好过2-6天加入培养基，以利于CDS从细胞内释放到培养基中;
e)将培养基和释放的CDS同细胞分离开;
f)用沉淀和离心、凝胶过滤、膜超滤等方法浓缩培养基中的CDS和其他蛋白质;
g)分级分离CDS和其他蛋白质，以除去低分子量污染物并保留被30KD排阻滤膜保留的呈复合形式的高分子量CDS;
h)用还原剂处理保留的复合物，以释放出25-35KD CDS的材料;以及i)使上述材料通过一个标准的30KD滤膜或类似分离装置以作为25-35KD材料分离得到CDS。
如此分离的CDS由分子大小约25-35KD的多肽组成，特别是由根据SDS-PAGE分析，并与已知蛋白质标准品比较，其大小约为30KD的多肽组成。其生物学活性特征在于，它最初能够刺激培养的胚腱细胞，其后再促进分化功能的表达(即溶胶原基因表达)。其他特征表现在对热(90℃)稳定性，对pH和DTT以及胰蛋白酶处理的稳定性，以及对Tris离子不稳定，对链霉蛋白酶和蛋白酶K敏感。
CDS由培养的细胞分离之后即与细胞外基质相结合。然而如上所述，经搅动细胞培养物可使之由ECM进入培养基中。这种作用只有在高培养基对细胞比例条件下才能刺激细胞增殖(可能在该条件下使重新结合作用达到最小程度)。反之，在有足够细胞使CDS相对培养基有高浓度的条件下，搅动培养物的影响就很小，这可能是由于此时重新结合的几率高。这就表明CDS是作为生长抑制因子而发挥作用的。
另一方面，当加入具有高培养基对细胞比例的细胞群体时，经搅动会合培养物上方的培养基使之条件化，则培养基的活即为刺激性的。此外，PAT细胞不会长入没有其他细胞的区域，但会伸入到有中等细胞密度的区域。这些观察可得出相反的结论，即CDS是生长刺激因子。利用条件培养基的生长促进活性作为选择的基础，显示CDS具有独特的物理学特性。该多肽对热、pH和DTT稳定(保留原有活性的75%以上)，但对Tris离子的失活作用敏感(不到原有活性的40%)。CDS对胰蛋白酶有抗性，但对链霉蛋白酶和蛋白酶K敏感。经凝胶排阻层析，显示其分子量大于100KD;但经DTT处理后，其迁移率相当于30KD，同时仍保留其生物学活性。标记过夜后，基于这一迁移率进行简单的分级分离可得到单一的放射标记带，其相当于进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(见凝胶分析)时出现的分子量约30KD的带。
加入CDS或除去CDS(连续搅拌到大体积培养基中)会产生同样的生长刺激性细胞反应，据信这是由于CDS具有依赖于其呈现于细胞的不同活性。CDS在条件培养基中是一种细胞基质结合的聚集体，并以这种形式作为生长刺激因子。然而，一旦结合在细胞外基质中，CDS便可与其自身或与某些此前未知的因子形成复合物，然后发挥生长抑制剂作用并可作为溶胶原产生的诱导剂。
A、培养物中初级鸟腱细胞的生长用改进的Dehm，P和D.J.Pockop方法(Biochem.Biophys.Acta.(1971)240358-369)从16天鸡胚中分离PAT。除特别规定者外，细胞均接种于25cm2组织培养瓶中，并在添加0.2%胎牛血清和50μg/ml抗坏血酸盐的F12培养基(Schwarz et al.，1979)中培养。
当需要大的培养基对细胞比例时，可将加在没有血清之培养基中的细胞(104个)接种到置于标准组织培养皿(直径60mm)中的玻璃克隆环(内径6mm)内。在克隆环的外面添加培养基以平衡流体静压。1小时后，当细胞附着时，除去克隆环。将培养基换成添加了0.2%胎牛血清(Gibco)和50μg/ml抗坏血酸的F12培养基(5ml)。发现在这些条件下，在有较高CO2浓度(3×碳酸氨酸，15%CO2)时培养效果更好些。从而，所有细胞均以较高浓度生长。在有正常培养基对细胞比例条件下生长的细胞并不受较高CO2浓度的影响。
B、CDS纯化将高细胞密度培养物上的含0.2%血清的生长培养基换成基本培养基(150cm2培养瓶加以6mlF12)，并于39℃下轻轻振荡(旋转振荡器，60rpm)1小时。这一操作每天进行两次，其进行4天。无细胞条件培养基于4℃下保存(可稳定保存数月)。
加入硫酸铵，达到40-60%，最好50%饱和度(4℃)并放置过夜。然后以35，000rpm离心30分钟(45Ti转子，Beckman)。将沉淀物重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并经超滤(30KD排阻滤膜，CX-30;Millipore)浓缩之。将终浓度调到相当于原培养基体积100倍的浓度。稀释1倍，得到与原条件培养基相等的生长刺激活性。
37℃下用10mMDTT(二硫苏糖醇)将浓缩物处理30分钟。然后使之再次通过30KD超滤膜(PF-30，Millipore)。超滤物保留了原培养基的大约一半的生物学活性。
为了标记CDS，在生长培养基中用1mCi放射活性氨基酸将细胞(25cm2培养瓶，5ml)标记过夜。除去标记的培养基并加入基本培养基(1ml)然后按上述方法振荡培养。无须进行铵盐沉淀，而将培养基浓缩并用PBS稀释几倍，以降低未掺入之标记物的水平。最后，将其浓缩到100μl并按上述方法用DTT处理。30KD超滤后，将滤出物和滞留物加于SDS-PAGE凝胶(3%堆积胶，15%分离胶)上。用Enhance(NEN)浸没凝胶并于-70℃下对X射线胶片曝光。
C、对溶胶原基因表达的估计常常使用原位杂交法作为基于特异mRNA的存在从混合细胞群中鉴定某些细胞的方法。这一技术可用于定量证明细胞密度改变对个别细胞中溶胶原mRNA量的影响。这一技术可以最为直接并较明确地检测细胞密度与分化基因表达(对于PAT细胞来说，即为溶胶原表达)间的关系。
用加在PBS中的40%多聚甲醛固定PAT细胞(10分钟)，然后用加在PBS中的0.1M甘氨酸洗涤。固定后，用2ml杂交溶液(60%去离子化的甲酰胺、0.1MPIPES pH6.4、0.4MNaCl、5%polyA RNA[2.5mg/ml])包被细胞。于55℃预杂交几小时后，改变杂交溶液，加入标记的探针并使细胞杂交48小时。除特别指出外，标记时均使用比活性为3.3×107cpm/μg的2×106cpm的标记探针。
杂交后，细胞用加在2×SSC中的0.1%TritonX-100于55℃洗两次，各1小时;然后用加在0.1×SSC中的0.1%TritonX-100于60℃洗两次，各1小时。细胞经无水乙醇洗涤而脱水，然后用感光乳剂(NBT2，Kodak)包被。显影时间根据探针的比活性而异。就上述标准比活性而言，曝光时间为2周。几次早期实验使用了比活性高两倍的探针(用3H-ATP和3H-UTP标记)，曝光时间相应地短至1周。细胞用瑞特氏液染色。
在定量检测已杂交之3H-RNA探针的实验中，使用1%SDS溶解细胞层并使用闪烁计数器检测放射活性水平。
用点印迹杂交的同样方法(本领域技术人员已知的方法)处理固定的细胞杂交溶液的体积以毫升(ml)计;除预杂交外，不作其他预处理;杂交后洗涤中只使用盐和去污剂溶液。
对提取的mRNA进行点印迹杂交，以前Rowe，L.B.和R.I.Schwarz曾证明(Mol.and Cell.Biol.(1983)3241-249)，抗坏血酸盐处理可使PAT细胞培养物中溶胶原mRNA产生量约增加5倍。对抗坏血酸盐诱导和未诱导的细胞进行原位点印迹杂交，同样观察到RNA增加约5倍。大约比相当的点印迹杂交慢两个数量级，但之后则是假一级反应所表现出的按指数规律渐渐降低的函数关系。对于抗坏血酸盐诱导的细胞，具有相等计数的非同源探针的本底水平，开始时(1.5小时)为特异信号的13%，结束时(42小时)为特异信号的3%。大溶液体积和细胞在杂交前没有脱水可以解释在这些条件下因探针缓慢进入细胞而呈现的较慢动力学特征。这种差异似乎并不是由于探针大小不同，因其中不同大小的探针(0.2至2kb)均可与PAT细胞很好地杂交。这种实验数据是与原位杂交反应中的限速步骤相符的，此时探针通过有限数目的孔隙进入细胞。
更为重要的是，使用有相对高浓度的探针与较长的保温时间，在原位杂交之探针的量反映了细胞中mRNA的水平。下述实施例中，用放射自显影法进行检测并借助个别细胞上显现的银颗粒密度反映溶胶原mRNA的相对浓度，而且这一浓度是随细胞密度按数量级变化的。
这一技术要比以前用于检测培养物对溶胶原基因表达之影响的其他技术更为特异、准确和敏感。此外，它还可以观察在同一培养皿上不同细胞密度的不同影响。
D、CDS的序列分析使用477A型Applied Biosystems脉冲液相蛋白质测序仪，对从超滤滤液中回收并分离的多达100pmole的纯化CDS(根据丙烯酰胺凝胶上的染色强度估计的)进行自动Edman降解，进而分析其氨基酸序列。
N末端序列分析结果可能不足以支持克隆CDScDNA的工作。例如，可能阻断CDS，或者在N末端进行修饰，或者说N末端序列可能没显示出有利于产生寡核苷酸探针的区域。在这些情况下，经用蛋白酶消化CDS(如参见Horlow，E.and Lane，D.，Antibodies A La-boratory Manual，Cold Spring Harbor.Press，1989)并纯化肽片段，以产生另外的序列信息。此时须用真空离心法将蛋白质浓缩到5μl，然后消化之。使用BrownleeRP18小孔柱和专门为纯化微微摩尔量样品而设计的130A型Applied Biosystems液相层析仪，以反相高压液相层析法纯化用于序列分析的蛋白酶水解片段。
根据计算机检索Protein Identification Resource of the NBRF及Swiss蛋白质数据库的结果，将如此得到的序列资料与已知的蛋白质序列进行比较，以确定它们的新颖性以及与其他蛋白质序列的关系。
E.cDNA库的筛选与CDS编码的DNA的分子克隆可以使用初级鸟腱细胞培养物制备cDNA库，然后对cDNA库进行编码CDS特异性多肽的特定DNA序列筛选。制备cDNA库的技术是常用的，在实验室手册中已有描述，并且是本领域专业人员已知的。
Maniatis，T.等人详细描述了这些cDNA库的制备(Molecular Cloning，(1982)CSHL Press)。可按上文Maniatis所述的方法，将cDNA片段插入λ噬菌载体例如λgt10或λgt11中。
筛选cDNA库的方法也是本领域专业人员公知的。采用DNAstar方案(Madison WI)对CDS的氨基酸序列进行分析，以鉴定构建寡核苷酸探针的最佳区域。对以借助氨基磷酸脂方法，使用DNA合成仪(380AApplied Biosystems Inc.Forter City CA)合成重复寡核苷酸探针。在Sephades G-50柱上纯化寡核苷酸并在-20℃下贮存之。利用T4多核苷酸激酶，用τ-[32P]ATP(E.I.du Pont de Nemours & Co.，Inc.，Boston，MA)对重复探针进行5′-标记。对每个库使用高达106个个别的噬菌斑，筛选具有重复寡核苷酸探针的库。制备含有噬菌体的复制尼龙膜，并且在50℃下在5×SSPE(0.9M Nacl.50mM NH2PO4，5mM EDTA.pH7.4)、0.2%SDS和0.005%变性鲑精子DNA中预先杂交2小时，每袋每50ml预先杂交液用8片滤纸。在新鲜的杂交液中，在适于变性探针混合物的温度下，使膜与每ml约1ng标记的探针杂交过夜。在室温下，在每40片滤膜1升的5×SSPE中将膜洗涤45分钟，然后在50℃新鲜缓冲液中洗涤1分钟，稍微风干，并对带加强屏的Kodak-XAR-5胶片，在-70℃曝光72小时。
分析后，通过在5×SSPE中70℃保温10分钟使滤纸上的杂交标记剥离，随后在相同的条件下用第二探针杂交。对每个探针均重复此步骤。从纯化的DNA库和噬菌斑中选择与探针交杂的重组体克隆。
然后纯化重组体噬菌体DNA，并且用合适的限制性核酸内切酯消化，以产生扩增的cDNA插入子。然后将插入子连接在MBmp系列噬菌体中，并且利用Sanger所述的“双脱氧”方法分析顺序(Biggin.M.D.etal.，Proc.Nat.Acad.Sci.(1983)803963)。根据cDNA的大小，有必要限制克隆并将各片段再克隆到M13中。如果cDNA克隆不完全，需要重复筛选具有部分cDNA的库。然后以已知的GenBank database中的序列作为对照，对完整的CDScDNA序列进行比较。使用DNAstar进行核苷酸和多肽分析以及序列比较。
然后可以将所选择的编码CDS的cDNA插入子结合到表达体系中。将cDNA可操作地连接到异源对照序列上，形成表达载体。所选择的对照序列在功能上是与引入了表达载体的重组体天细胞相容的。这些方法是本领域专业人员已知的，并已描述于Maniatis的上述文献中。
可以在原核生物或真核生物体系中表达。最常用的是以大肠杆菌(E.coli)的各种菌株为代表的原核生物体。但是也可使用其他微生物菌株，例如杆菌(如枯草杆菌)、各种假单胞菌或其他细菌菌株。在这些原核生物体系中，可使用含有从与宿主相容菌种获得之复制位点与对照序列的质粒载体。例如，通常按照Bolivar等人所述(Gene(1977)295)方法，利用pBR322的衍生物-一种从大肠杆菌获得的质粒-转化大肠杆菌。
那些如上文定义的、包括具有使转录开始之启动子、具有或没有操纵基因、以及核糖体结合位点序列之操纵子的常用原核生物对照序列可包含通常使用的启动子，如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖酶(lac)启动子系统(Chang等人，Nature(1977)1981056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucleic acid Res(1980)84057)、λ衍生的PL启动子以及N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，Nature(1981)292128)。任何与原核生物相容的启动子系统均可使用。
可在真核生物宿主中使用的表达体系包括从适当真核生物基因中获得的启动。可在酵母中使用的一类启动子包括合成糖酵解酶(包括合成3-磷酸甘油酸激酶)的启动子(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.(1980)255207)。其他启动子包括那些来源于烯醇酶基因(Holland，M.J.等人，J.Biol.Chem.(1981)2561385)或从YEpB获得之Leu2基因(Broach，J.等人，Gene(1978)8121)的启动子。
适用的哺乳动物启动子包括金属硫因启动子、来源于SV40的早期和晚期启动子(Flers等人，Nature(1978)273113)，或者其他病毒启动子例如那些从多瘤病毒、腺病毒Ⅱ、牛乳头状瘤病毒或还原病毒(retroviruses)得到的启动子。也可以使用合适的病毒和哺乳动物强化因子。如果用植物细胞作为表达体系，那么蓝曙红(nopaline)合成启动子是合适的(Depicker，A.等人，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)。
使用本领域已知的标准连接和限制技术，从可操作地连接到CDS序列上的外源控制元件来构建表达体系。可按照所需的形式对分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸进行裂解、修整及重新连接。
其他表达CDS编码cDNA的体系包括昆虫细胞以及适于在这些细胞中使用的载体。这些体系是本领域已知的，如包括从杆状病毒Auto-grapha californica核多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达转移载体，它是非辅助体依赖性的病毒表达载体。从该体系获得的表达载体通常使用强病毒多面体基因启动子，以驱动异源基因的表达。目前最常用的将外源基因引入AcNPV中的转移载体是pAc373(图70)。本领域专业人员已知的许多其他载体也已被用于改善表达。例如，这些载体包括pVL985(见Luckow and Sammers(1989))等。
将异源DNA引入杆状病毒内预期位点的方法是本领域已知的(参见Summers and Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555;Ju etal.(1987);Smith etal.(1983);Luckow and Summers(1989))。例如，可以通过同源重组将外来DNA插入基因例如多面体基因中;也可以在所需杆状病毒中造成一个限制性酶切点，然后将外来DNA插入其中。所插入的序列可以是那些编码所有蛋白质或其可变片段的序列。
转移后修饰信号，例如肽裂解信号，蛋白水解裂解信号以及磷酸化信号等都是可以被昆虫细胞识别的。分泌与核累积所需的信号，似乎也存在于无脊椎动物细胞和脊椎动物细胞中。
来源于脊椎动物细胞的信号序列(在无脊椎动物细胞中也有效)是本领域已知的，例如包括人白细胞介素-2信号(ILZ3)，它是向细胞外运输，被昆虫细胞识别并且适当除去的信号。
F.哺乳动物CDS DNA基因组序列的分析从鸡的基因组库(由clontech出售，Palo Alto.California)或各种哺乳动物的基因组库(通常以噬菌体形式由ATCC或者商业途径得到的CDS编码基因)。例如，可以利用在Charon 4A噬菌体中的人胎肝细胞基因组库(ATCC 37333)。该库含有106个非依赖性重组体，其中插入段大小为15-20R6，并且可用基本上如前面所述的cDNA对其进行筛选。
然后使噬菌体吸附于复制的8×8cm尼龙滤膜上。在5×SSPE、50%甲酰胺、5×Denhardt′s溶液、0.5%SDS和0.005%变性鲑精子DNA中42℃预先杂交2小时，每50ml预杂交液用8片滤膜。滤膜与每ml新鲜预杂交液(含有10%硫酸葡聚糖和2×Denhardt′s溶液)约1.0ng标记的鸟CDS DNA于42℃杂交过液。
可以调节杂交溶液的严紧程度以解释鸟和哺乳动物CDS多肽之间不同源性。可通过提高盐的浓度和/或降低杂交温度来降低严紧性，以增加对杂交中之错配的耐受性。在功能性同源多肽的不同区域内，非同源性的程度将是不同的。通常，功能性同源活性的位点将证明最大程度的同源性。可基于对鸟CDS多肽的结构分析来推测这些位点，并可使用几个编码CDS多肽之各区域的探针，使高保守的定位区最佳化。
用α32P dCTD标记鸟CDS DNA并用SephadexG-50层析法纯化之。在每40片滤膜1升2×SSPE和0.2%SDS室温洗涤滤膜2次，然后在0.1×SSPE的0.2%SDS中50℃洗涤2次各15分钟，稍加气干后使滤膜对带有加强屏的Kodak XAR-5胶片-70℃下曝光48小时。
从DNA库和纯化的噬菌斑中选择阳性克隆。利用从cDNA衍生的各种探针检测此基因组克隆内是否含有基因的完整拷贝。然后提取重组体噬菌体DNA、纯化并进行限制性消化-上述所有方法都是本领域专业人员熟知的。将限制性片段的Southern印迹与CDS cDNA杂交，以鉴定含有CDS基因的片段。然后分离这些片段并测定其顺序。根据这一资料制成限制性图，并鉴定时该基因的内含子。
G.抗CDS抗体的制备利用两种方法产生CDS抗体，并且这两种方法都可以用于产生多克隆或单克隆抗体。一种方法是，利用标准方法获得高达75μg的纯化的变性CDS，并用于免疫小鼠;免疫原用量为25μg。为了筛选杂交瘤，可对溶于0.1%TFA和乙腈中的变性的CDS进行放射性碘标记，并用于筛选那些产生抗体的小鼠B细胞杂交瘤。该方法只需要少量的CDS，例如对于标记和筛选几千克隆，20μg便足以够用。
第二种方法是，分析根据基因顺序推测之CDS的氨基酸序列，以确定高免疫原性区域合成相应的多肽，并用合适的免疫方法诱导抗体产生。例如按照Ausubel，F.M.等人所述方法进行分析，以选择适当的抗原决定族(Carrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Vol.2，Sec.Ⅳ，ppll.14.1，1989)。最佳选择通常是C末端、N末端和多肽的内部区域，当分子处于自然构型时它很可能暴露于外环境中(这种测定法是依据位点的疏水性)。一般可使用Applied Biosystems肽合成仪(Model 431A)，利用Fmoc化学并通过与间马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)反应(见Ausubel等人的上文，在11.5.1页)以偶联到钥孔
血兰蛋白(KLH;Sigma)上，来合成长约15个残基的选择的肽。可在肽的N末端引入半胱氨酸，使它与KLH偶联。用加在弗氏完全佐剂中的肽-KLH复合物免疫兔，并对所得的抗血清进行抗肽活性试验，例如通过使肽与塑料结合、用0.1%BSA封闭、与抗血清反应、洗涤并与放射性碘标记的亲合纯化的特异性羊抗兔IgG反应来完来该试验。
也可以使用标准技术制备和筛选杂交瘤。用放射性碘标记的CDS筛选杂化体，以识别产生单克隆抗体的杂交细胞。典型的方法是，用10μg/ml的亲合纯化的特异性免抗小鼠(或者合适的抗体IgG)抗体包被平板(Becton-Dickinson，Palo Alto，CA)各孔的端部。用0.1%BSA封闭已包被的端部、洗涤并暴露于杂交瘤的上清液。保温后，使端部与放射标记的蛋白质(1ng/ml)接触。产生抗体的克隆将结合一定量的放射活性，这个量可在本底基础上检测出来。使这种克隆扩大并以0.3细胞/孔浓度进行2次克隆。将克隆的杂交瘤注射至原试验小鼠腹腔内，以产生腹水，通过对蛋白A的亲合层析从腹水液中纯化单克隆抗体。
实施例1.PAT细胞在培养中的生长特性PAT细胞能迅速适应细胞培养环境，并且作为主要培养物在培养物中显示出所期望的成纤维细胞的正常表型。PAT细胞对细胞增殖表现出两种通常的细胞密度效应、生长所需的细胞密度最小，且在较高细胞密度下有生长抑制作用。
通过在PAT细胞培养物中建立细胞密度梯度，可以同时观察到这两种细胞密度反应。该方法是将细胞先接种于一个克隆环(6mm直径，在60mm培养皿中)内，当细胞附着后移动环。这种方法的优点是培养基对细胞的比率大(于是条件影响减至最小)，同时在培养皿中产生细胞密度梯度。
PAT细胞对于这种状态显示出独特的反应。它们显示出生长缺乏细胞区域中的能力是有限的一只是将初始面积从直径6mm扩大为7mm。相反，在最初接种区域中的细胞可迅速生长直到会合。此时，处在低细胞密度边缘的细胞即开始死亡。这一点通过细胞的环形形态学得以证实，并可以根据锥虫蓝染色以得到进一步证实。
这种效应不是由培养基中的毒性引起的。如果用细胞刮器除去细胞环的一半，新边缘处的细胞就会长出并形成新的低密度边缘，甚至于当保留在原始边缘上的细胞将要死亡时。同样地，如果只从细胞环上除去一个窄沟，则细胞便能够填充在除新旧边缘结合处的沟内。最低细胞密度点朝向环中心有一个明显的切迹。这就证明了只要存在最低细胞密度，PAT细胞即可在细胞生长培养基中调整局部微环境。
实施例2.细胞密度对溶胶原基因表达的影响以前，由于所用分析方法的不敏感性，要求用于分析胶原途径中细胞密度改变的细胞平均值在105个细胞以上。借助对溶胶原mRNA含量的原位杂交分析，可在细胞水平上分析细胞密度对细胞的影响，并且可在同一培养基内观察到不同细胞密度的影响。
按照实施例1所述方法，将PAT细胞初始接种于一个放置在标准60mm组织培养皿中间的6mm直径克隆环内。1小时后，当细胞附着在培养皿上时移去克隆环。将细胞培养5天，此时它们已在原始环中间会合。PAT细胞显示出生长到缺乏细胞的环边缘空间内的能力有限，因此到第5天末时，细胞环只扩展至7mm。这种扩展足以建立起低细胞密度边缘，而同时环中间的细胞呈现高细胞密度。
细胞密度分布引起了溶胶原mRNA水平的很大变化。通过其上大量暴露的银颗粒证明，那些处于环中央会合密度的细胞含有高水平的溶胶原mRNA。相反，在低密度边缘处的细胞则具有低水平的溶胶原mRNA。当通过将细胞接种于倾斜的组织培养瓶中产生细胞密度梯度时，可得到非常相似的结果。
在那些实验中，最初用克隆环限制的细胞处具有很高的培养基体积对细胞数比率，而且细胞还保持对细胞密度的反应。这与简单模型是不一致的，在简单模型中CDS作为稳定因子蓄积于培养基中，并且因为CDS的作用将被冲淡而认为它是很容易扩散的。
实施例3.会合细胞表达分化功能但是保留细胞分裂能力尽管PAT细胞培养物有形态学均匀性，但是在会合族的外周所发现的细胞可能是个独特的亚群。在这种情况下，如上所述的溶胶原表达的部分梯度可能是由产生较低量溶胶原的增殖细胞类型的选择造成的。
为了进行这一试验，将PAT细胞初始接种于如上所述的克隆环内，并使其生长成会合的细胞环。使用细胞刮器的边缘通过形成交叉细胞环面(约6mm)切下2个1.7mm的垂直条。
这个距离很小，足以使两侧生长出的细胞在中间相遇并完全填满缝隙。原位杂交表明，向前迁移部分的细胞随着细胞密度增加产生了高浓度的溶胶原。相反，当刮去细胞环的一半时，迁移到空余空间内的PAT细胞在低细胞密度边缘处显示出低的溶胶原表达水平。
因此，在向前生长的各个细胞中溶胶原mRNA水平的改变不是由细胞选择引起的，而是由细胞密度效应引起的。
实施例4.细胞层中CDS的蓄积CDS不因培养基体积而改变的事实表明，信号分子在细胞层中并可能在细胞外基层(ECM)中蓄积。这一假设的一种推测是，一但信号蓄积，它在细胞层中或在ECM中的浓度便与细胞的连续存在无关。
有关这一概念的一个试验是刮去部分细胞族，只是这种方法须能抑制细胞迁移至已除去了ECM的区域中。
为了完成这一目的，将细胞初始接种于克隆环中，并使其生长成为融合的环。然后用手术刀片刮去一半细胞环。这样就使塑料皿的表面变得粗糙，并防止细胞迁移出去。48小时后(溶胶原mRNA略微超过两个半寿期)，粗糙边缘的细胞保持了高溶胶原mRNA水平。正如集中于粗糙边缘接合处和环的自然边缘处(在这里溶胶原mRNA合成已呈现低水平)的细胞显示非常低水平的溶胶原mRNA合成这一事实所证明的，粗糙边缘本身不刺激溶胶原合成。
在刮去的边缘处的细胞连续保持了高水平的溶胶原mRNA，尽管只有一半细胞紧靠它们附近。这与结合在ECM上的因子是一致的。
实施例5.轻轻搅拌从ECM中除去CDS通过搅拌PAT细胞单分子层上面的培养基并监测对胶原表达和细胞增殖的影响，可以证明CDS是ECM的松散结合组分。有人已经证实，培养物中细胞上培养基的层流可以影响生长因子(Dunn，G.A.& G.M.Ireland，Nature(1984)31263-65)。
在观测对胶原表达的影响时，使用了两个条件一个条件是细胞初始接种于一个克隆环中，第二个条件是将细胞均匀地接种于整个平皿上。这两个条件中培养基体积对细胞数目的比率完全不同。使细胞培养物39℃生长到会合，然后将其放置在旋转平台上两天(对照平皿不振荡)。
搅拌的影响取决于培养基对细胞的比率。在细胞均匀接种于平皿中的情况下，振荡会合的培养物没有影响。相反，在细胞初始接种于克隆环中的情况下，振荡会合的培养物引起溶胶原mRNA水平降低，并且变成细胞密度非依赖性的。
这与模型是一致的，因此可知CDS是细胞外环境的松散结合成分，并且振荡使CDS释放至大体积的培养基中，通过稀释基本上从细胞中将其除去，并且抑制溶胶原mRNA的表达。相反，振荡融合平皿改为较小体积的培养基将防止CDS稀释(在比率上约改变2个数量级)，导致大量CDS与细胞层重新结合，并且很少或没有细胞效应。
重复这些实验，但不是找出培养基对细胞的比率对溶胶原合成的影响，而是利用本领域专业人员已知的测量生长的3H-胸苷掺入技术分析细胞增殖情况。得到相似的结果。在将细胞接种于克隆环中并振摇24小时的情况下，在边缘和会合的中心处标记的胞核数目显著增加。完全相反的是，均匀接种的培养皿则显示振荡培养基只有很小的影响。
在非振摇的条件下，未观察到处于会合密度的细胞是否仅在几个mm或在整个培养皿中存在这一细胞密度。在环的会合中心，细胞的反应是减少生长并提高了溶胶原表达，而不因大的培养基体积而改变之。如前面溶胶原产生情况所显示的，在约1mm距离内所有问题都涉及2维细胞密度。
振荡使得有效环境转变为3维空间。如果存在足够的细胞(5×105/ml与5×102/ml相比)，振荡培养基不会改变CDS的影响，这一观察表明可以用CDS使培养基达到饱和点，这时CDS与细胞层的重新结合的频率可阻止对生物学效应的稀释。
实施例6.释放到培养基中之CDS的生物学活性只根据实施例5所示的结果，即可以预期CDS的生物学活性表现为PAT细胞增殖的抑制因子和溶胶原基因表达的启动子。但是，从搅拌之PAT细胞的培养基中回收的CDS的生物活性则表现为生长刺激作用。
在能覆盖培养皿的最小量培养基(1ml)中搅拌PAT细胞的会合培养物，以使CDS释放到培养基中。该基质用于初始接种在克隆环中的细胞。然后将5ml该条件培养基用于试验细胞，这样使得对每一个细胞都能得到的CDS的量增加约500倍。在加入条件培养基前使试验细胞生长5天，然后再生长两天。接受条件培养基之PAT细胞的生长并未受到抑制，相反，它们却明显地刺激了它们的分裂。在较高浓度下，甚至于处于会合密度的细胞都可能被诱导分裂(详见下文所述)相反，对照平皿中细胞环的边缘处则显示有大量细胞死亡。
因此，在均匀会合的培养物的情况下，振荡可放出刺激均质培养物增殖的因子，但是在初始培养物中存在该因子则抑制细胞生长。
可以假定，生长抑制因子仍然存在于细胞层中以对抗生长刺激剂的作用。但是，这与从振荡培养皿中部细胞“岛”上方培养基(这里有一个大的基质对细胞比率)所得的结果不一致。在这种情况下，搅拌培养基可引起细胞生长。实际上，这些实验支持了细胞层中CDS的生物学活性可能不同于培养基中所观察到的CDS活性这一概念。目前还不知道细胞层中CDS之生物学活性随细胞密度增加而改变的机理。
实施例7 CDS的物理性质作为生长刺激剂，分析CDS活性存在，并根据这一活性允许其特征化并纯化之。已经发现CDS对于硫酸铵沉淀作用是稳定的，并可以将其浓缩100倍以上。在各种条件下以此浓度进行小量试验，然后稀释到培养基中，以试验其在1x浓度下活性的保留程度。
CDS在处于低pH环境(50mM乙酸钠，pH5.2，60分钟)、二硫键还原(10mMDTT，30分钟)及加热(90℃，10分钟)条件下，其生物活性至少保留75%。它在培养基或PBS中4℃保存数月仍是稳定的。另一方面，当暴露于Tris离子(50mMTris pH7.5，60分钟)时可使CDS生物学活性丢失90%以上，而Tris碱(50mMTris，pH8.8，60分钟)对其影响则很小(保留90%以上的生物学活性)。
实施例8 CDS的蛋白水解敏感性试验CDS对蛋白酶K(P9290-Sigma)和链霉蛋白酶(P4531)以及胰蛋白酶(T-8386-Sigma)水解消化的敏感性。将酶结合到琼脂糖或丙烯酰胺上使用，以便于反应后容易除去酶。在基本培养基中将结合的酶(1个单位)洗涤2次，(30分钟，在摇动平台上)。然后将含有1xCDS的培养基在39℃下振荡处理2小时，在台式超离心机中离心并过滤除菌。以同样方法处理基本培养基并用作对照。向各样品中加入血清和抗坏血酸盐，然后按上述方法对如此处理的CDS进行活性试验。
CDS分子对胰蛋白酶不敏感(保留75%以上的生物学活性)，但对另外两种蛋白酶都很敏感(只保留不到10%的生物学活性)。对CDS的蛋白酶消化也导致了对所有被试细胞的毒性反应。在反复冻融的CDS样品中发现有相似的毒性。
实施例9.CDS的纯化由于CDS对几种分裂聚集处理是稳定的，因此针对这些处理(加热，pH以及DTT处理)进行试验，以测定它们在Bio-Gel P-30柱上是否改变了CDS的层析性质。
只是加入DTT有显著影响。处理后，多数CDS活性被洗脱下来，不是在流通中，而是刚好在外水体积后的部分，这表明有些CDS渗透到了凝胶孔隙中(图1)。图1中，连续箭号是指DTT处理前含CDS活性的部分，破折箭号是指DTT处理后含CDS活性的部分。这证明CDS的活性成分在搅拌细胞培养物的培养基中是以聚集并可能是多聚体形式发现的25-35KD的分子。用DTT处理后，单体25-35KD分子保留了CDS活性。利用这一资料发展纯化方法。经硫酸铵沉淀浓缩搅拌之培养物的培养基(当体积小例如回收放射性标记的CDS时可省略这一步骤)，并用30KD分离膜超滤上述浓缩物。在大于30KD的部分中保留了所有活性。将滞留物用10mM DTT处理30分钟，并用30KD膜再次超滤。此时约有一半的活性通过了滤膜。银染色后，流通部分的活性(相当于5ml条件培养基)在SDS-PAGE上未显示出带。然而，该材料保留了其生物学活性。
当使用来源于用高浓度放射标记的氨基酸标记过夜的细胞的条件培养基时，进行上述同样的分级分离、在SDS-PAGE上电泳、及荧光照相，可观测到一条单一扩散带，其表现分子量约为30KD(图2)。在图2中，左边的泳道装载的是DTT处理之30KD超滤的滞留物，右侧通道装载的是流通部分。
权利要求
1.无细胞蛋白质细胞密度信号分子(CDS)，该分子最初能够刺激培养物中胚腱细胞的增殖，其后则促进分化基因表达。
2.根据权利要求1的CDS，其中CDS实质上是已被纯化的。
3.根据权利要求1的CDS，其中所表达的分化基因是溶胶原基因。
4.由培养物中胚腱细胞分泌并从其中分离的蛋白质SDS，它能够暂时刺激胶原蛋白生成细胞的增殖，其后则促进溶胶原基因表达。
5.根据权利要求4的CDS，其中所说的胚细胞来源于鸡。
6.根据权利要求5的CDS，其中所说的CDS表现有下列特性a)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，相对迁移率从至少约25KD至最多约35KD。b)热稳定性达到90℃;c)对胰蛋白酶的蛋白水解消化作用不敏感;d)对蛋白酶K或链霉蛋白酶的蛋白水解消化作用敏感。
7.根据权利要求4的CDS，其中所说的胚细胞来源于除鸡以外的动物，其中所说的CDS表现有基本上相似的功能同源性，且其中所说CDS的氨基酸序列与鸡CDS的氨基酸序列相比至少有25%同源性。
8.根据权利要求7的CDS，其中所说的细胞来源于哺乳动物胚组织。
9.产生基本上纯化的蛋白质CDS的方法，该方法包括a)以高密度细胞培养物提供初级腱细胞;b)提供培养条件，包括未添加其他成分的培养基，细胞在其中分泌包括CDS的多肽;c)搅动培养物以增加培养基中CDS的产生量;d)收集含CDS的未添加其他成分的培养基;e)纯化CDS。
10.根据权利要求9的方法，其中所说的纯化是经下述步骤完成的a)首先用30KD超滤膜超滤所说的含CDS的培养基，以得到以分子复合物形式存在的含CDS生物学活性的滞留物，这样所说的复合物便具有大于30KD的表现分子量;b)用二硫键裂解剂使步骤a的滞留物变性，破坏所说的复合物以得到CDS，所说的CDS具有大约25KD至35KD的分子量;c)用30KD超滤膜第二次超滤步骤b的产物;以及d)收集含有纯化之CDS的滤出物。
11.根据权利要求9的方法，其中细胞得自于胚鸡腱。
12.抗体组合物，其中基本多肽特异性是针对权利要求6的CDS的。
13.根据权利要求12的组合物，其中抗体是单克隆的。
14.对权利要求8的CDS特异的抗体组合物。
15.根据权利要求14的组合物，其中抗体是单克隆的。
16.治疗结缔组织损伤之个体的方法，所说的方法包括在结缔组织损伤部位给所说的个体使用刺激结缔组织损伤修复有效量的权利要求8的CDS。
17.根据权利要求16的方法，其中组织是腱组织。
18.按权利要求9的方法产生的蛋白质CDS。
19.按权利要求10的方法产生的蛋白质CDS。
全文摘要
本文公开了新的蛋白质细胞密度信号分子(CDS)，这种蛋白质分子是由培养的成纤维细胞特别是腱细胞分泌的，并提供了一种细胞自身调节其增殖和表达分化功能的手段。CDS和识别它们的抗体对于发展诊断和治疗结缔组织，特别是腱损伤及疾病是重要的。本文还公开了产生和使用CDS的方法。
文档编号A61K38/00GK1061607SQ9110929
公开日1992年6月3日 申请日期1991年8月21日 优先权日1990年8月21日
发明者施瓦茨，理查特I. 申请人:劳伦斯-伯达利实验室